南京疾病预防控制中心 江苏南京 210003
【摘 要】目的 比较一步法逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、巢式PCR及实时RT-PCR检测手足口病标本的临床价值。方法 收集56人份手足口病住院标本、120人份轻症标本，分别采用RT-PCR、巢式PCR及RT-PCT检测，比较3种检测方法的阳性率。结果 轻症患者标本主要感染病原体为CA16，而住院案例标本主要感染EV71型。实时RT-PCT及巢式PCR检测住院、轻症患者标本EV71型阳性率均明显高于一步法RT-PCR，比较有显著性差异（P＜0.05）；实时RT-PCT及巢式PCR检测住院、轻症患者标本CA16型阳性率明显高于一步法RT-PCR，比较有显著性差异（P＜0.05）。结论 在检测手足口病标本时可采用巢式PCR及实时RT-PCR生物学检测方法，诊断敏感性与准确率较高，有推广价值，但一步法RT-PCR有其独特优势，因此可结合临床实际合理选择生物学方法。
【关键词】分子生物学方法；手足口病标本；检测
手足口病为儿科常见疾病，多因肠道病毒诱发，＜5岁婴幼儿为高发群体，可快速传播，传播途径包括密切接触于被粪便、疱疹液、唾液等污染的玩具、奶具及毛巾等。本病发作后会导致发热，且口腔、手足等部分发生溃疡或皮疹，个别患儿还会发生严重并发症如无菌性脑膜炎、心肌炎及肺水肿等，导致患儿死亡。研究称有20多种肠道病毒会诱发手足口病，其中最常见地为肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒（COX）A16型[1]。临床于2008年5月在传染病管理中纳入手足口病，发现流行期内手足口病重症及聚集性案例经常发生[2]，为对引起儿童疱疹与发热的病原予以准确及时诊断，以便及时救治，需采用分子生物学方法检测标本。现详细探讨3种分子生物学方法检测手足口病标本的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
采集56人份手足口病住院标本、120人份轻症标本，均符合临床手足口病诊断标准：口腔黏膜疹，可发展成溃疡；伴或不伴随发热；皮疹，部分出现水泡，主要发生在足底、手掌；伴或不伴中枢神经系统症状[3]。住院标本中男性32例，女性24例，年龄为7个月~6岁，平均年龄为（3.1±0.6）岁；轻症标本中男性63例，女性57例，年龄为5个月~5岁，平均年龄为（2.8±0.4）岁。2组性别、年龄构成比较无显著性差异（P＞0.05），具有均衡性。
1.2 检测方法
1.2.1 采集标本 采集上述手足口病患儿1~2g粪便，在灭菌带盖大便盒中放置；棉签将患儿鼻咽部准确擦拭，即刻在2~3mlHanks液的灭菌试管中浸泡，若有必要可留取2~3ml脑脊液，均冻存于-70℃冰箱中。
1.2.2 提取病毒，行RNA扩增 应用大连宝生物生产的病毒核酸提取试剂，严格按照说明书操作。分别用一步法RT-PCR、巢式PCR及RT-PCT检测手足口病标本，应用PCR扩增仪及试剂盒，并应用相关软件对CA16及EV71引物序列予以排列，将适当的检测条件选出，以检测标本。按照如下反应条件检测：45℃逆转录时间为45min，预变性于94℃条件下，持续2min，变性20s并退火于45℃条件下，持续25s后延伸于71℃条件下，持续30s，循环共开展36次，再延伸于72℃环境下，持续10min。设计阴阳性对照，重复验证3次。最后实时RT-PCR组结果用荧光PCR分析仪分析，一步法RT-PCR及巢式PCR结果则用1.5%脂糖凝胶电泳分析。
1.3 统计学方法
用软件SPSS20.0统计学处理上述数据，计数资料表示方法为n（%），卡方检验行组间对比，比较有统计学差异用P＜0.05表示。
2 结果
轻症患者标本主要感染病原体为CA16，而住院案例标本主要感染EV71型。实时RT-PCT及巢式PCR检测住院、轻症患者标本EV71型阳性率均明显高于一步法RT-PCR，比较有显著性差异（P＜0.05）；实时RT-PCT及巢式PCR检测住院、轻症患者标本CA16型阳性率明显高于一步法RT-PCR，比较有显著性差异（P＜0.05）。见表1。
3 讨论
