张玲[1]2004年在《杏转化抗寒基因的初步研究》文中进行了进一步梳理杏是我国栽培面积较大的果树之一,但由于早春低温的急剧变动常使杏的花芽、花,甚至幼果受冻害,产量和经济效益受到极大的损失,因此杏常有“十年九不收”之说。利用花粉管通道法和离子注入法转化外源基因,操作简单、方便,不需要复杂的仪器和组织培养,迄今已在棉花、水稻、大豆、小麦、黄瓜、番茄和茄子等作物上取得一定成绩,为植物基因工程育种开辟了一条新的道路。本研究分别以杏优良品种金太阳、美特杏杂交授粉后代为供体,采用花粉管导入法和离子注入法将葡聚糖苷酶基因(BG2)、松树DNA片段、云杉DNA片段和比目鱼基因(afp)导入受体,取得以下结果。1.金太阳杏♀×美特杏♂杂交和美特杏♀×金太阳杏♂导入DNA后,杏果实的发育基本不受影响。2.切除花柱对座果率的影响较大;果实含糖量普遍较对照高。3.不同基因型对嫁接成活率、茎节长度和枝叶生长量影响最大,以金太阳和美特杏最适合采用离子注入法转化外源基因。4.金太阳杏和凯特杏叶片普遍较对照增厚,美特杏叶片较对照变薄。低浓度氮离子处理后,叶色正常;中等浓度处理后叶色变浅,稍发白;高浓度处理的叶色发暗。高浓度氮离子处理的叶片变异比较大,叶片基部严重缺刻呈小叶状,叶尖锐尖,状似利剑,中裂,叶片双脉,叶脉两侧严重不对称。5.注入不同的基因或DNA片段对气孔保卫细胞的大小和叶片的大小影响显着不同。6.春梢茎段最佳的升汞灭菌时间为9分钟,硬枝水培芽最适宜的升汞灭菌时间为6分钟。7.改良的WPM培养基最适合杏的分化和增值。附加BA 0.6—1.0mg/L最利于杏的增值,BA浓度高于1.0mg/L增值效果下降。
牛庆霖[2]2011年在《‘岱玉杏’抗寒基因AmEBP1转化试验研究》文中指出杏(Armeniaca vulgaris Lam.)系蔷薇科(Rosaceac)杏属植物。杏原产于我国,种质资源极为丰富,是中国栽培历史最久的果树之一。但由于春季低温和晚霜,常使花芽、花,甚至幼果受冻,产量和经济效益受到极大的损失,因此选育抗寒性强的品种有重要意义。近十几年来,国内外迅速发展的转基因技术已经在育种中得到了广泛的应用,并且已经取得了长足发展,转基因技术已经成为改良品种最有前途的技术方法之一。花粉管导入法在农作物上取得了令人鼓舞的成绩,但是在果树上应用的研究却极少,由于果树育种周期长,不断地摸索试验快速有效的育种方法是很有意义的。本研究对杏进行了抗寒基因转化试验研究,并成功将沙冬青抗寒基因AmEBP1通过花粉管成功转化入岱玉杏T0代中,并对组培苗进行生理指标测定,其主要研究内容如下:1.岱玉杏×凯特杏杂交亲和,坐果率达到57%,果实横径、纵经、侧径可达4.081cm,4.403cm,4.412cm,均高于自然授粉的岱玉杏,表现出现杂种优势。不同处理导入DNA对转化率有一定影响,切除1/2柱头滴注外源DNA能提高转化率,但对坐果率有一定影响;花粉基因处理的坐果率较正常花粉坐果率下降9.5%;2.采用不同浓度DNA导入对转化率有一定的影响,当DNA浓度分别为200μg/mL、500μg/mL、800μg/mL时,坐果率分别为21.5%、26.4%、12.7%,坐果率没有随着外源DNA浓度高低而逐渐升高或降低,而是以500μg/mL的浓度相对比较高,3个DNA浓度处理的坐果率远低于对照;导入DNA浓度在500μg/mL时,切除花柱1/2时转基因成功率最高,在第7天时能达到75%,60天后为30%,但基因导入后随时间的延长,阳性比率仍然出现下降的趋势,说明基因丢失仍然存在。3.采用改良的WPM培养基,对岱玉杏不同胚发育时期培养结果得出,在改良WPM培养基上,PF值高于0.3时才能形成愈伤,附加激素BA在0.6 mg/mL-0.8 mg/mL时,愈伤诱导率最高,在PF=0.7时成苗率最高;成熟胚在MS和改良WPM上均能萌动,但有叶小、卷曲、畸形、或玻璃化,根芽生长不良的情况出现。4.在对岱玉杏,大果杏,凯特杏,金太阳4个品种成熟胚培养结果表明,低温处理的时间和4个品种杏的萌发呈现正相关,随着低温处理时间的延长,4个品种杏的萌动迹象越发明显,成苗率都有提升。大果杏在处理60天后,大田出苗率基本可以达到100﹪,是最易成苗的品种。岱玉杏无论种胚腐烂率很高,在60﹪以上。5.本研究得到岱玉杏转基因苗木。16株经过PCR检测阳性,Southern杂交检测有11个分别出现1-3条杂交带,另一个转基因植株中只出现了微弱的杂交带,证明AmEBP1基因已经整合到T0代组培苗中。6.通过对转基因株系与未转基因株系组培苗抗寒生理对比,转基因株系(组培苗)LT50为-4.37℃<对照-4.12℃;SOD、POD活性与可溶性蛋白含量在-5℃到-10℃之前达到最大值,总体均有先升后降的趋势,并有转基因高于对照组的;游离脯氨酸含量总体上均呈现“上升”的趋势;随着温度的降低MDA含量增加,-5℃之后转基因植株增幅速率明显低于对照。7.试验饲喂转基因杏果后,鸡群与羊群没有明显病症,测量血常规得出对照组与转基因组血液中红细胞数、白细胞数、血红蛋白量、红细胞压积、淋巴细胞比率,其指标值均无显着差异(P>0.05),并未对动物造成病害。
