崔林开[1]2004年在《转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究》文中研究指明Bt杀虫基因是目前应用得最为广泛和最有潜力的一个抗虫基因，在虫害的防治中起到越来越重要的作用。目前获得的转Bt抗虫基因植物已达近70种，而新的Bt杀虫基因仍在不断的被分离和鉴定，使得转Bt抗虫基因植物的研究持续、高速发展，因此急需找到一种快速、简便、准确的检测方法。本研究以目前抗虫转基因育种中研究最多的Bt CryIA(C)基因的表达产物为检测目标，在提取出高纯度抗原并制备出高特异性抗体的基础上，系统研究了两种载体上叁种酶联免疫吸附测定方法的检测灵敏度，初步建立起快速、准确的酶联免疫检测技术。研究结果如下： 一．采用多种生化技术提取苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，制备出了高纯度的抗原。首先用碱液(50mM Na_2CO_3，50mM EDTA，3％巯基乙醇)裂解孢晶混合物，调节PH至等电点沉淀出晶体杀虫蛋白，再用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳进一步纯化粗提的杀虫晶体蛋白，经SDS-PAGE电泳分析显示只有一条带，说明获得的分子量约为130KD的杀虫晶体蛋白达到了电泳纯，为制备特异性抗体提供了条件保障。 二．制备出了高特异性的Bt杀虫蛋白抗体和高质量的酶标抗体。用纯化的Bt杀虫蛋白作为抗原免疫白兔，获得了高特异性的抗血清，再经过硫酸铵沉淀和DEAE-52柱层析纯化，提取出了较纯的IgG。采用改良的过碘酸钠法，用辣根过氧化物酶标记IgG制备出了克分子比为2、工作浓度为1：800的高质量酶标抗体。为建立高灵敏度的酶联免疫检测方法奠定了基础。 叁．比较了两种载体上叁种酶联免疫检测方法的灵敏度，初步建立起检测Bt杀虫蛋白的高灵敏度方法。在聚苯乙烯酶标板上的测定结果表明：直接ELISA和夹心ELISA的灵敏度相同，都为0.94ng／孔，但直接ELISA中抗原浓度与OD值间的线性关系呈极显着，夹心ELISA中抗原浓度与OD值间的线性关系呈显着；间接ELISA的灵敏度较前两者低，使用HRP-IgG的灵敏度为15ng／孔，抗原浓度与OD值间的线性关系呈显着，使用AKP-IgG的灵敏度为3.75ng／孔，抗原浓度与OD值间的线性关系呈极显着。在硝酸纤维素膜上的测定结果表明：直接Dot—ELISA和夹心Dot-ELISA的灵敏度相同，都为4.06-8.13ng，间接Dot-ELISA的灵敏度较前两者高，使用HRP-IgG的灵敏度为2.03-4.06ng，使用AKP-IgG的灵敏度为2.03ng。
严吉明[2]2002年在《转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究》文中提出培育和利用抗虫品种是防治作物害虫最经济有效的措施。通过转抗虫基因培育抗虫品种是重要方法之一。此项工作中需要对转基因植物进行鉴定和筛选，因此发展快速、准确、简便的检测技术具有重要的作用和意义。本研究以检测目前抗虫转基因育种中研究最多、获得成效最大的转Bt抗虫基因的表达产物(杀虫蛋白)为检测目标。为此研究了影响抗原和抗体制备的主要因素，制备出灵敏度高的特异抗体，在此基础上开展检测方法研究，掌握影响检测效果的有关因素，从而初步建立起灵敏度高的ELISA检测技术。本研究取得如下结果： 抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素，为了得到产量高、质量好的杀虫晶体蛋白作为抗原，我们研究了Bt菌培养时间、伴孢晶体蛋白裂解液的种类和处理温度与时间对杀虫蛋白提取的影响。结果表明Bt HD-1菌株在趴生长繁殖培养基(Singer等，1968)上，30℃下培养41-55h均可获得大量孢晶混合物。采用50mMNa_2CO_3(含50mM EDTA，3％巯基乙醇，pH10)裂解液和0.04N Na0H的裂解液处理孢晶混合物，均可获得大量的130KD杀虫蛋白。但用0.04N NaOH提取的杀虫蛋白中含有较多杂蛋白。所研究的处理温度和时间对杀虫蛋白提取量和组成无明显影响。 抗原的免疫剂量是影响抗体产生的一个重要因素，免疫剂量过大会引起麻痹反应。为了提高免疫效果，获得较好的抗体。我们采用两种抗原剂量(750ug／只.次和375 ug／只.次)免疫家兔，结果表明所供试的两种剂量对抗血清效价和特异性无明显影响。