王宗礼[1]2004年在《PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术的研究》文中研究表明本论文研究了小鼠和牛早期胚胎的徒手切割取样方法、切割取样胚胎冷冻一解冻方法和PCR方法鉴别牛早期胚胎性别技术，并应用牛Y—染色体特异引物PCR扩增牛、牦牛、山羊、绵羊、小鼠、猪等6个动物基因组，克隆测定扩增产物的序列。试验结果表明： 1．体视显微镜下，应用玻璃切割针徒手切割取样小鼠和牛胚胎；切割取样后胚胎体外培养48小时的发育率分别为76.7％(46／60)和80％(16／20)，牛新鲜胚胎和冷冻—解冻胚胎切割取样后移植妊娠率分别为47.1％(8／19)和42.9％(6／17)。 2．分别以10％甘油、10％乙二醇作为冷冻液以及在以上两种冷冻液中分别添加10％葡聚糖+0.1M蔗糖作为冷冻液常规冷冻方法冷冻切割后的小鼠胚胎，冷冻—解冻后体外培养72小时总发育率分别为56.9％(259／455)，81.8％(317／)，84.8％(540／738)和59.5％(308／518)。取样后胚胎体外短暂培养(0—4小时)并不能提高切割取样后小鼠胚胎冷冻一解冻体外培养发育率。 3．切割取样小鼠胚胎快速冷冻体外培养发育率为73.3％(33／45)，切割取样牛胚胎在25％甘油+0.25M蔗糖+20％血清的PBS为冷冻液快速冷冻后移植妊娠率为57.1％(4／7)。 4．依据牛Y染色体特异序列设计合成5对Y染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基冈和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异内标引物。应用合成的引物单重PCR扩增牛血样DNA，筛选到4对牛Y染色体特异引物和一对牛DNA特异内标引物。应用所筛选的4对牛Y—染色体特异引物和内标引物分别PCR扩增牛基因组DNA、成纤维细胞和胚胎，筛选出2个可用于牛胚胎性别鉴别的多重PCR引物组合：B34／A12、B78／A12。建立了两温度循环PCR方法(94℃变性15s和55℃退火15S，以94℃变性1s和55℃退火1s)并鉴别牛胚胎性别，将PCR扩增时间减少到50分钟左右。 5．设计合成的5对牛Y—染色体特异引物都可以扩增牛和牦牛Y—染色体，引物B90在绵羊中也有扩增产物，其他动物均未获得扩增产物。扩增产物序列测定结果表明，2对牛Y—染色体特异引物(引物B90、B12)所扩增牦牛的产物序列为已知序列，2对牛Y—染色体特异引物(引物B78、B34)所扩增牦牛的产物序列为新序列。
宋淑珍[2]2007年在《绵羊性别鉴定PCR方法的研究》文中研究表明本文通过对绵羊性别决定基因检测多重和巢式PCR体系的建立及优化、性染色体引物的特异性检测，建立了绵羊性别决定基因检测的PCR方法，并讨论了影响PCR扩增的几个因素以及它们之间的相互关系。主要内容包括：(1)从GenBank中检索到长度为723bp的绵羊SRY基因序列作为Y染色体特异序列，长度为3249bp的β-B-珠蛋白基因作为常染色体内标基因序列，利用Primer 3软件，设计了长度均为20bp性染色体巢式引物SRY337、SRY193和常染色体的巢式引物G559、G278。(2)对所设计的引物进行筛选组合，建立了绵羊早期胚胎性别鉴定的多重和多重巢式PCR反应体系。(3)对多重PCR体系用4×3×4因子组合析因设计实验(dNTP的终浓度分别为100μM、200μM、300μM、400μM；Mg2+浓度分别为1.5mM、2mM、2.5mM、3mM：温度分别为58℃、60℃、62℃)确定了dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度的最优组合，优化了扩增程序。