李岩[1]2001年在《雌激素、褪黑素与记忆相关脑区神经损害的关系及对Aβ神经毒性的影响》文中研究指明目的：1.探讨雌激素（E）、褪黑素（MT）缺乏与记忆相关的脑区神经损害的关系。2.探讨E、MT及E、MT缺乏对β淀粉样蛋白（Aβ）神经毒性的影响。方法：1.用迷宫筛选无学习障碍SD大鼠，随机分为正常、假去卵巢（OVX）、OVX、假去松果体（PX）、PX、假OVX+假PX、OVX+PX 7组。术后饲养90d，再用Y型迷宫测试大鼠学习记忆能力。乙酰胆碱酯酶（AChE）组织化学检测海马CA_(1-4)区AChE。并用HE、tunel法检测海马、齿状回（DG）、扣带回、杏仁复合核、隔区、纹状体、丘脑背内侧核、内嗅区（EC）的凋亡及胶质细胞增生情况。用SABC法检测隔区Bax、Bcl-2表达及DG分子层突触泡膜素（SYN）免疫活性。2.将动物随机分为假手术、NS对照、正常+Aβ、假OVX+Aβ、OVX+Aβ、假PX+Aβ、PX+Aβ、假OVX+PX+Aβ、OVX+PX+Aβ 9组，术后饲养60d，将体外孵育的Aβ_(1-40)注入DG分子层，7d后甲醇刚果红显示Aβ沉积，尼氏染色显示神经元缺失，HE染色显示胶质细胞增生，HE、tunel法测细胞凋亡。SABC法检测DG损伤区Bax、Bcl-2表达及DG分子层SYN免疫活性。3.将老年动物分为假手术组、生理盐水注射、正常+Aβ、E+Aβ、MT+Aβ、E+MT+Aβ6组，将体外孵育的Aβ注入DG分子层。7d后甲醇刚果红显示Aβ沉积，尼氏染色显示神经元缺失，HE染色显示胶质细胞增生，HE、tunel法检测细胞凋亡，SABC法检测DG损伤区Bax、Bcl-2表达结果：1.假手术各组与正常组在各项检测指标上无差别合为A_1组。OVX、PX能使大鼠学习记忆能力降低，PX+OVX＞PX＞OVX＞A_1，使海马CA_(1-4)区分子层、腔隙层、辐射层ACh E阳性纤维密度减少，使海马、DG、扣带回、杏仁复合核、隔区、纹状体细胞凋亡显着增多，均PX+OVX＞PX＞OVX＞A_1，丘脑背内侧核、耽细胞凋亡在1’x、Wx、叫－。0W组无显着差别，但比AI组显着增多。八I组在上述区域偶有凋亡。各组上述区域均不伴胶质细胞增生。使隔区hx、Be卜2表达上升，但hx／Be卜2比例上调。叫。0似＞PX＝OVX＞AI。使OG内外分子层突删SYN免疫活性显着降低，Px＋OVX＞PX＞OVX＞A；，中分子层无变化。2．假手术组与NS组无DG损害、无凋亡，NS组胶质细胞增生极少量、针道处CA：锥体细胞带略有紊乱、中断，两者合为A。组，假OVX仙卜假PX＋AO、假OVX＋PX＋AO各组与汇常＋八 组在各项检狈主标上无差异合 为B组。OVX、PX显着加重了A 6诱发的颗粒细胞带、锥体细胞带的紊乱。变性、缺失，显着增加了胶质细JJki士 生及纠月凋亡，均 PX＋OVX＞PX＞OVX＞B。 使Bax表达水平升高，Be12表达水平下降。Bax／Be12比例上调。使 损伤区 DG内外分于层突触 SYN免疫活性显着降低，PX＋OVX＞PX＞OVX＞AZ川，中分子层无显着变化。 3．假手术组与NS组无DG损害、无凋亡，NS组胶质细胞增生极少量。针道处 CA』锥体细胞带略有紊乱／。11断，两者合为 A。组。正常＋AO、Ez叱。M”I”八、Ez＋MI”＋叩各组凋亡、颗粒细胞带、锥体细胞带缺损依次显着D轻，＊＋A6、MT＋AO、E。＋M”l”＋八各组损伤区胶质细胞浸润比正常＋A6 组显着减轻，但这叁组间无显着区别，使Bax表达水平下降，Bcl－2表达 水平升高，Bax／Be12比例下调。 结论： 1．OVX、PX使大鼠的学习记忆能力叫显减退，联合作用强于单独作用， l’X强于OVX。这与OVX、I’X所致的海马AChl｛阳性纤维密度减少、DG突触可塑性显着降低、多个记忆相关脑区细胞凋亡增加有关。E、MT对广泛的记忆相关脑区神经细胞有影响且存在区域不均衡性。在这些记忆相关脑区OVX、叫诱发的凋亡似与炎症级联反应无关。2．A b让入海马、U（。J“致神经细胞7］M亡。OVX、PX使凋亡增多与使Bax／Ilo 12比例上调有关。八日注入引起的神经毒性与胶质细胞增生成正相关，说明其毒性作用可能与炎症级联反应有关。ovx、PX加重A 0神经毒性并使损伤诱发的代偿性突触生长能力下降，与OVX、PX加重胶质 细胞增生相关。3．L m’减轻A6神经毒性，’）减轻胶质细胞增生引发的炎症级联反应 －3－有关，使凋亡减少与使Bax／Be 12比例下凋有关。4．PX或＊”比叫X或巳对神经毒作用的影响强，联合作用更强，其具体机理不清。因【、m”抗神经毒机制既有相同又有不同之处，但两者在各个方面作用，鲜有实验资料比较。 老年期尤其阿尔茨海默病（川〕）病人，卜 W均大幅下调，过往均侧重两者单独研究。本实验的联合研究结果为八D病因探索及治疗提供了新视窗。