因此采用任一种剂量免疫家兔均可。本研究制备的抗体用于检测标准抗原，灵敏度可达7.8-16.5ng。 在建立检测方法研究上，采用ELISA间接检测法，测定了两种酶标羊抗兔抗体(辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶)和两种载体(聚苯乙烯酶标板和硝酸纤维膜)对检测灵敏度和样本检测效果的影响。结果表明，在采用纯的杀虫蛋白进行灵敏度检测时，二种酶标抗体和两种检测载体的测定结果非常相近，无明显差别。但在对植物样本检测时，不同酶标抗体和载体则存在差异。表现为碱性磷酸酶标记的抗体优于辣根过氧化物酶标记的抗体。这主要是由于植物样本中存在有内源过氧化物酶的干扰。在两种检测载体上，由于植物样本中存在叶绿素，采用硝酸纤维膜进行Dot-ELISA检测时，叶绿素色斑干扰较大。如何排除叶绿素在D。t－ELISA检测中的影响，尚值得研究。 通过本研究，基本掌握了提取杀虫蛋白作为抗原和兔疫家兔制备抗血清的有关因素和条件，制备出了特异性强的抗体，检测灵敏度可达 7．8刁．6ng。通过检测方法研究，明确了影响检测的一些因素并初步建立起了检测棉叶样本中Bt杀虫蛋白的相关技术。
严吉明, 叶华智, 伍光庆, 张敏[3]2005年在《转Bt抗虫基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究 Ⅲ.酶联免疫(ELISA)间接法检测Bt杀虫蛋白研究》文中提出采用ELISA间接检测法,研究了2种酶标羊抗兔抗体(辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶)和2种检测载体(聚苯乙烯多孔板和硝酸纤维膜)对检测灵敏度和样本检测效果的影响。结果表明,在采用纯的杀虫晶体蛋白进行灵敏度检测时,2种酶标抗体的测定结果非常相近,无明显差别,灵敏度可达7·8~15·6ng。但在检测植物样本时,不同酶标抗体则存在差异。表现为碱性磷酸酶标记的抗体优于辣根过氧化物酶标记的抗体。这主要是由于植物样本中有内源过氧化物酶所致。用硝酸纤维素膜和聚苯乙烯多孔板作载体进行检测纯的Bt杀虫蛋白的效果二者相当。但检测植物样本时,植物中的叶绿素对Dot-ELISA的干扰很大,准确性差。本研究所制备的Bt杀虫蛋白抗体具有高的特异性。
王晓娟[4]2007年在《MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选》文中研究说明在抗虫转基因育种过程中,转基因植株的鉴定、筛选及生物测定是非常重要的环节。本研究从获得的转芥菜胰蛋白酶抑制剂基因(MTI2)拟南芥第一代种子T1开始进行抗性植株的筛选纯化,直到T5代抗性稳定不再分离时结束,结合PCR检测,对通过抗性筛选的转基因植株进行鉴定,获得抗性纯合的转基因植株。随后对转MTI2基因材料和转Bt基因(改良SN19基因)材料进行生物测定,比较和鉴定两种抗虫基因对鳞翅目害虫小菜蛾的抗性水平。筛选出具有较好抗虫性的转Bt基因拟南芥材料,进而对这些材料连续两代回交,并对每代材料进行室内生物测定,分析回交次数对Bt基因抗虫性的影响。主要结果如下:1.对转MTI2基因材料进行连续5代的卡那霉素筛选和PCR检测,共获得100株纯合阳性植株,且每个阳性植株都收获了大量种子。2.两种转基因材料抗小菜蛾生物测定结果显示:转MTI2基因材料不能有效抗虫,仅对害虫生长起抑制作用;转化改良的SN19基因材料抗虫性很强,对小菜蛾有很高的致死率,该基因可作为今后蔬菜抗鳞翅目害虫育种的候选基因。3.通过对Bt转基因材料连续2代的回交分析和生物测定结果显示,回交会使转基因材料的抗虫性下降,而且在回交第二代时下降显着,今后对转Bt基因植物进行回交改良其农艺性状时,应尽量减少回交次数,少次回交转基因材料的抗虫效果仍然保持很高的抗水平。
