武发菊[1]2007年在《阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究》文中指出阿维菌素是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,由阿佛曼链霉菌产生,其发酵产物共有8个组分,其中B1组分生物活性最为显着和有效,在医药、农业和畜牧业生产中,具有良好的应用价值和广阔的市场前景。本论文采取选育高产菌株以及优化培养基和培养条件的方法来提高阿维菌素的摇瓶发酵效价,从而为产业化的大规模生产提供了可靠的工艺参数。首先通过对原始菌株AV-0的复壮,获得了一株发酵效价较高且遗传稳定的分离株AV-3。以AV-3为出发菌株,探索了紫外线、亚硝基胍的单一诱变,紫外线和亚硝基胍的复合诱变。结果发现:从致死率看,出发菌株AV-3对紫外线比对亚硝基胍更敏感;从诱变后的正突变率看,亚硝基胍诱变的效果好于紫外线;从效价提高的幅度看,经紫外线诱变后,效价比原来提高8%,亚硝基胍诱变后效价提高了8.8%;而紫外线和亚硝基胍联合的复合诱变效果又甚于单一诱变剂的诱变,效价提高了11%。另外,我们采用一种新型的诱变手段,即运用中科院兰州近代物理研究所提供的重粒子加速器,尝试用能量为80.55Mev/u的12C+粒子束辐照阿维链霉菌,试验中设计了不同的剂量组。结果发现,诱变后的单菌生长较快(约2-3d即开始出现菌落);菌落形态、大小与处理前比较变化明显,菌落明显较处理前大;突变幅度广,正突变率高,突变株种类多;经摇瓶初筛、复筛,运用高效液相色谱仪测定效价,最终分离到四株高产菌株,并经传代试验,遗传稳定性较好,其中最高发酵效价比出发菌株AV-3提高了50%。以上紫外线和亚硝基胍诱变、重离子束辐照诱变筛选到的菌株均能不同程度地提高试验菌株的产素能力,其中重离子束辐照效果较好,效价提高显着而且运用离子束诱变具有离子源种类多和生物材料的局限性小等优点,是一种较好的诱变育种方法。另外,在摇瓶水平进行了阿维菌素发酵培养基优化的研究,探索了不同碳源、不同氮源、无机盐、微量元素和前体等单因子对阿维菌素生物合成的影响。结果表明:碳源以糊精和可溶性淀粉的混合碳源为最佳,氮源以酵母粉和黄豆饼粉的混合氮源为最佳,无机盐K_2HPO_4·3H_2O和KCl在低浓度时对于抗生素的合成均有一定的促进作用,而MgSO_4·7H_2O和CaCO_3的加入则起抑制作用,同时研究了微量元素和前体物质对于发酵的影响。最终在单因子试验的基础上,通过统计学分析确定了一套发酵培养基的最佳配方,即糊精11%、可溶性淀粉1%、酵母粉2.5%、黄豆饼粉0.5%、K_2HPO_4·3H_2O 0.06%、KCl 0.1%、CoCl_2·6H_2O 4mg/L、丙酸钠6mmol/L,其发酵效价提高了12%。另外,对阿维菌素发酵的条件也进行了考察,即菌株的装料量、温度、pH值、发酵时间、接种量等。发现250ml叁角瓶中装料量为40ml, pH值为7.2,接种量为4%时,在温度28℃条件下发酵10d,阿维菌素B1a发酵效价最高。同时,研究了阿维菌素发酵液中生物量、pH值、总糖含量、氨基氮含量等的代谢变化。
张毅[2]2008年在《阿维菌素高产菌株的选育》文中提出阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,在医药、农业和畜牧业生产中有良好的应用,并且具有广阔的市场前景。本文对工业生产阿维菌素的阿维链霉菌菌株进行了基因工程改造研究。orfX,aveR,afsR,afsQ1Q2是链霉菌中发现的四个正调控基因。本试验将上述4个正调控基因通过接合转移法导入到阿维菌素工业生产菌株Z1中,检测其对阿维菌素产生的影响。试验结果表明orfX基因有明显促进作用,阿维菌素产量提高了约30%;aveR基因作用不十分明显;afsR和afsQ1Q2基因使产素水平明显降低。本试验进行了工业阿维链霉菌原生质体制备研究。试验结果显示阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为:250ml叁角瓶装有35ml含0.5%甘氨酸的YEME培养基,孢子悬液接种,28℃,200r/min培养40h;3000r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/ml的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50min完成原生质体制备。