娄底市娄星区疾病预防控制中心检验科 湖南娄底 417000
【摘 要】目的：探讨ELISA法在食品微生物检测中的应用。方法：选择由本中心的样品收样室提供的食品样本进行ELISA检测，检测食品中的细菌、真菌毒素、毒素，并检测转基因食品。结果：ELISA检测食物中的金黄色葡萄球菌，阳性检出率为70%；采用抗AFB1单克隆抗体构建检测食品中的AFB1，最低检出浓度为0.01ng/g，敏感范围0.2-50ng/g，精密度2.0-23.8%，平均回收率83.0-110.0%；采用直接竞争ELISA试剂盒检测转基因食品中的Btcry2Ab/2Ac杀虫蛋白，检测范围40-2000ng/mL，最低检测限40ng/mL。结论：食品微生物检测中，ELISA技术与其他技术相比具微量化、灵敏、简捷等优势，ELISA技术在食品微生物检测中具有重要作用。
【关键词】酶联免疫吸附法；食品；微生物检测；应用
[Abstract] objective：to study the application of ELISA method in detection of food microorganism. Methods：choice is provided by the center of the sample charge chamber ELISA detection of food samples，testing of bacteria，fungi toxin and toxin，food and detection of genetically modified food. Results：ELISA to detect staphylococcus aureus in food，positive detection rate is 70%；Resistance to AFB1 monoclonal antibody was used to construct AFB1 in the detection of food，the lowest detection concentration is 0.01 ng/g，sensitive range 0.2-50 ng/g，precision of 2.0-23.8%，the average recovery of 83.0-110.0%；Use direct competitive ELISA kit in the detection of genetically modified food Btcry2Ab / 2 ac insecticidal proteins，40-2000 ng/mL detection range，low detection limit of 40 ng/mL. Conclusion：the detection of food microorganism，ELISA technology compared with other technology has the advantages of the trace amount，sensitive，simple，ELISA technology plays an important role in the detection of food microorganism.
[Key words] enzyme-linked immunosorbent method；Food；Microbial detection；application
随着人们生活水平的提高，人们越来越重视食品安全问题，微生物对于食品污染问题也越来越受关注，在食品生产、加工、运输、储存、销售等各个环节中均存在污染微生物的可能性，一旦发生污染，将会引发微生物大量繁殖，进而食品腐烂变质，导致食物中毒及食源性感染，近年来随着生态平衡的破坏及环境污染的加重，造成人类感染致病菌种类逐渐增多，病原微生物对于人类的威胁也逐渐加大[1-3]。为尽快查明原因，选择合适的检验方法检测尤为重要。传统的培养和分离鉴定方法，准确性较高，但准备收尾工作繁重、需要时间较长、操作繁琐、实验较多，而且需要大量实验人员共同操作[4]。为此，目前人们关注重点是寻求更为简单、方便、快捷、有效的检查方案。酶联免疫吸附法结合了放射免疫测定法及免疫荧光法二种技术的优点，其具有适用范围宽、标记物稳定、检测速度快、反应灵敏准确、费用低等优势。
1材料
1.1样品
所有食品样本，均由本中心的样品收样室提供。
1.2检测试剂
固相抗菌素原或抗体；酶标记抗体或抗原；酶反应底物；本次实验所有ELISA试剂盒均够买于PhoenixPharmaceutials。。
2检测方法
ELISA有多种改良方案，如双抗体法、竞争法、双抗体夹心法、生物素-亲和素放大系统等，大致分为3类：①测定抗原双抗体夹心法；②测定抗体间接法；③测定抗原竞争法。①与②主要适用于测定大分子抗原及抗体，③适用于测定小分子抗原，因而适合食品检测及分析。
竞争酶联免疫吸附法分为间接竞争法及直接竞争法。间接竞争法步骤如下：抗原吸附在固体载体上，温育清洗然后加入含有抗原的抗体及待测液，温育清洗然后加入酶标记抗体，温育清洗然后加入酶底物温育后显色，判定检测结果。直接竞争法步骤如下：抗体吸附在固体载体上，温育清洗然后加入含有抗原的抗体及待测液，温育清洗然后加入酶底物温育后显色，判定检测结果。