杨云[2]2008年在《甘草苷抗阿尔茨海默病作用及机制研究》文中研究说明甘草为豆科多年生草本植物甘草、光果甘草、黄甘草、胀果甘草的干燥根及根茎,始载于神农本草经,列为上品。现已证明,甘草除具有镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等作用外,还能增强机体免疫功能,防治病毒性肝炎、抗癌、抗艾滋病。其主要有效成分是多种叁萜化合物和多种黄酮类化合物。本实验室在前期的研究中通过体外药物筛选实验首次发现甘草水提主要有效成份之一黄酮类化合物甘草苷(liquiritin,LQ)为对人乳腺癌细胞系(human breast carcinoma cells MCF-7)基本无增殖作用的雌激素β受体(ERβ)选择性激动剂,推测其可能像雌激素激动剂一样影响阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)相关的多个病理环节的,同时还能避免雌激素致癌副作用。至今为止,未见LQ针对AD的神经保护及营养作用方面的文献报道,本研究从分子水平、细胞水平和整体动物水平研究其作用及作用机制,为开发新类型的治疗AD药物提供实验依据。1.甘草苷对原代海马神经细胞的保护及营养作用采用大鼠原代海马神经元Aβ25~35损伤模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞活力、流式细胞术检测神经细胞凋亡、荧光探针法检测细胞内钙离子浓度和活性氧(ROS)水平,试剂盒检测乙酰胆碱酯酶(AchE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)活力考察LQ神经保护作用;通过考察LQ诱导海马神经元轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用。研究结果显示10μmol·L-1 Aβ25~35显着降低细胞的存活率,明显升高细胞上清LDH值;显着升高细胞内钙离子水平和ROS值;诱导细胞凋亡发生,凋亡率达(27.67±1.57)%。预先给预0.1、1和10μmol·L-1浓度的LQ处理细胞6小时,可显着抑制Aβ25~35导致的细胞死亡,明显降低LDH值,能够明显降低Aβ25~35导致的细胞内钙离子浓度升高及ROS增多,流式细胞检测凋亡率分别降低到(22.06±1.35)%、(14.68±1.39)%和(10.28±0.46)%,阳性药雌激素(E2)能够有效降低细胞凋亡率至(6.19±1.00)%,提示LQ能够像雌激素一样拮抗Aβ25~35导致的细胞凋亡。雌激素受体(ER)完全阻断剂ICI 182 780可以部分阻断LQ的抗细胞凋亡作用,说明LQ抗Aβ的神经保护作用至少部分是通过ER途径实现的。细胞增殖试验结果表明,10-4～10μmol·L-1浓度范围的LQ作用72h后细胞并未增殖,排除LQ因对细胞增殖而提高细胞存活率作用。酯酶测定结果显示,LQ能够明显抑制AchE活力,对BuChE没有明显的抑制作用。提示LQ可能通过抑制AchE活力来对AD的治疗起到一定的作用,而且可以避免外周胆碱能系统的副作用。LQ能够显着增加神经生长因子(NGF)介导的海马神经元轴突延长,特异性的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂能够部分阻断该作用。另外,LQ可以诱导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元。因此,LQ可明显减轻Aβ25~35导致的大鼠原代神经细胞损伤作用,同时甘草苷对原代海马神经元有营养作用。2.甘草苷抗炎作用将带有7个串联NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-NF-κB-SEAP和含潮霉素质粒pTK-HygB采用脂质体共转染法转入人胚肾(HEK293)细胞中,用潮霉素B筛选稳定表达克隆细胞株,进一步用脂多糖(LPS)诱导报告基因分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)表达的阳性克隆。采用此阳性克隆细胞株验证LQ对NF-κB信号通路的抑制作用。实验结果显示,0.1、1、10μmol·L-1浓度的LQ对LPS诱导的NF-κB信号通路的抑制率分别为(61.5±1.1)%、(79.6±2.0)%和(90.8±2.1)%,表明LQ对NF-κB信号通路有抑制作用。其抗炎作用可能是可能是LQ神经保护作用机制之一。3.甘草苷对小鼠学习记忆的促进作用昆明小鼠60只,随机分为正常对照组、模型组、哈伯因阳性对照组、LQ高、中、低各剂量组,每组10只。氢溴酸东莨菪碱腹腔注射制备小鼠记忆获得障碍模型,采用行为药理学试验方法——跳台和Morris水迷宫考察LQ对东莨菪碱所致学习记忆障碍的改善作用,评价小鼠空间学习能力;试剂盒检测小鼠全脑组织匀浆上清胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和血清丁酰胆碱酯酶(BuChE)活力。采用免疫组化法测定脑M1受体含量,HE染色观察脑组织是否病变,尼氏染色观察脑神经细胞。研究结果显示,5mg·kg-1氢溴酸东莨菪碱腹腔注射明显造成了小鼠空间学习记忆障碍,显着缩短跳台实验中测验阶段小鼠的潜伏期,明显增加错误次数;水迷宫上台潜伏期显着延长。哈伯因和LQ明显延长小鼠跳台潜伏期,减少错误次数;显着缩短水迷宫实验中小鼠找到安全台的时间。生化指标测定结果显示,哈伯因和LQ能够显着降低氢溴酸东莨菪碱所致脑组织AchE活性升高和升高东莨菪碱所致ChAT活性降低,但仅高剂量的LQ组血清BuChE较模型组有轻微减少,提示LQ能够够提高ChAT活性,抑制AchE活性,从而使Ach含量增多而促进胆碱能神经功能,且可能无外周胆碱能系统副作用。小鼠腹腔注射5mg·kg-1氢溴酸东莨菪碱后脑组织M1受体密度明显降低,而给予哈伯因和LQ组小鼠的M1受体密度较东莨菪碱组明显升高。升高脑内M1受体密度可能是LQ改善或增强小鼠胆碱能系统功能的作用机制之一。尼氏染色结果显示,LQ具有增加或维持原有正常大脑神经元细胞数量,减少东莨菪碱所致脑海马神经元细胞的损害、衰退或坏死等现象的出现。说明LQ具有改善小鼠大脑神经细胞的作用,从而改善小鼠学习记忆的作用。综上所述,LQ具有潜在的抗阿尔茨海默病作用,其机制可能与拮抗Aβ25~35的细胞毒(减少细胞凋亡、拮抗细胞内钙离子超载、降低细胞内活性氧升高程度)、选择性抑制乙酰胆碱酯酶和促进M1胆碱受体表达、抑制由NF-κB介导的炎症和增强神经生长因子的神经营养作用有关,作用特点在于拮抗损伤和神经营养作用并举,从而有可能从根本上逆转AD病情,并且LQ对AD起到一定的多靶向治疗作用,可能被开发为新一代高效低毒的抗AD药物。
