沈恩允, 王维刚, 李毅, 张胜华, 甄永苏[1]2004年在《内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤细胞侵袭和增殖的抑制作用》文中研究指明背景与目的:侵袭转移是恶性肿瘤细胞的重要特性,Ⅳ型胶原酶(包括基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9)在恶性肿瘤转移扩散中发挥着极其重要的作用。我们通过胞内抗体技术,阻断Ⅳ型胶原酶的分泌,以期达到抑制恶性肿瘤细胞侵袭转移的效果。方法:构建编码可在内质网滞留的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体的表达载体pcDNA3.1-ER.scFv,并转染入人巨细胞肺癌PG细胞系内。Westernblot检测pcDNA3.1-ER.scFv的表达,免疫共沉淀实验分析胞内抗体ER.scFv在PG细胞内与靶蛋白相互作用情况,明胶酶谱检测Ⅳ型胶原酶的分泌,以及体外侵袭和增殖实验。结果:ER.scFv在PG细胞内表达,而且能够识别和结合靶蛋白基质金属蛋白酶9。通过胞内抗体的基因转染,显着抑制了Ⅳ型胶原酶的功能和活性。ER.scFv转染的PG细胞较野生型和空白质粒组,侵袭能力明显降低,抑制率为76.3%(P<0.05),在Matrigel上进行细胞培养,ER.scFv对PG细胞有明显的抗增殖效果。结论:内质网滞留型胞内抗体技术可以在蛋白加工、分泌这一关键通路中抑制肿瘤细胞Ⅳ型胶原酶的活性,进而抑制了肿瘤侵袭和增殖,在肿瘤基因治疗中具有应用前景。
沈恩允[2]2003年在《内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤侵袭转移的抑制作用》文中研究表明对周围组织的侵袭以及远端器官的转移是恶性肿瘤细胞的重要特性，这两个过程都需要一些蛋白水解酶的参与，这其中，Ⅳ型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9)在恶性肿瘤转移扩散中发挥着极其重要的作用。所以我们应用胞内抗体技术，探讨通过胞内抗体与Ⅳ型胶原酶结合，阻断Ⅳ型胶原酶向细胞表面的分泌，达到对恶性肿瘤细胞侵袭转移抑制的效果。胞内抗体技术是指应用基因重组技术在非淋巴细胞内表达具有生物活性的抗体，从而特异性干扰或阻断某些生物大分子的活性或加工、分泌过程，引起细胞的一系列生物过程发生改变。 在本研究中，我们构建了内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因真核表达载体PcDNA3.1.ER.scFv，对有着MMP-2和MMP-9高水平表达和活性的人纤维肉瘤HT-1080细胞系和人高转移性巨细胞肺癌PG细胞系进行瞬时和稳定基因转染，Western blot检测，ER.scFv胞内抗体能够在HT-1080、PG细胞内表达；异种移植实验免疫组化分析得出ER.ScFv在HT-1080细胞内定位性表达；ER.scFv胞内抗体在胞内与靶蛋白MMP-9的结合特异性在免疫沉淀实验中又得到了进一步的证实。用明胶酶谱检测ER.scFv对HT-1080、PG细胞Ⅳ型胶原酶的分泌和活性的影响，结果显示同野生型与PcDNA3.1空白质粒组比较，ER.scFv对MMP-9有明显的抑制作用，对MMP-2有轻度的抑制作用。在同时进行的反明胶酶谱检测中，ER.scFv胞内抗体对TIMP-1、TIMP-2的分泌无影响。随后，我们对肿瘤细胞与侵袭转移有关的多组体外指标进行了研究，ER.scFv胞内抗体对HT-1080、PG细胞体外Matrigel侵袭有高度的抑制作用，抑制率分别为61.8％和76.3％，而对两种细胞的运动移动没有影响。在体外增殖实验中，稳定表达ER.scFv的HT-1080、PG细胞在普通培养板的生长无明显改变，而在Matrigel的增殖却有明显的抑制。同野生型与PcDNA3.1空白质粒组比较，稳定表达ER.scFv的HT-1080／V细胞对基质的粘附没有明显改变，对同种及内皮细胞的粘附却有明