对巢式PCR体系第二轮扩增进行了不同dNTP浓度、Mg~(2+)浓度和温度、以及不同扩增程序的筛选和优化。(4)用本试验中所采用的SRY巢式引物分别对人、牛、兔基因组DNA及淋巴细胞缓冲液进行扩增，检测引物的特异性和分析性别鉴定过程中可能存在的污染因素。绵羊肝组织基因组扩增结果表明：公羊可同时扩增出性染色体和常染色体片段，而母羊只能扩增出常染色体片段，引物特异性高，外引物间、内引物间扩增温度相差不大，可进行多重扩增。通过析因试验筛选的最优多重PCR性别鉴定体系为：SRY337、G559的浓度分别为0.4州，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为300μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—58℃退火30s—72℃延伸20s}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。优化后的多重PCR体系扩增公羊肝组织基因组，灵敏度为100pg。在巢式PCR中，以建立的最优多重PCR体系进行第一轮扩增20个循环后，析出5μl进行第二轮扩增，其最优反应体系为：SRY193、G278浓度均为0.4μM，Mg~(2+)为2.0 mM，dNTP为200μM，Taq酶1U，10×PCR Buffer为2.5μl，扩增体系25μl；扩增程序：94℃预变性3min—{94℃变性20s—64℃退火延伸20s—}30个循环—72℃延伸3min—4℃保存。本多重巢式PCR性别鉴定体系的灵敏度为100fg(1个细胞约5pg)，4细胞的DNA就可扩增鉴定结果，总鉴定时间约为110min。特异性检测结果表明：SRY基因引物只对羊、牛雄性特异，其他动物雄性DNA及淋巴细胞缓冲液均不影响检测结果。本实验所建立的巢式PCR体系相对简单、快速、准确率高，完全可以在生产实践中用来鉴定绵羊性别。
王栋, 程金华, 朱化彬, 郝海生, 王宗礼[3]2006年在《两温度梯度多重PCR鉴别牛早期胚胎性别的技术》文中研究表明稳定、可靠和快速的牛胚胎性别鉴定方法在生产应用中具有重要意义。通过两温度梯度PCR方法对牛基因组、克隆胚胎、胚胎样品进行性别鉴别实验研究,建立了稳定、简便、快速的牛早期胚胎性别鉴别两温度梯度PCR方法,鉴定时间仅为57分钟。采用两温度梯度PCR方法对30枚奶牛胚胎进行了早期性别鉴别,并将鉴别的15枚胚胎(11枚为雌性,4枚为雄性)移植到同期处理的15头受体母牛体内。60天后妊娠检查,有7个受体成功受孕,5头受体怀孕晚期流产,流产犊牛全部为母犊。结果产下1公1母两头犊牛,流产个体与出生个体的性别与PCR鉴别结果完全相符。
林博[4]2010年在《快速PCR方法的建立及其在牛精子和胚胎性别鉴定中的应用》文中研究说明产奶、产蛋等性状是限性性状,生长发育等性状的表达因性别不同而呈现较大差异,所以性别控制技术研究在畜牧经济生产中具有重要意义。目前,根据X、Y精子DNA含量不同而进行的精子分离技术是重复性最好、最为科学有效的分离方法,但对于分离效果的评价体系尚未健全;同时,胚胎性别鉴定作为性别控制的另一种形式,已经发展了很多技术方法,在这些方法中,PCR技术以其稳健的检测结果和简便的技术操作而备受关注。然而,以往的PCR方法大都是针对仅存在于Y染色体上的Sry基因进行检测分析,需要通过双重PCR方法、巢式PCR方法等进行检测分析,不但检测方法繁琐、操作的技术要求较高,而且PCR扩增及后续的检测分析需要较长的时间,增加了胚胎体外应激的时间,因此,有必要对PCR方法的各个环节进行深入研究,以建立简便、快捷、高效、低成本的实用PCR胚胎性别鉴定技术,并针对X、Y精子分离技术建立相应的科学、高效评价技术体系。