张欢[3]2008年在《梓醇对拟老年性痴呆大鼠的保护作用研究》文中指出本论文旨在研究梓醇对于Aβ_(1-42)导致的拟AD大鼠的认知与记忆能力的影响及其对胆碱能系统功能的调节作用。实验中通过立体定位注射的方法将Aβ_(1-42)注射到海马建立拟AD大鼠,并通过皮下注射梓醇(10mg/kg,连续5天)进行预防和治疗。应用Morris水迷宫实验考察梓醇对拟AD大鼠认知与记忆能力的影响,发现Aβ_(1-42)使大鼠的自主活动和探究能力、被动学习记忆和空间认知能力下降。梓醇治疗或预防后,明显改善模型大鼠的学习记忆能力,表明梓醇对Aβ_(1-42)诱导的拟AD大鼠具有保护作用。为了进一步考察梓醇对Aβ_(1-42)诱导的拟AD大鼠的保护作用,对大鼠海马病理切片进行了苏木精伊红(HE)染色,并对海马和皮层乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱转移酶(ChAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na~+-K~-ATP和Ca~(2+)-ATP酶活性进行了测定。结果显示模型大鼠神经元细胞稀疏,细胞核固缩,而梓醇能够减轻Aβ_(1-42)所致的病理损伤;梓醇可以降低AChE与LDH的活性,提高Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-ATP酶活性与ChAT的表达。表明梓醇能够保护大脑海马中胆碱能系统免于损伤并且修复皮层与海马中的能量代谢障碍。以上结果表明,梓醇对Aβ_(1-42)诱导的拟AD大鼠的保护作用是通过修复能量代谢障碍进而调节胆碱能系统的功能来实现的。
陈玉静[4]2008年在《金思维提取物对拟AD模型大鼠脑内tau蛋白磷酸化途径的影响》文中进行了进一步梳理目的:建立散发性老年性痴呆(SAD)大鼠模型,应用具有益气活血、补肾化痰作用的中药复方提取物金思维进行治疗,观察金思维对该模型行为学、海马神经元超微结构、tau蛋白磷酸化相关酶类以及胰岛素信号转导通路相关蛋白表达的影响;探讨金思维治疗AD的作用机理,为指导临床应用和开发新药提供理论和实验依据。方法:将实验动物随机等分6组:假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组和金思维大、中、小剂量治疗组。采用双侧脑室注射微量链脲佐菌素(ICV-STZ)的方法建立拟AD大鼠模型。模型成功后,治疗组分别予盐酸多奈哌齐和金思维(分为大、中、小叁个不同剂量)进行叁个月的治疗,同时模型组和假手术组给予等体积的双蒸水。采用Morris水迷宫、免疫组织化学、Western blot、电镜以及图像分析技术等手段,观察模型鼠行为学、海马CA1区形态学的改变,分别检测海马组织tau蛋白磷酸化位点(Ser199/202)和相关酶类(GSK-3β、PP-2A、PP-1),以及胰岛素信号转导通路相关蛋白(IR、IGF-I、IRS-1、IRS-2)的含量和表达水平。结果:1金思维能明显改善ICV-STZ模型大鼠出现的学习记忆障碍:定位航行试验中,模型组大鼠平均逃避潜伏期和游泳距离较假手术组明显延长(P<0.05或/P<0.01),金思维各剂量组和盐酸多奈哌齐组平均逃避潜伏期和游泳距离较模型组明显缩短(P<0.05/P<0.01);空间探索试验中,模型组与假手术组比较,原平台象限活动时间明显缩短(P<0.01);金思维各剂量组与模型组比较,原站台象限活动时间均明显延长(P<0.01),且与盐酸多奈哌齐组相比无显着性差异。2 ICV-STZ模型组大鼠海马组织存在胰岛素信号转导通路障碍:IR、IGF-I、IRS-1、IRS-2的含量和表达水平均下调(P<0.01),金思维各剂量组均可不同程度的上调这些蛋白的含量和表达(P<0.05/P<0.01)。3与假手术组相比,ICV-STZ模型组大鼠在Ser199/202位点磷酸化水平明显升高(P<0.01),非磷酸化水平明显降低(P<0.01);而金思维各剂量组和盐酸多奈哌齐组在此二位点的磷酸化水平较模型组显着降低(P<0.05/P<0.01),非磷酸化水平显着升高(P<0.05/P<0.01),尤以大、中剂量组突出。4 ICV-STZ模型组大鼠海马CA1区微管出现断裂和溶解,金思维可修复断裂或溶解的微管;与假手术组相比,模型组蛋白激酶GSK-3β的表达明显升高(P<0.01),磷酸酶PP-2A、PP-1表达明显下降(P<0.01);金思维各剂量组GSK-3β的含量和表达水平较模型组显著降低(P<0.05/P<0.01),PP-2A和PP-1的含量和表达水平显着升高(P<0.05/P<0.01),与假手术组接近。结论:1 ICV-STZ模型大鼠存在胰岛素/ IGF-I信号转导异常以及学习记忆功能障碍,该模型可成功地模拟SAD的病理特征。2金思维提取物可明显改善tau蛋白Ser199/202位点的磷酸化程度,从而防止了过度磷酸化tau蛋白的产生及其带来的毒性作用;金思维能够保持蛋白激酶和磷酸酶表达平衡,确保海马神经元tau蛋白的正常磷酸化,保护微管结构,防止轴突损伤。3金思维可改善胰岛素/ IGF-I信号转导通路,发挥胰岛素及IGF-I营养和保护神经元的功效,从而恢复和促进学习记忆功能。
