章必成[1]2001年在《p38MAPK的信号转导对大鼠胶质瘤细胞C6生长周期调控的初步研究》文中指出丝裂素活化的蛋白激酶（MAPK）级联是信号从细胞外转导到细胞核内的重要传递者。细胞运用这一级联激活细胞内分子，参与信号转导，从而参加和影响多种生理病理过程。p38MAPK为近年来发现的一类新的MAPK亚族，参与了细胞的存活、分化和凋亡等过程。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以激活p38MAPK通路，但活化后的p38MAPK在细胞凋亡中的作用还不明确。同时，p38MAPK可以上调TNF-α的表达，进而诱导细胞凋亡。胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，其浸润性生长、侵袭性强、早期转移和易复发的特点，可能与肿瘤细胞信号转导异常有关。p38MAPK通路在胶质瘤发生发展过程中的作用及其与TNF-α共同调控胶质瘤生长周期的作用尚不清楚。 本研究的目的：（1）研究p38MAPK基因转染C6细胞后对其生长状态和生长周期的影响；（2）研究TNF-α对C6细胞增殖的抑制作用和对p38MAPK表达的影响；（3）初步探讨p38MAPK影响C6细胞生长周期的作用机制。 方法：（1）利用脂质体介导法将p38MAPK基因导入C6细胞中，用免疫细胞化学染色和Western-blot检测其在转染前后的表达情况，用苏木精-伊红（HE）染色、透射电镜（TEM）和流式细胞仪等方法研究其对细 第四军医大学硕土学位论文 摘要 胞形态和生长周期的影响；（2）应用MTT法研究经M－a处理的C6细 胞的增殖活性，采用TEM和流式细胞仪观察是否发生凋亡，应用免疫细 胞化学染色和 Western七lot检测 p38MAPK表达；臼）用酶连免疫吸附实 验（ELISA）检测转染p38MAPK前后细胞培养液中sM咀水平的变化， 用流式细胞仪检测膜TNF．a和肿瘤坏死因子受体1（MAI）水平的变化。 结果：门）转染休MV 5巾SMAJ，K组P38 MM APAPK蛋白表达阳性，细 胞形态发生变化，贴壁性降低，出现大量凋亡细胞；u）TN’F叱 X iU几） 对C6细胞增殖的抑制率为4375％，TEM下可见凋亡细胞，流式细胞仪 检测凋亡率为 37．5％，免疫细胞化学染色和 Western．blot 分析显示 网SMAPK表达阳性：（）转染／MV 5个8＊AP K组细胞培养液中＊TN卜 a水平明显升高，膜TNF．a水平无明显变化，膜TN’－－AI表达升高。 结论：门）转染pSMAPK基因可诱导o细胞凋亡；u）TN’F－。能 诱导 C6细胞凋亡和 p38M”K表达。p38M”K的活化可能与 C6细胞凋 亡有关；u）…SMAPK可能通过上调引下压、和膜TNF m水平而诱导C6 细胞凋亡。
陈秋铃[2]2013年在《Nodosin对恶性胶质瘤的作用及其机制研究》文中指出目的：恶性胶质瘤,是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,已成为危害人类健康的重要脑部疾病。化疗是其临床综合治疗的重要手段之一,是治疗晚期恶性肿瘤以及防止复发必不可少的。然而,对于占恶性肿瘤90%以上的实体瘤,化疗尚未能取得满意的效果。且化疗药物对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差,对人体往往产生一定的毒副作用。因此,寻找高效、特异和低毒的抗肿瘤药物是肿瘤防治研究中的重要课题。Nodosin是从唇形科香茶菜属植物中提取出来的一种五环二萜类化合物,来源广泛,具有抑菌、抗炎等作用。本课题以恶性胶质瘤细胞株C6、U87和C6移植瘤模型为研究对象,研究nodosin对脑胶质瘤的抑制作用,并探讨其作用机制,为其临床抗胶质瘤的研究提供有力的实验依据和理论基础,为进一步开发新型抗胶质瘤药物扩展新视野。方法：采用倒置显微镜对胶质瘤细胞进行形态学观察；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生存率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞毒性,BrdU检测法检测细胞增殖情况；应用流式细胞仪技术研究nodosin对细胞周期的影响；采用Hoechst33342染色法、原位末端标记技术(TUNEL)法观察nodosin对细胞凋亡的影响。