常规PCR温度循环程序通常包括变性、退火、延伸叁个温度梯度,但研究表明延伸温度梯度的存在与否及存在时间与所扩增片段的长度有直接关系,当扩增片段较小时,就可以由叁个温度梯度变为两温度梯度,这样可以使扩增时程大大缩短,如能挖掘出两温度梯度PCR的扩增潜能并对其进行优化,则PCR方法就可实现其快速、简便、成本低的技术特点,并在生物等诸多领域具有更广泛的应用前景。基于此,本研究采用两温度梯度PCR方法进行了大于200bp片段的扩增研究,并对牛血液、精子、毛囊DNA等多种模板进行了检测分析,成功进行了长度为207 bp到1413 bp的PCR扩增,但对1561 bp长度片段却未能成功扩增。对1561bp片段扩增条件的研究表明,适当延长变性和退火时间,可以相应减少叁温度梯度PCR的延伸时间,其原因还有待于进行深入探讨。对两温度梯度PCR扩增效率影响因素的优化表明,当镁离子浓度为1.0 mM,聚合酶为1.0个单位,循环数为30时,所建立的两温度梯度PCR方法能达到最佳的扩增效果,并且,不同仪器和不同Taq酶对两温度梯度PCR效果影响的研究结果表明,利用两温度梯度PCR,通过普通仪器和普通Taq酶即可实现长度在1413bp以下片段的有效扩增,据此推断,PCR方法的最长片段扩增能力主要取决于Taq酶本身的动力学活性,而不是主要取决于所使用的仪器和所使用的试剂。对牛血液和成纤维细胞的双重PCR扩增结果表明,两温度梯度PCR不但适用于简单PCR扩增,也适合于双重PCR等复杂扩增检测研究,而且还可以应用于牛性别鉴定等特别的检测分析领域。与普通PCR相比,快速PCR可将扩增时间由原来的1.5 ~ 2.0小时缩短到25 ~ 35分钟,即一次扩增所用的时间还不到原来的一半。性别鉴定引物的模板特点决定了所采用的PCR扩增方法的类型。本研究一改以往针对仅存在于Y染色体上的性别特异序列进行性别鉴定的策略,通过对X和Y染色体上不同多态特点的牙釉基因的等位基因(AML)进行序列比对分析,设计了一对性别特异引物,并通过对牛血液、精液DNA模板进行PCR扩增验证了该引物的有效性后,采用该引物对从常规精液、分离的X-精液和Y-精液中各分离出来的100个单精子进行了快速PCR性别鉴定,所检测的单精子模板均获得了清晰可辨的特异产物条带,对所检测的常规精液、分离的X精液和Y精液中的X精子和Y精子比例进行了统计推断,统计结果表明,常规冷冻精液中X、Y精子比率为1:1,分离的X-精液中X精子比率为84.0%,分离的Y-精液中Y精子比率为88.0%,各类精液的统计结果与理论比值(常规精液)和重分离分析结果(性控精液)没有显着差异,表明快速PCR可以用于牛精子的性别鉴定,并且可以进行分离精子的纯度分析,自此,本研究室建立了一种简单易行、成本低廉、可靠性高的性控精液纯度快速检测分析方法,使性控精液的纯度分析摆脱了对流式细胞仪等专有大型设备的依赖,成为可在一般实验室中进行检测分析的常规方法,为进行更深入的精子分离研究奠定了技术基础,也为性控精液的推广应用提供了强有力的技术支撑。本研究还将所建立的简单快速PCR检测体系进行胚胎性别鉴定研究。首先利用快速PCR方法对牛成纤维细胞进行了检测分析,并以双重PCR方法作为阳性对照,研究结果表明,该体系可以对成纤维细胞进行准确的性别鉴定检测分析,在以双重PCR方法作为阳性对照的胚胎性别鉴定研究中,该简单PCR方法取得了较为理想的扩增检测结果,并从双重PCR方法的对照中得到了验证,将该反应体系进行优化并设计出了简单有效的试剂盒,简化了实验操作,以使其更方便于现场检测分析。对试剂盒的检测分析表明,该试剂盒有助于节省生产成本、提高生产效率,在牛性别鉴定和性别控制中具有巨大的生产意义,该检测方法的建立在法医鉴定中也有较高的应用价值。