陈晓宇[5]2013年在《玉郎伞多糖抗痴呆作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)是老年痴呆症的首要病因,是一多发在老年,以近期记忆障碍为主要临床症状,以老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)和神经元丢失为主要病理改变的进行性神经变性疾病,严重影响患者的认知功能、记忆功能、语言功能、视空间功能、社会生活能力、个人生活能力和情感人格等,其病因和发病机制尚不清楚。目前受到广泛认同的病因和机制主要有以下几种学说：神经递质缺陷；钙稳态失调；自由基损伤；基因突变；能量代谢障碍；神经细胞凋亡；兴奋性递质毒性；淀粉样蛋白(Ap)沉积等。玉郎伞(Millettia pulchra Kurz var laxior(Dunn) Z.Wei, YLS)是广西壮族习用药材,有补气、补血、提高免疫力、抗衰老、抗应激等作用,可强身健体、消除疲劳,主要用于老年健忘、小儿智力低下等疾病的治疗,亦用于体弱多病及病后、产后虚弱等的滋补。本研究从玉郎伞提取多糖成分,并对玉郎伞多糖[Millettia pulchra Kurz var laxior(Dunn) Z. Wei polysaccharides, YLSP]抗痴呆作用及机制进行了研究。1、正交法优化YLSP提取工艺及含量测定方法的研究葡萄糖的检测浓度在15.12-65.52μg·mL-1范围内与吸光度呈现良好的线性关系,结果精密度高,平均加样回收率为98.25%,RSD=1.72%；通过提取条件的正交试验发现,浸泡3小时、加10倍量水、提取3次,每次3小时条件下YLSP得率最高。因此,通过优化提取条件,能够提高YLSP的得率和纯度。苯酚-硫酸法准确度高、稳定性好,可作为YLSP的含量测定方法。2、YLSP对AP25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用采用AP25-35诱导PC12细胞损伤作为AD细胞模型,通过MTT比色法测定分析细胞存活率；倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态改变,测定细胞突起率、突起平均长度；分光光度法检测PC12细胞细胞培养液和(或)细胞内的SOD、GSH-Px和NOS活性,GSH、MDA、NO和LDH的含量；流式细胞仪测定PC12细胞内ROS、钙离子的含量及线粒体膜电位(MMP)。结果显示：Aβ25-35对PC12细胞具有明显的损伤作用,增加细胞死亡率,减少细胞突起率,缩短细胞突起长度,镜下表现出明显的凋亡损伤形态,细胞培养液和(或)细胞内的NOS活性及NO、MDA、ROS、 LDH和钙离子含量明显升高,而SOD、GSH-Px活性及GSH的含量明显降低,MMP也明显降低。YLSP能在一定程度抑制Aβ25-35对PC12细胞的损伤作用：降低细胞死亡率,增加细胞突起率,延长细胞突起长度,镜下凋亡损伤形态显着改变,细胞膜上微绒毛增多,空泡减少,明显降低PC12细胞细胞培养液和(或)细胞内的NOS活性及NO-、MDA、ROS、LDH和钙离子含量,明显提高PC12细胞细胞培养液中及细胞内SOD、GSH-Px活性及GSH的含量,明显提高MMP水平。提示YLSP可能是通过减少脂质过氧化产物的形成、增加抗氧化酶的抗氧化活性,增强细胞总的抗氧化活力而发挥抗痴呆作用。3、YLSP对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的保护作用采用流式细胞仪、DAPI染色方法观察测定PC12细胞凋亡率,Real-time PCR测定PC12细胞凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax及Caspase-3mRNA表达。结果显示：Aβ25-35能明显增加PC12细胞的凋亡,促凋亡基因p53、Bax、 Caspase-3的mRNA表达含量明显升高,抑凋亡基因Bcl-2基因的mRNA表达含量明显降低。YLSP能显着减少Aβ25-35引起的PC12细胞凋亡,降低细胞凋亡率,降低促凋亡基因p53、Bax、Caspase-3的mRNA表达含量,增加抑凋亡基因Bcl-2mRNA表达含量。提示YLSP可以拮抗Aβ25-35引起的PC12细胞凋亡,逆转上述基因的表达,从而起到抗凋亡的作用。4、YLS1'对SAMP8小鼠额叶、海马神经元Caspase-3表达及活性、Tau蛋白磷酸化的影响采用快速老化小白鼠(senescence accelerated mouse prone8, SAMP8)作为AD动物模型,通过免疫组化的方法观察YLSP对SAMP8小鼠额叶、海马的病理变化,神经元细胞Caspase-3的表达及tau蛋白磷酸化水平的影响。结果显示：SAMP8小鼠额叶、海马神经细胞凋亡明显,Caspase-3阳性细胞数、Caspase-3活性和Tau (pSer202)阳性细胞数均明显高于SAMR1对照小鼠。YLSP能显着减少SAMP8小鼠额叶、海马神经细胞Caspase-3和Tau (pSer202)阳性细胞数,降低Caspase-3活性,提示YLSP能通过抑制凋亡,拮抗Tau (Ser202)的异常磷酸化而发挥抗痴呆的作用。综上所述,YLSP可能是通过清除自由基、对抗氧化应激反应,减少Ca2+内流及LDH释放、提高线粒体膜电位水平,抑制p53、Bax、Caspase-3基因mRNA表达,促进Bcl-2基因的mRNA表达,拮抗Tau (Ser202)的异常磷酸化等机制而达到抗痴呆作用。本文研究认为YLSP可能是治疗神经褪行性疾病如AD的有前景的候选化合物。