采用western blot方法对细胞周期相关蛋白cyclin B1和cdc2和细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bak及相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平进行检测；以及通过对caspase-3/7、caspase-8、caspase-9活性检测和细胞线粒体膜电位的测定(JC-1染色),来研究nodosin抑制胶质瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制。同时,应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,研究nodosin对细胞凋亡的影响。选择划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验评价nodosin对胶质瘤细胞的侵袭迁移能力；应用激光共聚焦扫描显微镜对胶质瘤细胞骨架进行观察,并通过western blot方法检测MMP-9的蛋白含量来研究nodosin对胶质瘤细胞的迁移与侵袭的机理。通过建立大鼠恶性胶质瘤细胞株C6细胞皮下移植瘤模型,探讨在在体条件下nodosin对肿瘤体积、肿瘤重量等的影响,并通过HE染色观察肿瘤病理组织学的改变。成果：MTT结果显示nodosin对胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且呈现明显的量效、时效关系,处理细胞24h后,对大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U87细胞的IC50分别为：25.81μM、11.05μM;而nodosin在24h时对人正常胶质细胞HEB及大鼠原代胶质细胞的存活率影响不大,其IC50分别为：32.06μM、46.69μM。LDH检测发现,nodosin对C6及U87没有细胞毒作用。这些结果表明,nodosin的抗肿瘤作用具有较强的细胞选择性,其抗肿瘤作用机制可能与细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导和侵袭转移抑制有关。BrdU检测法和流式细胞术检测结果显示,nodosin对C6及U87胶质瘤细胞具有较好的增殖抑制作用,通过使胶质瘤细胞组滞于G2/M期的机制,抑制胶质瘤细胞进入下一增殖周期,从而抑制胶质痈细胞增殖。Western blot法实验显示,5μM、10μM、15μM的nodosin处理C6、U87细胞24h后,cyclinBl和cdc2蛋白表达水平下调。细胞形态学观察、Hoechst33342染色法染色以及原位末端标记技术(TUNEL)检测结果显示,nodosin能诱导胶质瘤细胞的凋亡,作用胶质瘤细胞24h后,细胞形态发生改变,细胞数量与密度减少,随着剂量增加,培养基中悬浮的死亡细胞增多,出现染色质边集,细胞核碎片化,凋亡小体形成。Caspase活性检测发现,nodosin能够增加C6、U87细胞中caspase-3/7、caspase-8、caspase-9的活性,并成一定的剂量依赖关系,提示着我们,nodosin诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,既通过死亡受体通路,亦通过线粒体通路。Western blot法结果显示,nodosin能够下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达水平,上调Bak蛋白的表达水平,Bax蛋白水平不变；同时,能抑制P38MAPK、 PI3K/Akt和PKC信号通路；应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,发现LiCl可阻断nodosin引起的细胞凋亡。划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验结果显示,nodosin能够剂量依赖性地阻止胶质瘤细胞的迁移与侵袭；cofocal结果发现,nodosin可抑制微管聚集；western blot分析结果显示,5、10和15μM的nodosin能以剂量依赖方式减少MMP-9蛋白表达水平。