赵雪[5]2011年在《奶牛性别控制技术研究》文中研究说明胚胎性别鉴定技术和性别控制技术为哺乳动物胚胎工程核心技术之一，该技术的优化和成熟，对胚胎工程技术在生产实践上的广泛应用具有重要的经济意义。本研究通过对奶牛胚胎体外生产过程中多个环节进行优化进行性别控制。包括（1）利用不同免疫方式免疫动物，制备高效价H-Y抗体，筛选雌性胚胎；（2）优化胚胎体外生产（IVP）技术关键条件，包括卵母细胞体外成熟条件、性控精液的分离方法、性控精液的密度、胚胎的体外培养液挑选等环节；（3）研究了卵巢输送时保存温度对卵母细胞的回收、成熟、性控精液体外受精、胚胎发育及两种应激基因Hsp70.1和Bax在囊胚中的表达的影响；（4）研究胚胎性别控制技术联合胚胎冷冻技术对牛胚胎体外发育、胚胎质量及其牛犊出生率的影响等研究。得到如下结果与结论：（1）利用免疫动物制备H-Y抗原抗体，与早期胚胎共培养筛选雌性胚胎，结果表明4-8Cell胚胎采用H-Y抗原抑制的方法不能进行准确的性别鉴定，桑葚胚采用H-Y抗原抑制的方法雌性胚胎的PCR验证结果为81.5%，说明选择性阻滞胚胎发育为一种比较可靠雌性胚胎选择的方法。（2）EGF和IGF-Ⅰ联合应用能够促进牛卵母细胞的体外成熟，提高IVF胚胎的体外发育能力；Percoll梯度离心法与上浮法的精子IVF胚胎的发育能力差异不显着(P>0.05)；0.5×106个/ml的精子密度比较适合，可提高性控精液的利用率；mSOF和G1/G2更适合与性控精液IVF胚胎的培养，其中G1/G2是商品化培养液，效果稳定；利用最优化的条件，比较性控精液与普通精液IVF胚胎发育率，发现X精子、Y精子和未分离精子的卵裂率和囊胚率无显着差异， X精子IVF胚胎雌性率为89.9%（62/69），未分离精子雌雄比例为47.9：52.1。（3）卵巢运输温度对性控精液的体外受精率及受精后胚胎的发育有显着的影响。卵巢在35°C保存3-4h显着降低了A、B级卵母细胞的回收率，卵母细胞的成熟率、性控精液的受精率及囊胚的发育率，同时第七天囊胚内的细胞凋亡率及Hsp70.1和Bax的表达显着升高。来源于25°C保存卵巢的卵母细胞受精率显着高于其它两组。（4）性控精液获得的IVF胚胎冷冻后，其复活率和24h孵化率，同对照组相比差异不显着,但非性控精液的IVF冷冻胚胎解冻后，48h的孵化率高于性控组。两组囊胚的细胞凋亡率没有显着性差异。两组囊胚内细胞团细胞与滋养层细胞数之间的比例分别为0.26±0.13和0.24±0.09，二者差异不显着。性控胚胎和非性控胚胎移植后的妊娠率、出生率以及性控效率差异不显着。
林博, 朱化彬, 郝海生, 杜卫华, 赵学明[6]2009年在《PCR技术在性别鉴定及性别控制应用中的研究进展》文中研究表明PCR技术是一项发展迅猛的生物技术,因具有快速、灵敏、简便及特异性强等特点而被广泛应用于性别鉴定及其它许多相关研究领域。应用于性别鉴定的PCR方法从简单PCR法、双重或多重PCR法、巢式PCR法发展到改进的两温度梯度PCR法;而不同性别间除了呈现有或无关系(类似于Sry基因)的基因序列外,也检测到了很多类似于锌指蛋白和牙釉蛋白的呈现不同性别特征的基因序列,这为性别鉴定引物的设计和PCR法进行性别鉴定提供了另一种全新的思路,即如果根据这种性别多态性DNA序列特点设计引物,采用两温度梯度PCR扩增技术进行PCR性别鉴定,则可望简化鉴定程序、降低检测时间、提高鉴定效率,使PCR性别控制技术更加成熟和实用化。随着研究的深入,PCR技术在性别鉴定及控制的应用中必将日益成熟,并推动此项技术在其它相关领域中的研究和应用取得更大的进展。