罗兰[6]2009年在《肉苁蓉总苷对Aβ_（25-35）所致Alzheimer病的影响及其机制研究》文中研究表明目的：从新疆盐生肉苁蓉中提取肉苁蓉总苷(Glycosides of cistanche, GCs)。建立Aβ25-35诱导Alzheimer病(AD)动物模型及细胞模型,探讨GCs对Aβ25-35所致Alzheimer病的影响及其机制。方法：1.采用小鼠脑室内一次性微量注射凝聚态Aβ25-35,建立拟AD样小鼠模型实验分组：假手术组、Aβ25-35模型组、VitE阳性药组(50mg·kg-1)、给GCs组(给药组)：GCs低剂量组(62.5mg·kg-1)、GCs中剂量组(125mg·kg-1)、GCs高剂量组(250mg·kg-1)。于造模手术前7天开始灌胃给药,共17天,术后10d,通过被动回避性跳台实验,测定AD小鼠的学习记忆能力；制备脑组织匀浆,按试剂盒方法检测脑组织SOD活性、MDA含量及GSH-Px活性；Tunel法检测脑细胞凋亡;免疫组化SABC法检测Bax/Bal-2水平的表达。2.采用脑立体定向技术向大鼠海马背侧处注射凝聚态Aβ25-35,建立拟AD样大鼠模型实验分组：假手术组、Aβ25-35模型组、VitE阳性药组(40mg·kg-1)、给GCs组(给药组)：GCs低剂量组(40mg·kg-1)、GCs中剂量组(80mg·kg-1)、GCs高剂量组(160mg·kg-1)。于造模手术前4天开始灌胃给药,共14天,术后10d,通过被动回避性跳台实验和电迷宫实验,测定AD大鼠的学习记忆能力；制备大鼠海马区组织匀浆,按试剂盒方法检测海马区组织SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性及AchE活性；电子显微镜观察海马CA1区神经元超微结构及细胞内Ca2+含量;HE染色和Bielschowski's镀银染色法观察海马CA1区神经元的病理变化；免疫组化技术测定大鼠海马CA1区神经元tau蛋白Ser199/202和ser396位点磷酸化水平的表达,免疫蛋白印迹技术检检测海马神经元tau蛋白Ser199/202和ser396位点磷酸化水平、磷酸化总tau蛋白水平的表达和磷酸化GSK-3β的活性变化。3.采用体外培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞,Aβ25-35诱导PC12细胞,建立AD细胞模型实验分组：正常对照组(PC12细胞)、Aβ25-35模型组(终浓度20μmol·L-1)、VitE阳性药组(终浓度10μmol·L-1)、GCs不同剂量组：低剂量组(终浓度为25μg·mL-1)、中剂量组(终浓度为50μg·mL-1)、高剂量组(终浓度为100μg·mL-1)。用甲氮甲唑蓝MTT法检测细胞存活率的变化、分光光度法检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、碘化丙啶(PI)和AnnexinV双标染色流氏技术(FCM)检测细胞凋亡率及用酶联免疫技术检测Caspase-3活性。结果：1.GCs对Aβ25-35所致Alzheimer病小鼠模型学习记忆的影响1.1在学习记忆实验中,模型组出现学习记忆障碍,错误次数明显多于假手术组(P<0.01),GCs中、高剂量组与模型组相比,显着减少错误次数(P<0.01)；模型组与假手术组相比脑组织SOD活性降低、MDA含量增高,GSH-Px活性降低(P<0.01),GCs中、高剂量组与模型组相比脑组织SOD活性增高,MDA含量降低,GSH-Px活性升高(P<0.01),结果接近阳性对照组；1.2 Aβ25-35注射小鼠侧脑室10天后,光镜下观察,模型组脑组织内有许多凋亡细胞,Bax表达增强,Bcl-2表达减弱。GCs低、中、高各剂量组脑组织内凋亡细胞明显少于模型组；Bax表达减弱,Bcl-2表达增强而抑制细胞凋亡2.肉苁蓉总苷对Aβ25-35所致Alzheimer病大鼠海马神经元损伤的保护作用研究2.1在大鼠学习记忆的试验中：与假手术组相比,模型组大鼠对电刺激的反应时间延长、错误次数明显增多(P<0.01),海马组织SOD活性降低,MDA含量增高,GSH-Px活性降低及AchE活性增高(P<0.01))；与模型组相比,GCs低、中、高各剂量组反应时间缩短,错误次数减少(P<0.01)；海马组织SOD活性升高,MDA含量降低,GSH-Px活性升高及AchE活性降低(P<0.01,P<0.05)；2.2 GCs对Ca2+含量的影响：GCs低、中、高各剂量组可使Aβ25-35所致AD模型大鼠海马CA1区中细胞内Ca2+含量降低；2.3 GCs显微结构的影响2.3.1 HE染色：对海马神经元在光学显微镜下观察,模型组可见大量、散在的凋亡细胞,表现为细胞质浓缩,呈淡红色；个别可见核碎裂,核固缩深染,核仁消失现象；神经纤维增粗,肿胀成宽带状或条索状结构。GCs组与假手术组比较,海马CA1区神经元结构基本正常,未见凋亡坏死细胞,结构接近于假手术组。2.3.2 Bielschowski's镀银染色：结果显示模型组海马神经原纤维走行紊乱,增粗、肿胀融合成宽带状,轴突深染,细胞明显损伤,局部神经元大段缺失。GCs各剂量组处理后,海马CA1区神经元损伤明显减轻,神经元结构较完整,神经原纤维排列较规则,神经原纤维无明显增粗、肿胀,尤其是GCs高剂量组,组织结构基本接近于假手术组及阳性对照组。