赵越[5]2016年在《云抗虫（Bt）稻品系螟虫抗性的分子鉴定》文中认为水稻在生产过程中,虫害的发生会造成大量的减产,如何减少虫害成为困扰人们的大问题。采用喷洒杀虫剂的方法来防治害虫,农药残留不仅造成环境污染,而且也会危害人类健康。Bt(bacillus thuringiensis,简称Bt)基因是从苏云金芽孢杆菌中克隆出的针对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫的抗虫基因,经过基因工程方法人工改造,已经获得Cry1Ab/Ac、RCry1C、Cry1C等抗虫的Bt基因,Bt基因的开发利用为水稻抗虫育种提供了新的途径。本论文研究以云南主栽水稻品种楚粳28作为受体,和携带不同类型Bt抗虫基因的“华恢1号”、“RJ-5”和“T1C-19”水稻品种分别作为Bt基因供体材料进行杂交,利用分子标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)技术筛选Bt基因的后代,用楚粳28作为轮回亲本回交3-4代,再自交4代,每个回交世代的受体和自交世代的单株都需要进行Bt基因的MAS筛选,选育成云抗虫(Bt)稻品系。在此基础上,论文研究工作重点集中在云抗虫稻田间自然诱发虫害的抗虫性表型评价,并分别从DNA、RNA和蛋白质分子水平对已经选育成的云抗虫稻品系进行分子鉴定。主要结论如下:1.云抗虫稻螟虫抗性的表型鉴定。2015年景洪早稻及晚稻两季,用已经育成的云抗虫稻1号(楚粳28/华恢1号,携带Cry1Ab/Ac抗虫基因)、云抗虫稻2号(楚粳28/RJ-5,携带RCry1C抗虫基因)和云抗虫稻3号(楚粳28/T1C-19,携带Cry1C抗虫基因)以及受体对照楚粳28为供试材料,采用完全随机设计3次重复的田间试验,以自然诱发螟虫为主进行表型鉴定。结果如下:1)早稻季节螟虫几乎没有发生,未能鉴定出云抗虫稻的螟虫抗性特性;2)晚稻季节螟虫发生严重,具体鉴定结果:云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号和对照的枯心率(二化螟和叁化螟)分别为4.37%、4.25%、1.32%、15.31%,云抗虫稻品系的枯心率极显着(P<0.01)低于对照;云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号、对照的卷叶率(稻纵卷叶螟)分别为18.10%、8.02%和6.14%、42.21%,云抗虫稻品系的极显着(P<0.01)低于对照。利用MAS选育的云抗虫稻品系在螟虫发生严重的晚稻季节中表现出了极显着的螟虫抗性特性。2.云抗虫稻Bt抗虫基因的DNA水平鉴定。采集云抗虫稻和对照的叶片样品,用CTAB法进行DNA抽提,然后进行Bt基因的PCR扩增反应和电泳。电泳结果表明云抗虫稻Bt基因的PCR扩增结果全部呈阳性,对照扩增结果呈阴性。云抗虫稻DNA水平鉴定结果证明Bt抗虫基因Cry1Ab/Ac、RCry1C和Cry1C已经通过杂交导入到受体楚粳28中并选育成云抗虫稻新品系。3.云抗虫稻Bt抗虫基因的RNA水平鉴定。提取云抗虫稻和对照的叶片RNA,检测RNA质量完好后合成cDNA,用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。云抗虫稻Bt抗虫基因的RNA水平鉴定结果表明,Cry1Ab/Ac、RCry1C和Cry1C抗虫基因在RNA水平都得到了表达。证明选育的云抗虫稻品系Bt抗虫基因具有表达能力。4.云抗虫稻Bt抗虫基因的蛋白水平鉴定。先对云抗虫稻和对照进行转基因Bt Cry1Ab/Ac和Bt Cry1C快速检测试纸条的定性检测,检测结果为云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号植株样品均在T线处出现了红色条带,呈阳性;为验证转基因Bt Cry1Ab/Ac和Cry1C快速检测试纸的定性结果,再对云抗虫稻Bt蛋白进行Western blot检测,提取云抗虫稻和对照叶片的蛋白质,通过BCA定量确定所提蛋白浓度,进行SDS-PAGE电泳和Western blot,鉴定结果显示Cry1Ab/Ac蛋白、RCry1蛋白和Cry1C蛋白在云抗虫稻中均得到表达;最后通过ELISA检测确定云抗虫稻中Bt蛋白含量,云抗虫稻1号(Cry1Ab/Ac)的Bt蛋白含量为0.22±0.16μg/g,云抗虫稻2号(RCry1C)的Bt蛋白含量为0.25±0.18μg/g,云抗虫稻3号(Cry1C)的Bt蛋白含量为0.26±0.18μg/g,与其供体之间Bt蛋白的含量几乎一样。蛋白水平检测证明选育的云抗虫稻的Bt基因在蛋白质水平得到了表达,具有和供体材料相同的表达能力。上述结果表明,选育出的3份云抗虫稻品系,云抗虫稻1号(Cry1Ab/Ac)、云抗虫稻2号(RCry1C)和云抗虫稻3号(Cry1C)田间农艺性状表现良好,并表现出螟虫抗性,在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平的分子检测初步证明螟虫抗性来源于Bt抗虫基因的表达及毒杀的证据。这些抗虫品系为云南省抗虫水稻的遗传改良和生产应用提供了基因资源和应用基础。