朱化彬, 王栋, 程金华, 郝海生, 王宗礼[7]2005年在《牛早期胚胎性别快速鉴别的研究》文中研究表明根据聚合酶链式反应中聚合酶的扩增特性,对PCR反应的循环参数进行研究,取消了PCR反应中延伸这1温度梯度,对2温度梯度PCR方法进行了单重PCR和多重PCR扩增研究,并采用2温度梯度多重PCR方法分别对牛基因组、成纤维细胞、胚胎样品进行了性别鉴别研究,建立了稳定、简便、快速的用于牛早期胚胎性别鉴别的2温度梯度PCR方法。同时还对2温度梯度PCR的扩增能力进行了研究,结果表明:2温度梯度PCR方法能够扩增片段的可能长度为633 bp。
俸艳萍[8]2007年在《鸡的性比及性分化早期胚胎性别差异表达基因研究》文中研究指明鸡的性别控制在现代养鸡生产中具有重要意义，然而目前仍没有较好的方法实现这一目标。现有的性别控制方法有通过影响控制鸡性比的因素使性比偏向生产所需及通过干扰鸡的性腺分化产生性反转鸡等，本研究围绕这两个主题，一方面利用早期鸡胚性别鉴定方法全面分析正常生产条件下鸡的各种性比及产生性比偏向的可能原因；另一方面利用抑制消减杂交(SSH)技术分离性分化早期雌、雄鸡胚性腺的差异表达基因，并对这些基因进行进一步研究，为探讨性别决定与性分化的分子机理奠定基础。具体研究如下：组合扩增W染色体上360 bp的EE0.6特异片段和Z染色体上970 bp的OVR基因片段的两对引物，应用双重PCR技术建立了鸡性别鉴定分子方法，经验证其准确率达100％；利用该方法成功判定了早期鸡胚的性别，其中早期死亡鸡胚的性别判出率达92.34％。结合分子鉴定鸡胚性别及剖检鉴定性别的方法分析了人工饲养条件下140只母鸡在30天内的子代性比，结果表明“所有母鸡”组和“高繁殖力母鸡”组(76只)的出壳雏鸡和总体子女(包括孵化过程中的死胚)的性比均不显着偏离理论性比值1∶1，但孵化过程中死亡的雌性胚胎数量显着超过雄性(P＜0.05)；高繁殖力母鸡中，大部分个体的亲本性比不同程度地偏离理论性比，其中有7只(占9.21％)子代性比显着偏离理论值(P＜0.05)，另有37只产生至少连续4个为同一性别的种蛋。以孵化3.5—6天的鸡胚性腺组织为材料，应用SSH技术构建了性分化早期雌、雄鸡胚间正反向消减cDNA文库，以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率，结果表明两个文库的消减效率均高达2~5倍。从每个文库中随机挑选96个克隆进行PCR鉴定，发现cDNA插入片段的长度主要分布于250—750 bp之间，F-M(以雌性鸡胚为tester、雄性鸡胚为driver)和M-F(以雄性鸡胚为tester、雌性鸡胚为driver)消减cDNA文库中有效阳性克隆率分别达93.8％和90.6％。利用斑点杂交技术，以正向消减cDNA和反向未消减cDNA作为探针对F-M文库中1200个克隆和M-F文库中900个克隆进行筛选，结果表明两个文库中差异明显(相差至少3倍以上)的阳性克隆率分别为31％和26％。将已测序的152个差异表达克隆的cDNA序列在NCBI数据库中进行比对，结果表明F-M文库的86个克隆代表了41个基因，其中39个为已鉴定基因、2个具有同源EST序列；M-F文库的66个克隆代表了47个基因，其中16个为已鉴定基因，12个有EST同源序列，25个没有任何同源序列。根据哺乳动物中同源基因的功能推测41个已知功能的差异表达基因(F-M中31个，M-F中10个)分属于DNA水平相关因子、RNA水平相关因子、结构蛋白、酶类、癌症相关基因及信号转导因子等。分析88个差异表达基因在鸡基因组中的分布，结果发现这些基因主要分布于鸡1—5号染色体上，其中F-M文库中有1个基因位于W染色体上，F-M文库和M-F文库中分别有2个和3个基因位于Z染色体上。