2.3.3电子显微镜观察海马CA1区超微结构：结果显示模型组大鼠海马神经元细胞核明显损伤,细胞基质不均匀,线粒体断裂,有空泡、畸形。突触结构模糊,突触数量减少,神经原纤维排列紊乱,有交错排列,类似神经原纤维缠结现象；GCs不同剂量组与模型组比较,神经元细胞核园,核仁明显,核膜完整,线粒体结构完整,突触丰富,突触数量增多,神经原纤维排列较整齐,接近假手术组及阳性对照组。2.4模型组海马神经元tau蛋白Ser199/202和Ser396位点的磷酸化水平明显高于假手术组(P<0.01),总tau蛋白的磷酸化表达水平也明显增高(P<0.01),磷酸化的GSK-3β的活性明显高于假手术组(P<0.01)；GCs给药组,大鼠海马组织总tau蛋白的磷酸化表达水平下降,tau蛋白Ser199/202和Ser396位点的磷酸化水平明显低于模型组(P<0.01),磷酸化的GSK-3β的活性也明显低于模型组(P<0.01),接近于阳性对照组。3.肉苁蓉总苷对Aβ25-35诱导AD细胞模型的神经保护作用结果与正常对照组比较,模型组显着降低PC12细胞存活率,明显提高48h细胞LDH的漏出量,并显着增加细胞凋亡率,升高Caspase-3的活性(P<0.01,P<0.05)。GCs低、中、高各剂量组与模型组比较,能显着提高细胞的存活率,明显降低48h细胞LDH的漏出量,并降低细胞凋亡率,显着降低Caspase-3的活性(P<0.01,P<0.05),接近阳性对照组。抑制细胞凋亡,发挥对神经细胞的保护作用。结论：1.通过Aβ25-35诱导的拟AD样模型动物的学习记忆功能障碍,自由基清除酶活性降低,脂质过氧化反应增强,细胞凋亡,GSK-3β-P的活性增强,总tau蛋白Ser199/202和ser396位点磷酸化水平的表达增强,引起海马神经元Bielschowski's镀银染色及超微结构的病理特征。说明AD模型制备成功。2.GCs提高拟AD样动物模型的学习记忆能力,改善认知功能障碍,减轻受损细胞的病理改变及海马神经元超微结构的损害,其作用机制可能与其增强自由基清除酶活性,防止脂质过氧化反应,保护神经细胞膜；降低AchE的活性,增强胆碱能神经功能,改善学习记忆功能障碍；并使Bax表达减弱,Bcl-2表达增强,而抑制细胞凋亡,保护神经细胞免受Aβ25-35的损害,逆转AD的病理改变。3.GCs抑制GSK-3β-P的活性,降低tau蛋白Ser199/202和Ser396位点磷酸化水平的表达,维持脑细胞微管的结构,进而抑制NFT的形成,对Aβ25-35诱导拟AD样病变大鼠海马神经元具有明显的保护作用。在AD细胞模型中,GCs通过降低细胞凋亡的关键酶Caspase-3的活性,阻断细胞凋亡通路,保护受Aβ25-35损伤的细胞。GCs抑制GSK-3β-P和Caspase-3的活性的作用,是GCs发挥抗AD样作用的新靶点,其在AD的防治中具有潜在的理论价值。
王景方[7]2014年在《白藜芦醇对阿尔茨海默病模型大鼠治疗作用的机制研究》文中研究说明目的探讨白藜芦醇(Resveratrol，Res)对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠学习记忆能力及海马组织形态学变化的影响及其作用机制研究，以期为抗AD新药开发及临床治疗提供依据。方法100只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和白藜芦醇高、中、低剂量组。采用Aβ双侧海马注射建立AD大鼠模型。通过检测白藜芦醇对AD大鼠Morris水迷宫成绩的影响，从行为学角度研究白藜芦醇对AD大鼠学习记忆的影响；采用HE染色观察造模用药后大鼠海马CA1-CA4区神经元数量及神经细胞形状改变；运用免疫组化SP法检测大鼠海马P-tau蛋白的表达，ELISA法测定海马组织胆碱酯酶和Apo-E4含量。所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析。结果1与假手术组相比，模型组大鼠游出时间和错误次数明显增加（P＜0.01），与模型组相比，Res高剂量组和中剂量组大鼠游出时间和错误次数明显下降（P＜0.05）。2假手术组大鼠海马组织神经细胞着色均匀为浅蓝紫色，排列紧密，胞核完整，核仁深染；模型组大鼠海马组织神经细胞层数和数量减少，细胞间隙变大，排列紊乱，部分细胞体积缩小，细胞核固缩，并有破裂，整个细胞深染成红色；高、中剂量组神经细胞着色均匀，排列较紧密；低剂量组神经元胞质浓染，数量较模型组增多。3与假手术组比较，模型组大鼠海马内P-tau积分光密度（IOD）明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，Res高、中剂量组大鼠海马内P-tau积分光密度明显降低（P＜0.05）。4与假手术组比较，模型组大鼠脑组织内胆碱酯酶活性明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，Res高、中剂量组大鼠脑组织内胆碱酯酶活性显着降低（P＜0.01），Res低剂量组胆碱酯酶活性明显降低（P＜0.05）。5与假手术组比较，模型组大鼠海马APo-E4含量显着升高；Res高、中剂量组与模型组相比大鼠海马APo-E4含量显着下降（P＜0.01），Res低剂量组与模型组相比APo-E4含量明显降低(P＜0.05）。结论1白藜芦醇可改善AD大鼠的学习记忆能力，减少海马神经元丢失。2白藜芦醇的作用机制可能是通过影响乙酰胆碱的代谢，降低P-tau的表达，以及减少APo-E4含量起作用的。