50%PEG1000做促融剂,原生质体融合率最高。利用OLM菌株(Apr~R)和Z1菌株(Spc~R)进行连续融合发现,经过连续5轮融合,融合效率可达41.6%,并达到稳定。以四株不同产量和来源的阿维链霉菌作为出发菌株,通过过五轮基因组重排处理,比较发现,随着基因组重排的深入,重组群体中高效价菌株的比率例在逐步提高。五轮基因组重排后得到了2株高产菌株,菌株F5-64和F5-170,其效价分别达到3322 ug/mL和3328 ug/mL。
李佳玮[3]2006年在《阿维菌素高产菌株的选育和透明颤菌血红蛋白基因的克隆表达研究》文中研究说明阿维链霉菌是阿维菌素的产生菌，由于其发酵液较粘稠而导致溶氧较差，因此溶氧成为阿维菌素产量提高的限制因素之一。本研究旨在通过在阿维链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因(vgb)来改善氧的传递，进而改善菌体生长，提高阿维菌素的产量。 对阿维链霉菌原生质体的制备和再生条件进行优化。首先考察了影响阿维链霉菌原生质体形成的因素，发现在R_2YE、YMB、SM、YEME几种链霉菌常用的液体培养基中，通过R_2YE培养基收获的菌体形成原生质体的效率最高。菌丝培养采用二级培养，即用R_2YE培养基28℃培养48h，转种到补加0.25％甘氨酸的R_2YE培养基中，28℃继续培养20～24h，溶菌酶作用浓度为2mg·mL~(-1)，30℃酶解30min，在此条件下，原生质体的制备量为6.3×10~8个·mL~(-1)原生质体的再生率最高，达到1.98％。 应用双亲灭活原生质体融合技术选育阿维菌素高产菌株，得到了一株高产菌株Streptomyces avermitilis F32，阿维菌素总发酵单位达3904μg·mL~(-1)，其中B_(1a)组分产量较高，达1016μg·mL~(-1)，较出发菌株产抗单位提高了117.1％。 利用链霉菌质粒pIJ702和带vgb的大肠埃希菌质粒pUC19-vgb，构建大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒pSY702。将该质粒以PEG-介导的方式转入阿维链霉菌原生质体中，利用硫链丝菌素抗性筛选转化子。CO结合差光谱法检测在420nm处有吸收峰，表明血红蛋白已在阿维链霉菌中表达且具有生物活性。通过高效液相色谱(HPLC)对转化子摇瓶发酵产物进行分析表明，转化子仍然合成阿维菌素，而且转化子在供养不足时生产阿维菌素的能力比对照更强。说明含vgb的转化子比不含vgb的对照菌更能耐受贫氧环境，合成阿维菌素效率更高，在贫氧环境中表现出其优越性。 以筛选到的转化子S．avermitilis T26为实验菌株，对发酵条件进行优化。结果表明随着发酵时间的延长，阿维菌素产量不断提高，发酵10d阿维菌素的产量最高；选用18h的种龄、15％的转种量可使阿维菌素的产量提高。通过均匀设计优化发酵培养基配方，发酵培养基(％)为：玉米淀粉8.0，黄豆饼粉0.7，花生饼粉1.1，酵母粉0.875，酵母膏0.2，玉米浆0.35时，使得S．avermitilis T26的发酵效价提高了38％，B_(1a)发酵单位达到1206μg.mL~(-1)。
王海彬[4]2003年在《阿维菌素菌种的选育及发酵工艺优化的研究》文中研究说明作为目前发现是为有效的杀虫剂之一的阿维菌素，其生产水平的提高关键在于阿维菌素高产突变株的获得以及发酵工艺的优化。 本实验对阿维菌素的生产菌株采用了半理化的筛选方法：出发菌株R-V-22经UV、NTG和MMS叁轮的处理，同时分别以氮亮氨酸、氯乙酸钠和2-去氧葡萄糖作为筛子，最后得到高产抗性突变株AV-4-56，其阿维菌素B1a的产量提高了60％左右。 对高产菌株AV-4-56的培养条件进行优化，结果表明：AV-4-56相对于出发菌株R-V-22生长速度快，通气量要求偏高，以剪切力的敏感度降低，可以耐受0.1％的KH_2PO_4。加入0.1％的磷酸镁的捕铵剂和5.0ppm的Zn2+和40ppm的Co2+可以提高阿维菌素的产量。