将差异表达cDNA片段在GenBank的鸡EST数据库中进行比对，结果表明分别有80.49％和34.04％的雌、雄性差异表达基因在两个已报道鸡胚性腺相关文库(gonad cDNA library and gPGC cDNA library)中有同源序列；通过比较cDNA片段在消减文库及两个已报道性腺相关文库中的重复率，初步分析了这些基因在鸡胚性腺中的基本表达特征。用RT-PCR方法分析了7个功能候选基因及46个新发现的差异表达基因(F-M文库34个，M-F文库12个)在鸡胚早期性腺发育过程中(第4—12天)的表达谱，结果表明：功能候选基因中除cEki2和cFog2在两性中表达水平相似外，cBrd3、cVnn1、cPpt1、cLhx9和cGATA4五个基因在鸡性腺分化过程中呈两性差异性表达；另外从表达模式上看，除cVnn1的表达模式及cGATA4／cFog2的相互作用模式与哺乳动物相似外其它都不相同；新发现的差异表达基因大部分(F-M，85.29％；M-F，91.67％)为真实差异表达，相对表达水平相差达2倍以上的基因在F-M、M-F文库中分别有13个和6个，其中于性分化前期(第4—5天)两性中表达差异明显的分别有10个和1个；而表达差异小于2倍的基因在F-M、M-F文库中分别有16及5个。此外，还通过WISH定位分析基因表达的方法初步分析了SMARCE1在5.5天和8.5天鸡胚泌尿生殖系统的表达，结果表明该基因在5.5天两性鸡胚的泌尿生殖系统中均有表达且表达量基本相同，在性腺形态已分化的8.5天雄性鸡胚的性腺和肾脏外侧呈明显阳性表达。应用SMART技术成功克隆了HMG-14A基因的一个新转录本(F071)和Z染色体上一个非编码RNA(A041)的全长cDNA序列，GenBank登录号分别为EF422210、EF422212。F071基因全长cDNA序列为1026 bp，ORF Finder预测其最大开放阅读框为318 bp，编码105个氨基酸：该基因的核苷酸和氨基酸序列比对结果表明F071与鸡HMG-14A基因(NM_001079480.1)的同源性最高，两者核苷酸同源区段覆盖率为85％，但两者所编码的氨基酸相似性为100％。用Signal P3.0、ProtParam、Prosite等软件对基因所编码的蛋白质结构、功能等特征进行预测和分析，结果表明F071蛋白为富含赖氨酸的非分泌性蛋白，它含有HMG14和HMG17信号、一个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、一个酰胺化位点、一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、两个蛋白激酶C磷酸化位点和一个N-糖基化位点；根据CLUSTALW结果，用MEGA3.1软件构建了HMG14(HMGN1)基因家族在多个物种间的系统进化树，结果表明鸡F071(HMG-14A)与其它物种HMGN1的进化关系相距较远。A041分子有两个长度分别为1249 bp和790 bp、仅在5’UTR区长度不同的转录本，ORF Finder预测其最大开放阅读框为144 bp，编码47个氨基酸，在NCBI数据库进行比对未发现与该分子具有同源核苷酸序列或同源蛋白序列的基因，根据该分子特征推测其为非编码RNA。