提示,nodosin对胶质瘤细胞的迁移侵袭抑制机制与其促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白表达水平相关。接种胶质瘤C6细胞后第3d,对照组和nodosin组的肿瘤生长没有明显差异。接种后第4d到第12d,对照组的肿瘤生长快速,nodosin组的肿瘤生长缓慢,差异有显着性意义(P<0.05)；裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积增长率均明显小于对照组。HE染色显示,对照组C6胶质瘤细胞丰富密集,坏死很少,nodosin组C6胶质瘤细胞生长密度低于对照组,并可见到细胞体积变小,核固缩深染的凋亡形态学改变,部分区域出现液化坏死。结论：(1)首次在胶质瘤细胞模型上研究nodosin抗恶性胶质瘤的作用,发现nodosin对胶质瘤细胞的生长具有明显的选择性抑制作用；(2) Nodosin对胶质瘤细胞具有细胞增殖抑制作用,这种作用通过阻滞细胞周期于G2/M期以及下调cyclinBl和cdc2蛋白水平来实现；(3) Nodosin具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,其机制为：nodosin通过增加Caspase-3/7、Caspase-8、Caspase-9活性、降低线粒体膜电位、下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白的表达水平以及上调Bak蛋白的表达水平来诱导胶质瘤细胞凋亡；nodosin能抑制P38MAPK、Akt和PKC等相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平；GSK3β在nodosin诱导细胞凋亡中是必需的。(4) Nodosin能通过促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白水平来抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭。(5)首次在体内实验中,发现nodosin能抑制裸鼠内胶质瘤的肿瘤生长及减少肿瘤重量,具有体内抗恶性胶质瘤作用。
姚轶群[3]2007年在《P38MAPK在榄香烯致鼠胶质瘤C6细胞增殖抑制和周期阻滞中的作用》文中研究说明胶质瘤,作为最常见的恶性脑肿瘤,具有高度侵袭性,对药物治疗极不敏感,也很难被完全切除。胶质瘤可以发生在任何年龄,即使经手术及放化疗,平均生存期也很短。多年来,对胶质瘤的治疗研究仍没有大的进展,目前仍以缓解症状为主。榄香烯是从中药莪术中提取的由β-,γ-和δ-榄香烯组成的复合物,其中β-榄香烯是主要成分。榄香烯具有抗肿瘤作用,已在脑肿瘤、肝癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤中被证实。近来有报道榄香烯具有抗胶质瘤细胞系增殖的作用,但其具体机制仍不明了。细胞对胞外刺激的反应受多个胞内信号通路的调节。MAPK信号通路既是其中重要的部分,已被证实在胶质瘤的发生中调节细胞的增殖、分散和转移。P38 MAPK和JNK信号通路是其中调节细胞增殖、分化和凋亡的重要通路。大量证据表明p38 MAPK介入细胞生长和细胞周期调控。在酵母和哺乳动物中都发现p38 MAPK参与细胞生长的调控。在本研究中,主要探讨榄香烯对神经胶质瘤细胞体外增殖和细胞周期的影响的相关机制及其对神经胶质瘤细胞体内增殖的的影响。通过采用细胞计数、流式细胞分析、Western blot等方法分别检测不同药物浓度和不同作用时间榄香烯对胶质瘤细胞的增殖影响和香烯对胶质瘤细胞的细胞周期的影响以及p38、JNK蛋白质表达的变化,并观察p38抑制剂和其显性失活突变体对榄香烯作用的影响,同时还观察榄香烯对接种C6胶质瘤细胞的裸鼠的肿瘤生长情况的影响。结果发现榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的体外增殖抑制作用,榄香烯对C6胶质瘤细胞的增殖抑制效应呈剂量、时间依赖性,随药物浓度和作用时间的增加,抑制效应增强,而且榄香烯可以诱导大鼠C6胶质瘤细胞G0/G1期的阻滞。榄香烯明显上调磷酸化p38蛋白表达,同样具有剂量、时间依赖性,而对JNK蛋白表达无明显影响。通过使用p38的特异性抑制剂吡啶咪唑类衍生物(SB203580),为研究p38在榄香烯抗大鼠C6胶质瘤细胞体外增殖中的作用提供了有力工具。抑制p38的激活,可以阻断榄香烯的作用。不仅如此,榄香烯能明显抑制接种C6胶质瘤细胞的裸鼠的肿瘤生长,可见榄香烯同样可以抑制C6胶质瘤细胞的体内增殖。本研究证实榄香烯能抑制胶质瘤细胞的体内和体外增殖,诱导胶质瘤细胞的G0/G1期的阻滞,上调磷酸化p38蛋白质表达可能是榄香烯抑制C6胶质瘤细胞增殖、诱导C6胶质瘤细胞周期阻滞的机制,为榄香烯用于临床治疗胶质瘤提供了新的依据。