同时采用正交试验法确定最佳碳氮源的比例，并且在发酵优化条件的基础上，研究了种子的种龄和接种量的影响，最后，AV-4-56在摇瓶培养条件下比出发菌株R-V-22的阿维菌素产量提高了70％。 考察了高产菌株AV-4-56和出发菌株R-V-22在2吨种子罐和80吨发酵罐的代谢特性。结果表明：高产菌株AV-4-56比出发菌株R-V-22的代谢来得快，它在发酵培养48hr左右pH就下降到6.0附近，氨基氮消耗到整个发酵周期的最低水平，而菌丝浓度增加到最高水平，其生长转为产素期。但消沫剂用量和动力需求量都比出发菌株R-V-22要高10％以上。高产菌株AV-4-56比出发菌株的每天糖耗速率要高1.0％左右，因而其在80吨发酵罐的10天发酵周期内，阿维菌素B1a的产量可以达到2500ug／ml以上，比出发菌株R-V-22的产量提高了60％。
阎浩林, 何汉洲, 梁丽丽[5]2002年在《阿维菌素高产菌株的选育Ⅰ》文中研究指明目的 :全面了解阿维菌产生菌S .avermitilis的生长特性并获得阿维菌素的高产菌株。方法 :以S .avermitilisY2 0为出发菌株 ,考察该菌株的菌落特征和发酵特性 ,分别利用紫外线 (UV)、亚硝酸 (HNO3)及亚硝基胍 (NTG)并结合L -异亮氨酸 (L -Ile)诱导等手段对出发菌株Y2 0进行诱变处理。结果 :获得高产阿维菌素变异株H336 ,发酵单位达到 852 μg/mL。结论 :与出发菌株相比 ,突变株阿维菌素的产量稳定 ,发酵单位提高了 1 0倍以上。
宋渊, 曹贵明, 陈芝, 李季伦[6]2000年在《阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B_1的鉴定》文中进行了进一步梳理自阿维链霉菌(StreptomycesavermitilisATCC31272)中分离出了3种不同类型的菌株,其中只有产灰色孢子的菌株能产生阿维菌素(Avermectins),摇瓶发酵单位约100μg/mL。经高频电子流诱变和对发酵培养基的改进,选育出Sa76菌株,其摇瓶发酵单位可达1000μg/mL。从其菌丝体中提取纯化了阿维菌素B1晶体,其紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱(1HNMR和13CNMR)和质谱与国外报道的一致。Sa76菌株又经2次亚硝基胍诱变,筛选出发酵单位2000μg/mL以上的Sa768菌株。在此基础上,再次用亚硝基胍对Sa768菌株进行了诱变,获得Sa769菌株,结合发酵条件的优化,其发酵单位可高达3500～4000μg/mL。
陈川[7]2002年在《阿维菌素高产菌株的选育》文中研究表明本文首先介绍了阿维菌素的生物合成与研究概况。阿维菌素是迄今已发现最有效的杀昆虫剂、杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一。阿维菌素为一种典型的次级代谢产物，生物合成途径复杂，现在基本上对每一步合成途径的基因及其所编码的酶都有所了解。这使得人们可利用基因工程技术来构建工程菌，增加有效组分的产出和生产新型的阿维菌素。除了用生物方法，人们还通过化学修饰来产生抗虫活性更高的阿维菌素衍生物。本论文主要为诱变筛选阿维菌素高产菌株，并对筛选到的高产菌株进行了培养条件与培养基成分的优化，为工业化生产打下基础。 本研究探讨了阿维链霉菌严重的自然分化现象，在平板分离中存在4种不同的菌落形态分化菌株，其中灰色孢子菌落占大多数，发酵效价最高；只有气生菌丝的白色菌株和只有基内菌丝的光秃型菌落占少数，还有一些灰色菌落中有白点，这些菌落发酵效价较低。这种有白点的菌落形态与灰色菌落类似，可能为放线菌中形成的异核体。白色菌株和光秃型菌株经传代培养比较稳定，灰色有白点的菌落在传代过程中不断分化出灰色、白色、光秃型菌落，直接造成遗传的不稳定性，使生产效价不稳定，为生产的大害。 在育种研究中应用了离子注入、亚硝基胍和紫外线诱变方法，并对这几种诱变方法进行了比较，发现离子注入的诱变效果最好。离子注入后阿维链霉菌的菌落形态发生了很大的变化，其中灰色，边缘整齐，中间突出有开裂的菌落和为灰色，边缘波浪状，中间突出有放射状开裂的菌株产量较高。通过两轮诱变筛选出最终得到了8株发酵效价提高并且遗传性能稳定的突变株。分别是A208、C56、B260、Z138、N10、N301、S3、E3，总效价比出发菌株提高了16.9％-63％。