牛庆霖[3]2014年在《沙冬青ErbB3结合蛋白基因转化杏的研究》文中进行了进一步梳理中国杏种资源丰富分布广泛，由于北方春季有低温和晚霜，容易使杏花、幼果受冻，产量和经济效益受到极大损失，因此选育高抗寒杏具有重要的意义。传统的植物育种方法在改善植物耐寒性方面取得的成功非常有限，利用传统方法选育抗寒杏，育种周期长，且抗寒效果不显着，且杏树的抗寒研究多集中在抗寒生理方面。利用现代生物学技术对杏进行抗寒性选育，更具高效性和针对性，可以加速高寒杏新种质的选育进程。植物低温条件下，体内蛋白质的合成与其抗寒性密切相关。沙冬青ErbB3结合蛋白基因（AmEBP1）是沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus Cheng f．)中与低温胁迫相关的基因，低温条件下，能够抑制植物细胞翻译因子（eIF2a）的磷酸化，调控eIF2a的活性，保证蛋白质的正常合成，从而提高植物抗寒能力。本研究以沙冬青总RNA反转录所得cDNA第一条链为模板克隆了AmEBP1基因编码区序列，通过酶切和连接反应构建载体并转化到杏幼胚中，经幼胚培养获得转基因植株，并对转基因植株的耐寒性能进行了研究，为培育抗寒杏新种质打下了基础。主要研究如下：1）以沙冬青总RNA为模板，RT-PCR方法克隆得到目的基因AmEBP1，PCR与测序结果表明，与GeneBank公布的AmEBP1的cDNA（DQ519359）序列长度一致;2）构建原核表达载体pET-22b-AmEBP1转化大肠杆菌，0℃时转化AmEBP1的大肠杆菌存活率是转化空载体的3倍，可以看出，表达了AmEBP1的大肠杆菌具有明显较强的抗寒性；3）大果、岱玉等6个早熟杏品种，不完全花比率差异显着，其中以大果杏不完全花比率最低，仅为11.62%，红荷包最高，高达80.91%，岱玉50.08%，金太阳27.22%，新世纪25.43％；座果率大果杏最高可达29.34％，其次是金太阳，岱玉坐果为7.23%，最低的为红荷包；4）以大果杏花期后30d幼胚为材料，建立了杏幼胚培养体系。WPM培养基作为大果杏的基本培养基，蔗糖10g·L-1，琼脂8g·L-1，pH调至5.8；幼胚诱导芽丛的培养基选择WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1；芽团生根培养基宜选择WPM+NAA0.1mg·L-1+6-BA0.8mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培养基；5）构建植物表达载体pCAMBIA2300-AmEBP1，利用花粉管通道与基因枪结合方法转化大果杏，转化后的幼胚材料先接种WPM+Kan50mg·L-1筛选后，转移到WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1培养基上诱导分化扩繁，再将扩繁材料转移到生根培养基上培养成苗；6）将WPM+Kan50mg·L-1筛选后的材料进行PCR检测，得到6个阳性植株；进一步Southern检测得出此6株系分别出现1-3条杂交带，Southern结果说明AmEBP1基因已经整合到这6个株系的基因组DNA中；将单拷贝转基因株系1、6进行RT-PCR结果显示AmEBP1基因在转录水平上表达；且多带扩繁后目的基因能稳定存在芽切苗中；7）将转基因阳性株系1、6在分化培养基上诱导芽丛，再将芽丛切成带个芽的芽团PCR检测，剔除阴性，继续分化诱导到一定基数，在诱导生根成苗，进行下一步抗寒试验。抗寒试验结果显示：相同低温（-4和-8℃）条件下，转基因植株均比对照表现出较高的成活率；随着处理温度的降低，转基因株系REC与MDA含量始终低于对照植株，但可溶性蛋白含量明显高于对照；转基因植株的低温半致死温度（LT50）比未转基因对照低2.13℃；抗寒试验的其他酶活、可溶性物质的含量结果也说明，转AmEBP1大果杏有较强的抗寒性（比对照）。8）转基因大果杏根际土与周生植物总DNA中未发现目标基因；转基因株系和非转基因株系的土壤微生物优势菌群种类相同，数量无显着差异。
参考文献：
[1]. 杏转化抗寒基因的初步研究[D]. 张玲. 山东农业大学. 2004
[2]. ‘岱玉杏’抗寒基因AmEBP1转化试验研究[D]. 牛庆霖. 山东农业大学. 2011
[3]. 沙冬青ErbB3结合蛋白基因转化杏的研究[D]. 牛庆霖. 山东农业大学. 2014