何伟明[4]2017年在《优化的砷镉铅混合物诱导C6胶质瘤细胞凋亡及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:胶质瘤是最常见的并且最具有侵袭性的原发性脑肿瘤,预后极差,因为药物通过血脑屏障(BBB)还是一个需要解决的问题。胶质瘤细胞表现出细胞凋亡减弱,促进增殖和侵袭性。因此,诱导脑胶质瘤细胞凋亡是一种降低脑胶质瘤的侵袭性很有前途的治疗策略。已经有研究证明砷、镉、铅对癌症具有抗恶性细胞增生和促细胞凋亡作用。因此,我们假设能够渗透血脑屏障的As+Cd+Pb可能会影响恶性胶质瘤的生存能力,并将其作为一种化学治疗剂进行研究。我们假设As+Cd+Pb混合物的作用要大于单种金属的作用。我们评估了重金属混合物对C6胶质瘤细胞株潜在的细胞凋亡的影响。并且对星形胶质细胞活化和炎症反应变化的可能性进行了检测,对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通道的调制进行了探讨。总的来说,我们的研究识别了 As+Cd+Pb混合物对恶性胶质瘤细胞活性的影响机制。方法:细胞培养和MTT试验,DNA片段化-细胞凋亡测试,复合指数计算,免疫印迹,免疫细胞化学,统计分析.结果:我们分析了 As+Cd+Pb组合对大鼠C6胶质瘤细胞的影响,首先确定了单种金属的致死浓度(LC),然后,对C6胶质瘤细胞进行不同浓度的As+Cd+Pb处理,包括LC-5(As:5 μM,Cd:2.5 μM和Pb:15 μM)以及两倍或叁倍LC-5浓度。As+Cd+Pb引起C6胶质瘤细胞生存能力的剂量依赖性降低。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记发现,细胞死亡归咎于DNA片段碎裂。半胱天冬酶-9(caspase-9)的裂解表达增强,表明细胞凋亡是由线粒体介导的。随着促凋亡蛋白Bax的增加以及抗凋亡蛋白Bc12的减少,Bax/Bc12比值大于1.0,证明了线粒体途径的细胞凋亡。探索凋亡调节机制揭示了 C6胶质瘤细胞形态的改变和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的增强,表明与活化的caspase-9存在共定位。胶质细胞活化伴随着炎症反应,涉及白细胞介素-1(IL-1)和IL-1受体表达的上调。IL-1也会引发细胞凋亡,拮抗IL-1受体后cleaved caspase-9明显减少。磷酸化p38的表达增加证实p38的活化和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)参与。利用p38-MAPK抑制剂SB203580能够抑制caspase-9的活化,从而进一步证实p38-MAPK参与介导C6胶质瘤细胞凋亡。结论我们目前的研究表明,优化浓度的砷镉铅混合物(As+Cd+Pb)对C6胶质瘤细胞系是有毒性作用的。剂量依赖性细胞凋亡的增加导致C6胶质瘤细胞数目的减少。Bax/Bcl2比例上升导致其通过半胱天冬酶(caspase)依赖的通路使核裂解,表明这种凋亡效应是线粒体相关的。C6细胞凋亡的调节因素包括星形胶质细胞的激活,伴随着胶质细胞形态改变,炎症反应和P38-MAPK信号转导。总体而言,我们的研究结果能够为砷镉铅混合物(As+Cd+Pb)作为神经胶质瘤新的治疗方法提供参考。
参考文献：
[1]. p38MAPK的信号转导对大鼠胶质瘤细胞C6生长周期调控的初步研究[D]. 章必成. 第四军医大学. 2001
[2]. Nodosin对恶性胶质瘤的作用及其机制研究[D]. 陈秋铃. 广州中医药大学. 2013
[3]. P38MAPK在榄香烯致鼠胶质瘤C6细胞增殖抑制和周期阻滞中的作用[D]. 姚轶群. 大连医科大学. 2007
[4]. 优化的砷镉铅混合物诱导C6胶质瘤细胞凋亡及其机制研究[D]. 何伟明. 南方医科大学. 2017
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