沈恩允, 王维刚, 张胜华, 甄永苏[3]2006年在《抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对人巨细胞肺癌PG细胞侵袭的抑制作用》文中进行了进一步梳理目的探讨内质网滞留型胞内抗体对Ⅳ型胶原酶分泌及其对人巨细胞肺癌PG细胞侵袭的抑制作用。方法构建了编码胞浆和内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶抗体的表达载体pcDNA3.1-CP.scFv和pcDNA3.1-ER.scFv。对人巨细胞肺癌PG细胞系进行基因转染。以Western blot检测pcDNA3.1-CP.scFv和pcDNA3.1-ER.scFv的表达,明胶酶谱检测PG细胞Ⅳ型胶原酶分泌情况,Matrigel实验检测细胞侵袭。结果CP.scFv和ER.scFv胞内抗体在PG细胞内表达,ER.scFv对Ⅳ型胶原酶分泌具有显着的抑制作用,对基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的抑制率分别为85.7%和51.2%;而CP.scFv对Ⅳ型胶原酶分泌无抑制作用。ER.scFv编码基因转染的PG细胞与野生型和空白质粒组比较,对体外侵袭有明显的抑制,抑制率为76.3%;而CP.scFv编码基因转染的PG细胞未显示出有抑制作用。结论内质网滞留型胞内抗体技术可以在蛋白加工、分泌通路中抑制Ⅳ型胶原酶的活性,进而抑制肿瘤侵袭,可能在肿瘤基因治疗中具有重要的应用前景。
陈勇[4]2008年在《抗Cyclin D1胞内抗体与p16联合抗肿瘤效应研究》文中进行了进一步梳理细胞周期蛋白Cyclin D1和周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂p16分别是细胞周期G1/S转换的正负调节因子。在正常情况下,Cyclin D1和p16保持平衡,但在肿瘤细胞中,却存在Cyclin D1的过量表达和p16的广泛失活。由于Cyclin D1的过量表达和p16的失活在肿瘤细胞中同时存在,而且它们的下游分子都是CDK4/6,所以同时抑制Cyclin D1的活性和恢复p16的功能,可以使对CDK4/6的抑制作用得到迭加,因此开展它们的联合治疗可能是一个可行的基因治疗策略。胞内抗体技术是基于抗体工程和胞内信号传导而衍生出来一项新的实现细胞内重要靶蛋白表型敲除的技术。在实验中,我们将前期构建的靶向Cyclin D1的内质网滞留型的胞内抗体基因和野生型p16基因分别单独和联合导入Cyclin D1过量表达和p16纯合缺失的MCF-7细胞中。实验发现,这些外源基因在细胞中都得到表达,并且表达的胞内抗体能与细胞内的Cyclin D1结合。同时发现,它们的转染都能引起细胞G1期的阻滞,诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖,而且联合转染比单独转染效果更显着。这为基因的联合治疗开辟了新的途径,具有一定的应用价值。
参考文献：
[1]. 内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤细胞侵袭和增殖的抑制作用[J]. 沈恩允, 王维刚, 李毅, 张胜华, 甄永苏. 癌症. 2004
[2]. 内质网滞留型抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对肿瘤侵袭转移的抑制作用[D]. 沈恩允. 中国协和医科大学. 2003
[3]. 抗Ⅳ型胶原酶胞内抗体对人巨细胞肺癌PG细胞侵袭的抑制作用[J]. 沈恩允, 王维刚, 张胜华, 甄永苏. 中华肿瘤杂志. 2006
[4]. 抗Cyclin D1胞内抗体与p16联合抗肿瘤效应研究[D]. 陈勇. 吉林大学. 2008