董雯[8]2011年在《阿尔茨海默病模型的建立及多奈哌齐与维拉帕米对其影响的研究》文中研究指明目的:建立大鼠阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型,探讨多奈哌齐与维拉帕米对模型大鼠的疗效及其作用机制,初步观察叁筒互通脑功能仪在动物行为学研究中的应用。方法:成年雄性SD大鼠40只,随机均分至假手术组、模型组、多奈哌齐(0.525 mg/kg)组、多奈哌齐(0.525 mg/kg)+维拉帕米(3 mg/kg)组(简称联合用药组)。使用脑立体定位仪,将1%甲苯胺蓝溶液注入大鼠右侧海马,以确认造模药物的注入部位。在脑立体定位下,微量注射凝聚态β淀粉样蛋白l-40(beta-amyloid peptide l-40,Aβl-40)至右侧海马上述部位以建立AD模型;假手术组注射等量生理盐水。术后,多奈哌齐组每天用多奈哌齐灌胃,联合用药组用多奈哌齐和维拉帕米混合灌胃,假手术组和模型组均用等量双蒸水灌胃,1次/d,持续4周。然后,用Morris水迷宫和叁筒互通脑功能仪测试各组大鼠学习记忆能力。测试结束后,各组大鼠称重并处死,分离大脑皮层及双侧海马,称量海马湿重,分别测定海马组织的AChE活性和NO含量,皮层组织的NOS活性,尼氏染色观察海马CA3区。实验数据以均数±标准差(?x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行处理,P<0.05为具有统计学差异,P<0.01为具有统计学显着性差异。结果:1甲苯胺蓝分布的位置鉴定Aβl-40注射于海马。2行为学变化:Morris水迷宫学习记忆能力变化,同模型组(21.21±5.30)比较,假手术组(15.20±2.32)、多奈哌齐组(15.88±3.06)和联合用药组(15.51±1.93)逃避潜伏游程均缩短,具有统计学显着性差异(p<0.01);同模型组(26.78±4.73)比较,假手术组(36.88±10.20)、多奈哌齐组(34.02±7.76)和联合用药组(36.34±6.52)在原平台象限游泳路程增多,具有统计学差异(p<0.05),其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异;同模型组(25.05%±0.0188)比较,假手术组(36.17%±0.1406)、多奈哌齐组(32.92%±0.0744)和联合用药组(35.54%±0.0405)在原平台象限游泳路程占整个游泳路程比例增加,具有统计学差异,其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异。叁筒互通脑功能仪学习记忆能力变化,同模型组(4.05±2.93)比较,假手术组(1.39±0.69)、多奈哌齐组(2.51±0.69)和联合用药组(2.05±1.08)通过通电的B区所走路程均缩短,具有统计学差异,其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异。3海马系数变化:同模型组(5.40×10~(-4)±0.66×10~(-4))比较,假手术组(7.63×10~(-4)±1.38×10~(-4) )、多奈哌齐组( 7.17×10~(-4)±1.21×10~(-4) )和联合用药组(7.30×10~(-4)±2.00×10~(-4))具有统计学差异,其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异。4 AChE活性变化:同模型组(3.08±1.50)比较,假手术组(0.83±0.46)、多奈哌齐组(1.33±0.58)和联合用药组(1.04±0.54)海马组织AChE活性减弱,具有统计学差异,其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异。5 NO含量变化:同模型组(18.93±2.59)比较,假手术组(12.50±2.39)、多奈哌齐组(14.55±3.69)和联合用药组(13.18±2.26)海马组织NO含量减少,具有统计学差异,其中假手术组和联合用药组具有统计学显着性差异。6 NOS活性变化:同模型组(0.123±0.104)比较,假手术组(0.041±0.027)、多奈哌齐组(0.055±0.048)和联合用药组(0.052±0.033)大脑皮层组织NOS活性减弱,具有统计学差异。7尼氏染色:假手术组海马锥体细胞排列整齐,尼氏体丰富,无明显神经元丢失;模型组海马神经元数目明显减少,锥体细胞排列稀疏、尼氏体少而小,散在分布;多奈哌齐组和联合用药组较模型组海马神经元数目增多,细胞排列整齐,尼氏体丰富且清晰。结论:1向大鼠海马内注射Aβl-40建立的AD模型是成功的。2 AD模型大鼠学习记忆能力明显下降。多奈哌齐和维拉帕米可改善AD大鼠的学习记忆能力,且联合用药更佳。3多奈哌齐和维拉帕米可能通过降低海马组织中AChE活性和NO含量,抑制Ca~(2+)内流使皮层组织NOS活性降低等机制,参与改善AD大鼠认知功能。4叁筒互通脑功能仪可用于动物行为学的研究。