3检测结果
3.1ELISA检测金黄色葡萄球菌
采取竞争酶联免疫吸附法的间接竞争法。提取家禽血清，实验室制备金黄色葡萄球菌阳性血清。每个家禽提取两份血清，共提取40份家禽血清。首先采取培养法进行检测，确定金黄色葡萄球菌阳性率为80%（16/20）。同时建立间接ELISA和试管凝集试验平行，检测20份家禽血清，实验结果表明，间接ELISA阳性检出率为70%（14/20）。两者之间比较，无明显差异，无统计学意义（X2=0.5553，P=0.4652）。
3.2检测食品中的AFB1
采取竞争酶联免疫吸附法的直接竞争法。本次实验采取黄曲霉毒素B1抗体建立直接竞争抑制ELISA筛选法。ELISA间接竞争法检测玉米，首先提取样本8份，制备AFB1标准工作溶液。回收率计算：样本中加入10μg/LAFB1标准工作溶液，考察回收率，检测4次并取平均值。试剂的检测：取出试剂，平衡到室温，采取试剂盒直接检测待检样品液，操作方法参考试剂盒说明书，检测4次。检测结果如下所示：
4讨论
酶联免疫吸附法基本原理为是在抗体或者抗原不损伤免疫活性情况下，在某种固相载体表面结合，检测时，将含有抗原或抗体的受检样品根据一定程度和结合于固相载体上的抗体或抗原反应，形成抗体或者抗原复合物；终止反应后，固相载体上的酶标抗体或者抗原被结合量和标本中待检抗原或抗体量成比例关系；洗涤后，将反应液体中的其他物质去除，将酶反应底物加入后，经过固相载体上酶催化作用，底物将转变为有色产物，最后，通过定量或者定性分析有色产物量即可[5]。
目前，ELISA法在食品微生物的检测中较为常用。①检测细菌：ELISA检测金黄色葡萄球菌。有报告显示，通过采用ELISA技术检测细菌，仅18h内能够完成1cfu/g金黄色葡萄球菌的检测。LinH.H.及R.M.Lister采用ELISA检测番茄酱中的3种霉菌，实验结果显示，采用该种方法可检测出番茄酱中1u/g的干霉菌样品，与此同时，与化学法对比，凸显了ELISA的高灵敏度。②检测真菌：检测食品中的AFB1。有关研究人员采用ELISA检测AFB1，并构建了间接竞争、直接竞争、生物素ELISA检测3种不同食品，比对比分析，实验结果显示，直接竞争及间接竞争ELISA具有低廉、安全、简便、特异、灵敏等特点。
虽然ELISA检测具有多种优势，但实验中会有多种因素影响其检验结果，主要因素包括以下方面：①试剂因素：选择试剂时，需挑选稳定性好、特异性高、灵敏度高、操作便利的试剂，注意不同厂家试剂不可混合使用，包括洗涤液及底物。且在检测前，注意将试剂放置室温平衡30分钟；加入底物时需注意观察是否出现颜色变化，如若显色表明变质或过期，不能继续使用。②操作人员：实验中操作人员的技术熟练程度也会影响实验效果，如加样量的多少，加入试剂速度的快慢，加样时间间隔等，因此应注意选择经验丰富的操作人员进行实验操作，避免出现以上影响。③排除非特异性反应干扰：除了设置阳性和阴性稀释液空白及血清等对照外，可采用包埋、封闭等进行预处理，如在包被液中加入明胶、牛血清白蛋白等，防止出现非特异性反应。本次实验选择高选择性的单克隆抗体，替代多克隆抗体，能够提高ELISA特异性[6]。④酶底物。要求本身无色，反应后可稳定呈色。本次实验选择的酶底物为邻苯二胺，产物呈现桔黄色，且能在数小时内稳定呈色。
从上世纪六七十年代建立ELISA技术以来，无论是检测方法自身改进方面，还是检测方法应用领域的扩展，均有显著改进，包含增强了试剂的稳定性、灵敏性、通用性，开发了自动检测仪器，与其他技术的联合使用等[7]。食品微生物检测中，在要求微量化、灵敏、简捷等情况下，ELISA技术与其他技术相比显示了极大优势，但不可避免同时存在一些不足之处，如多种成分难以同时分析，试剂选择性高，存在交叉反应等。随着研究的不断深入，能够相信ELISA技术在食品微生物检测中具有重要作用。
参考文献：
[1]曾阳俊.食品微生物检测技术的进展及研究[J].中国科技博览，2012（1）：93.
[2]石超，吕长鑫，冯叙桥，等.酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（10）：3269-3275.
[3]孔涛，郝贵增，郝雪琴，等.ELISA在饲料及食品安全检测中的应用[J].饲料研究，2012（7）：73-75.
[4]李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.
[5]于振，周雪林，陈娟，等.食品安全检测中的酶联免疫技术应用[J].农产品加工?学刊：中，2014（9）：58-61.
[6]黄瑞蕊，于振，李建科.酶联免疫技术在食品安全检测中的应用[J].科技创新与应用，2013（13）：84.
[7]张强.ELISA技术在食品安全检测中的应用研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2015，12（33）：45-49.
论文作者:张石华
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第13期
论文发表时间:2017/12/4
标签：抗体论文; 抗原论文; 食品论文; 微生物论文; 免疫论文; 试剂论文; 技术论文; 《中国蒙医药》2017年第13期论文;