郑江霞[9]2003年在《PCR方法鉴别奶牛胚胎性别相关环节的优化研究》文中研究指明本试验通过对PCR方法鉴别奶牛胚胎性别相关环节的优化研究，进一步弥补该方法原有的不足之处，为奶牛胚胎性别鉴别技术尽快应用于商品化生产提供了有价值的参数。试验中主要针对PCR法鉴别奶牛胚胎性别技术的四个重要环节进行了优化处理。 首先，采用多重PCR方法扩增牛Y-染色体多重复序列和牛常染色体DNA片段进行奶牛胚胎性别鉴别，这样就可以避免因两个目的片段拷贝数不同而产生的不均等扩增。本试验共鉴别30枚胚胎，其中新鲜胚胎21枚、冷冻胚胎9枚。两次性别鉴别结果的相符合率为100％。 其次，筛选种属特异性好，扩增灵敏度高的引物对奶牛Y-染色体多重复序列进行扩增。试验中有叁对候选引物st1／st2、BOV97M、K49057／K49058，经过多次试验筛选，最后选定st1／st2作为性别鉴别试验的引物。 再次，确定性别鉴别胚胎的最佳取样细胞数，改进胚胎切割方法，缩短胚胎切割时间。试验选择体内受精生产的发育级别为A级和B级的桑椹胚，使用玻璃切割针进行切割。经过预试验，确定取样细胞数在5-10个为最好，这样既不影响PCR的精确度又对胚胎的损伤小。 最后，本试验还进行了单细胞PCR的尝试，试验结果说明，改进后的性别鉴别PCR反应体系可对单个细胞进行有效扩增。
乌达巴拉[10]2005年在《哺乳动物性别鉴定方法的比较研究》文中指出本文比较研究了用聚合酶链式反应技术扩增哺乳动物 SRY 特异序列鉴别哺乳动物性别的方法与用免疫学方法中的细胞毒性实验鉴定哺乳动物早期胚胎性别的方法。牛 SRY 引物对公牛的 SRY 特异的 141bp 序列进行扩增。小鼠 SRY 引物对雄鼠的 SRY特异的 266bp 序列进行扩增。从公、母牛和雌、雄小鼠的血液中提取基因组 DNA,用作 PCR 扩增基因组 DNA 的模板。确定最适 PCR 扩增牛和小鼠基因组 DNA 条件,反应在Eppendorf 5301 型 PCR 仪上进行。采用 PCR 扩增牛基因组 DNA 最适条件扩增了 20 头(♀5,♂15)草原红牛的基因组 DNA,14 个雄性样品中均出现清晰可见的特异 DNA扩增带,一个雄性样品未出现特异 DNA 扩增带,而雌性样品无扩增片段出现。同时采用 PCR 扩增小鼠基因组 DNA 最适条件扩增了 20 只(♀7,♂13)昆明白系小鼠的基因组 DNA,11 个雄性样品中均出现清晰可见的特异 DNA 扩增带,两个雄性样品没有出现特异 DNA 扩增带,而雌性样品无扩增片段出现。用免疫学方法制备 H-Y 抗血清,对 6-8 周龄的昆明白系小鼠进行超数排卵处理,收集 8-细胞到胚泡期的胚胎。将在收集的胚胎中选择形态完好、发育正常的胚胎,将其放入含有 H-Y 抗血清的微滴的培养皿中,用石蜡覆盖,在二氧化碳孵育箱内培养24h。培养后在倒置显微镜下检查经 H-Y 抗血清培养的胚胎,胚胎中几个或全部卵裂球发生溶解,表明有 H-Y 抗原存在即为雄性胚胎,胚胎完好无损或发育至 16-细胞期或囊胚期的为 H-Y 阴性即雌性胚胎。本实验中应用此方法对 13 枚昆明白系小鼠胚胎进行性别鉴定。其中 5 枚胚胎经培养后胚胎中几个或全部卵裂球发生溶解,因此鉴定为雄性胚胎,5 枚胚胎经培养后有的胚胎完好无损,有的发育至囊胚,即鉴定为雌性胚胎,其余 3 枚胚胎没有被鉴定出性别。结果表明,PCR 法和 H-Y 抗原法均可用来鉴别哺乳动物以及其胚胎的性别。用 H-Y抗原法进行性别鉴定用时比较长、准确率低等不足之处。而用 PCR 法鉴定性别具有相对简单、快速、准确率高等优点,可确立为在实际应用中广泛推广。其创新点为确立可以在实际应用中被推广的方法。
参考文献：
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[8]. 鸡的性比及性分化早期胚胎性别差异表达基因研究[D]. 俸艳萍. 华中农业大学. 2007
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