周妍妍[9]2007年在《地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究》文中研究表明老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病，临床主要表现为进行性记忆、理解、判断、定向等认知功能障碍，精神行为异常以及生活能力减退。该病不仅是一种随年龄增长而发病率升高的疾病，而且是一种致残率、致死率很高的疾病，给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担，因而深入探讨AD的发病机制，研究有效的治疗措施是世界瞩目的重大课题。本课题在以往地黄饮子防治AD系列研究的基础上，采用脑脊液药理学方法，通过建立β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的AD细胞模型，运用实时荧光定量PCR、Werstern blot、免疫细胞化学、生物化学及光、电镜技术等先进的检测方法和手段，从细胞及分子水平对地黄饮子防治AD的作用及其机制进行探讨。结果显示：一、地黄饮子可显着改善Aβ25-35损伤引起的PC12细胞形态的改变，减轻细胞膜损伤，增强细胞活力，减少损伤所致的细胞死亡。二、地黄饮子能提高PC12细胞培养液中SOD的活性，上调SODmRNA的表达，降低培养液中MDA的含量，提高自由基清除能力，减少自由基对PC12细胞的损伤。叁、地黄饮子能明显提高Aβ25-35损伤时PC12细胞ChAT的表达，通过减轻胆碱能系统的损害防治AD。四、地黄饮子能抑制Aβ25-35损伤时PC12细胞微管相关蛋白tau的表达，从而起到防治AD的作用。
何疆[10]2016年在《电针改善胶原诱导的小鼠阿尔兹海默病样大脑病变的研究》文中指出目的：由于阿尔兹海默病(AD)的病因不明,至今对其防病和治愈仍显有心无力。随着社会老龄化问题日趋严重,该病己成为阻碍我国经济腾飞的重大因素。鉴于感染与AD发病甚为密切,我们首次探索外周注射胶原乳剂引发的非感染性炎症对大脑AD样改变的可能性,希望破解炎症引发AD的机制。2014年,Nature Medicine刊登一文证明：电针通过多巴胺神经发挥抗炎效应有效治疗模型败血症。基于此,我们提出“电针介导多巴胺神经抗炎逆转AD神经退行性改变”的科学假说,期望从反向论证炎症引发AD的机制。方法：在小鼠双后爪加强注射胶原-弗式完全佐剂(CII-CFA)乳剂2周,诱导阿尔兹海默样大脑病理改变模型；从加强注射第1天起施与电针干预,刺激量为：频率2/15赫兹(HZ),电流强度1毫安(mA),作用时长15分/次。连续针刺足叁里、百会和大椎穴,并分别在针刺1周和2周后解剖取材；采用组织化学染色(HE和镀银染色法)、免疫组织化学(SABC法)、酶联免疫吸附试验(Elisa)、免疫印迹实验(Western blot)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,检测实验小鼠的AD样大脑病理学改变,外周与中枢神经系统(CNS)的炎症因子、缺氧状态、氧化应激水平、线粒体再生程度、自噬和泛素化功能改变。结果：CⅡ-CFA引发的外周炎症可以成功塑造类AD模型,电针通过多巴胺神经介导的抗炎机制成功逆转AD退行性改变。具体结果为(1)加强注射CⅡ-CFA后小鼠后爪产生炎症,出现大量的中性粒细胞聚集。(2)模型小鼠大脑出现Aβ蛋白沉积,神经纤维增粗,缺氧诱导因子(HIF-1)、诱导型NO合成酶(iNOS)和内皮型NO合成酶(eNOS)表达升高,提示造模成功。(3)电针1周后,大脑中Aβ、P-tau、促炎症因子(TNF-α、 IL-8)、HIF-1、自由基损伤产物硝基化酪氨酸(NT)和小胶质细胞特异蛋白(IBA-1)表达上升,抑炎症因子(IL-10)、多巴胺、抗氧化应激指标——褪黑素(MT)和过氧化氢酶(CAT)以及记忆相关神经递质——乙酰胆碱(ACh)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)表达下降,提示此阶段电针加重大脑神经退行性改变;(4)电针2周后,大脑中炎症因子、多巴胺含量、小胶质细胞、缺氧因子、自由基损伤产物、氧化产物、抗氧化应激产物,神经递质含量与1周前呈完全相反趋势,说明电针时效决定对AD的疗效。(5)电针后,线粒体呼吸链成分COX4、AMPK通路激活蛋白SIRT1、自噬特异性蛋白(LC3)和自噬小体形成相关蛋白(Beclin1)持续呈高表达,去泛素化酶UCHL1的表达与TNF-α的表达趋势完全一致,表明电针的损伤作用促进线粒体增殖,激活细胞自噬和泛素化途径。结论：炎症诱导NO爆发驱动缺氧和氧化应激损伤,导致AD的形成。
参考文献：
[1]. 雌激素、褪黑素与记忆相关脑区神经损害的关系及对Aβ神经毒性的影响[D]. 李岩. 第一军医大学. 2001
[2]. 甘草苷抗阿尔茨海默病作用及机制研究[D]. 杨云. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[3]. 梓醇对拟老年性痴呆大鼠的保护作用研究[D]. 张欢. 大连理工大学. 2008
[4]. 金思维提取物对拟AD模型大鼠脑内tau蛋白磷酸化途径的影响[D]. 陈玉静. 北京中医药大学. 2008
[5]. 玉郎伞多糖抗痴呆作用及机制的研究[D]. 陈晓宇. 广西医科大学. 2013
[6]. 肉苁蓉总苷对Aβ_（25-35）所致Alzheimer病的影响及其机制研究[D]. 罗兰. 新疆医科大学. 2009
[7]. 白藜芦醇对阿尔茨海默病模型大鼠治疗作用的机制研究[D]. 王景方. 河北联合大学. 2014
[8]. 阿尔茨海默病模型的建立及多奈哌齐与维拉帕米对其影响的研究[D]. 董雯. 泸州医学院. 2011
[9]. 地黄饮子对Aβ致PC12细胞损伤影响的实验研究[D]. 周妍妍. 黑龙江中医药大学. 2007
[10]. 电针改善胶原诱导的小鼠阿尔兹海默病样大脑病变的研究[D]. 何疆. 广州中医药大学. 2016
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