突变株Z138总效价最高达3900μg／ml。其中突变株N10的B_(1a)的比例提高了9.6％。 以筛选到的突变菌株Z138为实验菌株，通过摇瓶确定了发酵的工艺条件。发酵时间9-10天开始迅速合成阿维菌素；温度28℃最好；接种量12％使阿维菌素的产量较高；转速210转／分较为适合产生阿维菌素的通气量；选用30小时左右的种 MX龄可使阿维菌素的产量提高。！t离子抑制阿维菌素的合成：在一定浓度下KZHPO4和MgSO。对阿维菌素的合成没有影DDI（u。 培养基的优化经历了两个步骤，首先迎过单因素实验了解了培养基成分对D：I给菌素发酵的影响，然后通过正交分析对发酵培养基进行了优化，认为玉米淀粉，处上讲粉与玉米浆对阿维菌素的合成影响较大，并仰定了”g／1的玉米淀粉、Zg／1玉米浆，10 g／l黄豆饼粉的发酵培养基。发酵培养基优化后使突变株 ZI3 8的阿细菌素产量达到了4200ug／ml左右。
林海[8]2008年在《阿维菌素优良菌株的选育和整合型vgb载体的构建与表达》文中研究说明阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一类结构相似的十六元大环内酯类齐墩果糖双糖衍生物,在大规模高密度发酵中,氧的供应往往是影响细胞生长和产物产量的关键因素之一,因此溶氧成为阿维菌素产量提高的限制因素之一。本研究通过将透明颤菌血红蛋白(vgb)基因整合到阿维链霉菌基因组中,提高阿维链霉菌的摄氧效率、改善其生长状况,提高阿维菌素的产量。通过自然分离选育,筛选到了2株产阿维菌素能力较高且稳定的菌株:S-avermitilis62和S.avermitilis 64,其中B_(1a)效价分别为547μg·mL_(-1)和512μg·mL~(-1)。应用双亲灭活原生质体融合技术选育阿维菌素高产菌株,得到了一株高产菌株S.avermitilisR08,阿维菌素总发酵单位达到了2889μg·mL~(-1),其中B_(1a)主份达716μg·mL~(-1),分别较出发菌株S.avermitilis 62、S.avermitilis 64提高30.9%和39.8%。利用链霉菌随机整合质粒pSET152和带vgb的大肠埃希菌质粒pUC19-vgb,构建链霉菌随机整合质粒pLH1001,利用接合转移方法将pLH1001转化阿维链霉菌,利用安普霉素抗性筛选转化子。CO结合差光谱法分析结果表明:在420nm处有一吸收峰。说明转化子细胞中表达了血红蛋白,具有生物活性。采用二级发酵法,将阿维链霉菌(含或不含vgb基因)经种子瓶培养24h后,以7%(v/v)的接种量转接发酵摇瓶,7天后取出测定效价,发酵结果表明,转化子的效价较融合子的效价略低,可能是由于目的片段随机整合到链霉菌基因组中,导致产量下降。对转化子S.aveimitilisT3的发酵培养基进行优化。通过均匀设计优化发酵培养基配方,发酵培养基为:玉米淀粉10;黄豆饼粉0.4;花生饼粉0.6;酵母粉0.8;酵母膏0.20;玉米浆0.30,S.aveimitilisT3的总效价为3298μg·mL~(-1),其中B_(1a)发酵产量达987μg·mL~(-1),比原来提高56.7%。
李永亮[9]2011年在《阿维菌素高产菌株的选育及分批补料发酵工艺的研究》文中研究表明阿维菌素对很多种农作物的害螨及其它害虫都有很高的生物活性,是一种很好的抗生素杀虫、杀螨剂。由于其作用机制独特,可有效防治对一般的杀虫、杀螨剂产生抗、耐性的害虫和害螨,是如今农业害虫综合防治较理想的农药品种之一。阿维菌素作为农药于1985年投入市场,巨大的市场潜力使之成为研究热点。阿维菌素制剂的年产量已达到万吨,是我国微生物农药中年产值最大的品种。随着国内农业和畜牧业的发展及生物农药的普及,阿维菌素的需求必定会稳步增长,发展前景十分广阔。决定阿维菌素发酵生产水平高低的最重要的因素包括叁个方面：菌种、发酵工艺和提取工艺。。目前我国阿维菌素发酵普遍存在产量低、生产成本高等诸多问题。我国国内大多数制药企业阿维菌素发酵水平仅到3000mg/L,严重制约着阿维菌素制药生产企业的竞争能力,限制企业进一步的发展。因此如何提高阿维菌素发酵单位、降低阿维菌素产品的生产成本,已经成为我国目前急需解决的问题。因此选育出阿维菌素高产菌株、优化发酵工艺,提高阿维菌素的发酵单位,具有极其重要的意义。