手足口病为小儿常见传染性疾病，可发病于一年四季，无明显地区性。本病暴发流行后会散在发病，主要发病场所为托幼机构。研究表明近年来手足口病发病趋势逐年提升，其中2011年出现高峰可能关联于病原体构成变化及气候环境变化[3]，另有研究称气象因素温湿度可直接对病原体在环境中生存时间及其繁殖产生影响[4]，因此手足口病发病密切关联于气候因素。近年来手足口病主要病原体为CoxA16及EV71，其构成变化可能会导致疫情波峰变化。本组结果表明在轻症患者标本主要感染病原体为CA16，而住院案例标本主要感染EV71型，说明感染EV71型后果更加严重，可能导致死亡，因此需强化病原体监测工作，对其类型变化予以密切观察，并开展季节性预防，尤其是夏秋两季。研究称手足口病发病主要群体为不超过5岁儿童，1~3岁婴幼儿为高发群体，提示本病发生可能关联于低年龄儿童有较低的免疫水平；该研究该提出男童发生率高于女童，可能因为男童户外活动次数更多及性别生物特性[5]，本组男性发病数量总体高于女性，但比较无显著差异（P＞0.05），还需临床进一步深入研究。
当前重症手足口病主要致病原为EV71型，该病毒会对中枢神经系统产生侵犯后诱发无菌性脑膜炎、脑干脑炎及脊髓灰质炎样麻痹等多种严重症状，均关联于神经系统；CA16一般症状较轻。住院重症案例多为托幼儿童，散居流动儿童也较多，主要死亡原因为发病后未及时就诊与治疗。临床诊断肠道病毒的常规病原学方式为分离培养病毒，细胞病变后对特异性组合抗血清予以利用开展中和试验。RD、Vero及Hep-2细胞均可对EV71予以接种和分离，但细胞培养周期较长，且成本较高，且病毒自身存在抗原漂移，会交叉免疫反应于CA16，因此无法与疾病暴发流行期间大量标本检测及疫情处理所需相满足。因此临床近年来逐渐采用实时RT-PCT、巢式PCR及一步法RT-PCR等检测手足口病标本，可在12h内鉴定标本病毒，故而应用广泛。
研究称分子生物学方法不同在检测手足口病标本的效率、敏感度及特异度也存在差异，部分无法及时将病原准确确定，导致重症患儿无法及时接受治疗[6]。本组结果表明巢式PCR与实时RT-PCR检测手足口病标本阳性率明显高于一步法RT-PCR，与报道相近[7]。巢式PCR与一步法RT-PCR需电泳鉴定，步骤繁琐，耗时长，一般扩增与检测耗时为4~5h，且暴露式操作扩增产物，污染风险高。实时RT-PCR操作步骤简易，一般可在2h内完成，且直观显示结果，与定量所需相满足，但其病原检出率比巢式PCR略微要低，但操作期间污染易被控制，减少发生假阳性现象。巢式PCR与实时RT-PCR均可双重特异性识别DNA链，有较高的敏感性与特异性。
一步法RT-PCR检测阳性率较低，可用于检测病毒含量高的病毒株及测定扩增后的大分子量DNA序列，便于分析分子进化，及时找出有无抗原漂移现象，同时了解诱发重症手足口病的EV71型是否关联于核苷酸序列，这是其独特优势[8]。
综上所述，在检测手足口病标本时可采用巢式PCR及实时RT-PCR生物学检测方法，诊断敏感性与准确率较高，有推广价值，但一步法RT-PCR有其独特优势，因此可结合临床实际合理选择生物学方法。同时疾病预防中心也要加强手足口病健康宣教，提升手足口病疫苗接种率，宣教定期消毒与清洁小儿用具及玩具的必要性，积极预防和治疗手足口病，一旦发病及时隔离，并科学识别重症案例，避免爆发流行及院内交叉感染。患儿就诊后医师需细致了解病史，重点了解周边有无类似案例及接触史，体检时密切观察肺部与生命体征、皮疹及神经系统情况等，普通案例门诊治疗即可，叮嘱家长密切观察病情变化；严重案例需留院观察，对病情变化予以密切关注，及时处理异常，避免损伤重要脏器功能，若有必要还可进入ICU接受治疗，以改善预后，确保小儿生命安全。
参考文献：
[1]粘志光.不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究[J].中国卫生产业，2016，13（16）：105-107.
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[3]关桂英，王风朝.不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用分析[J].当代医学，2014，5（22）：133-133，134.
[4]周卫岭，胡雪梅.2011~2013年某市手足口病标本病毒检测结果分析[J].医学信息，2014，（12）：114-116.
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[8]郝春生，杨永娟，宋衍燕等.不同CA16流行株的相关生物学和VP1基因的分子生物学研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32（3）：199-204.
论文作者:郑颖
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2017年4月第7期
论文发表时间:2017/8/15
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