本研究主要进行了两方面的工作：阿维菌素高产菌株的菌种选育和阿维菌素发酵补料工艺的建立。首先,在阿维菌素高产菌株的菌种选育中,选择诱变剂：5-FU和阿维菌素,并结合紫外线诱变的方法,对阿维菌素原始菌株进行诱变育种。研究中,综合考察所选菌株的菌落形态、生物量变化、耗糖速率以及发酵单位等因素,挑选出阿维菌素高产菌株X-28-68。其次,阿维菌素发酵补料工艺确定。采用单因子筛选试验方法,筛选出新菌株发酵所需的最适碳源、最适氮源和磷酸盐种类,并得到最适发酵培养基：单糖B、黄豆饼粉、酵母粉、氮源B、磷酸氢二钾、碳酸钙、硫酸铵及对照的各种微量元素。此培养基利于菌丝的快速生长,产物的提早合成,并为补料工艺创造了条件。随后,在小型发酵罐中进行了碳源、氮源和磷酸盐最适浓度的确定以及连续补料发酵工艺的研究,确定了培养基中各成分的合适浓度、菌种生长的最适pH以及葡萄糖连续补料发酵工艺。小试结果表明,新菌种、新工艺发酵指数可达1.6221,比原有的分批发酵工艺平均发酵指数1.1057提高46.70%。大大提高了阿维菌素的产量。最后,进行了新菌种、新工艺的2m3发酵罐的中试实验。中试结果为：发酵单位达到4680mg/L,提高了15.6%,装料系数提高15%,缩短发酵周期40小时左右,平均发酵指数为1.6486,较原工艺1.1857提高41.12%。但大规模的发酵生产还需进一步的实验。
李燕霞[10]2006年在《阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育》文中研究指明本论文以阿维链霉菌为研究对象,先后使用紫外线及亚硝基胍对出发菌株1-17进行诱变处理,并结合L-异亮氨酸诱导手段进行定向筛选,最后得到B1a组分高产突变株3-6,其阿维菌素Bla的产量较出发菌株提高了12.86%。传代实验表明该菌株的高产性能稳定。对高产菌株3-6的培养条件进行优化,结果表明:斜面培养基成分中酵母粉的产地、斜面种子的培养周期及棉塞的重量对斜面种子的质量及发酵结果的影响程度较大,经分析,得到最适酵母粉产地为湖北,最佳培养周期为8d,最适棉塞重量为7g。通过正交试验优化了发酵培养基配方,发酵产量可提高7.35%。此外,还研究了前体物质丙酸钠的添加对发酵结果的影响,结果表明发酵过程中在培养基内加入一定浓度的前体物质丙酸钠,可以显着提高发酵产量,其中在发酵24h时在培养基中加入2.5mmol/L的前体物质丙酸钠,发酵产量可提高9.89%。考察了高产菌株3-6在3吨种子罐和100吨发酵罐的代谢特性,并对其发酵条件进行了优化。结果表明:通过接种条件的选择和将种子罐温度调整为30℃的改进措施优化了种子罐工艺;通过基础料配方的调整、补料方案的调整和通气量的调整优化了发酵罐工艺,使得总体发酵水平有了较大提高,发酵单位、罐批发酵总量、发酵指数分别提高了14.81%、7.77%、6.92%。
参考文献：
[1]. 阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究[D]. 武发菊. 甘肃农业大学. 2007
[2]. 阿维菌素高产菌株的选育[D]. 张毅. 华中农业大学. 2008
[3]. 阿维菌素高产菌株的选育和透明颤菌血红蛋白基因的克隆表达研究[D]. 李佳玮. 沈阳药科大学. 2006
[4]. 阿维菌素菌种的选育及发酵工艺优化的研究[D]. 王海彬. 浙江工业大学. 2003
[5]. 阿维菌素高产菌株的选育Ⅰ[J]. 阎浩林, 何汉洲, 梁丽丽. 生物技术. 2002
[6]. 阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B_1的鉴定[J]. 宋渊, 曹贵明, 陈芝, 李季伦. 生物工程学报. 2000
[7]. 阿维菌素高产菌株的选育[D]. 陈川. 河北大学. 2002
[8]. 阿维菌素优良菌株的选育和整合型vgb载体的构建与表达[D]. 林海. 沈阳药科大学. 2008
[9]. 阿维菌素高产菌株的选育及分批补料发酵工艺的研究[D]. 李永亮. 河北师范大学. 2011
[10]. 阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育[D]. 李燕霞. 天津大学. 2006