刘军侠[6]2004年在《转基因741杨的抗虫效应及生态安全性评价》文中研究指明本文以转基因741杨[Populus alba L．×(P．davidiana Dode．+P．simonyi Carr．)]×P．tomentosa Carr．具有不同抗虫性的株系Pb11、Pb29、Pb3、Pb12、Pb17为试验材料，以未转基因741杨作为对照，通过室内群体饲养和单体饲养的方法，系统研究了转基因741杨对舞毒蛾Lymantria dispar L．、杨扇舟蛾Clostera anachoreta(Fabricius)和美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)的抗虫效应及其规律性。并在转基因741杨田间栽培试验林内，对高抗和中抗株系节肢动物群落进行调查，从群落生态学角度，对其释放到环境后可能对节肢动物群落产生的生态风险进行评价，以期为转双抗虫基因741杨的持续合理利用提供科学依据。 本研究在以下几个方面取得了进展： (1)转基因741杨对目标害虫致死效应和生长发育的影响 在室内通过对舞毒蛾、美国白蛾、杨扇舟蛾分别进行群体和单体饲养，观察对幼虫致死效应和生长发育的影响，结果表明：对美国白蛾的抗性最强，对杨扇舟蛾抗性次之，对舞毒蛾抗性最弱。转基因741杨对不同龄期幼虫抗性存在显着差异。转基因741杨的抗性主要表现为对低龄幼虫的毒杀作用，对存活的高龄幼虫生长发育的抑制作用明显，能有效延长幼虫的发育历期，降低发育速率和体重增加速率，减少排粪，导致幼虫生长发育不良，甚至死亡。转基因741杨抗虫持续性可以延缓下一代幼虫的生长发育，甚至影响到未来种群的发生与发展，达到很好的抗虫效果。不同温度下转基因741杨抗虫性不同，随温度的升高，幼虫致死率和生长发育速率升高。 (2)转基因741杨杀虫活性的时空动态及Bt毒蛋白含量测定 分别用转基因741杨不同展叶时间和枝条上不同部位的叶片，室内饲养杨扇舟蛾幼虫，记录幼虫死亡率，计算蜕皮指数，试验结果显示：抗性株系不同展叶时间的叶片，抗虫性不同；枝条上不同叶位的叶片对杨扇舟蛾幼虫抗性不同。用酶联免疫学测定方法定量检测证明，转基因741杨叶片中Bt杀虫蛋白的含量与生物测定结果有很好的相关性，其中抗性株系Pb3中Bt杀虫蛋白的含量最高，依次为Pb11、Pb12。展叶时间长，Bt杀虫蛋白的含量高。室内生物测定和Bt杀虫蛋白的含量测定结果一致。 (3)转基因741杨对昆虫幼虫体内酶的影响 与抗虫试验同步饲养舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫，用转基因741杨不同抗性株系叶片饲养至4～6龄作为酶源材料，测定幼虫羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肤一S一芳基转移酶的活力，表明:用转基因741杨抗性株系饲养的杨扇舟蛾和舞毒蛾幼虫的梭酸酷酶、乙酞胆碱酷酶和谷肤甘肤一S一芳基转移酶的活力表现明显的差异性。其中取食高抗株系Pb29、Pbn和取食中抗株系PblZ的舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫的3种酶活力均明显低于对照。 (4)转基因741杨对节肢动物群落结构组成及变化的影响 通过对转基因741杨田间节肢动物群落中害虫、天敌和中性节肢动物亚群落等不同类群的种类和数量，进行定期、连续的调查，发现转基因741杨林内节肢动物群落物种丰富度明显增加，个体数明显减少，害虫数量降低，中性节肢动物数量增多，天敌的种类和数量都有增加。其中，抗性株系中刺吸昆虫、鳞翅目食叶昆虫的数量明显降低，其它食叶昆虫数量略有上升，中性节肢动物数量的增加为天敌补充了中间寄主，捕食性天敌数量和种类明显增多，寄生性天敌的数量略有减少。抗性株系的物种多样性、均匀度高于对照，而优势集中性指数低于对照，群落结构变得更为合理，自我调节能力更强，生态免疫力较好。 (5)转基因741杨.凋落物的分解以及对土壤动物的影响 本试验通过网袋法测定转基因741杨凋落物分解速率，分别用干漏斗法分离凋落物和凋落物周围土中的中小型节肢动物，用过筛法对凋落物周围土中线虫进行分离，研究凋落物分解对土壤动物的影响，结果表明:转基因741杨凋落物在分解过程中，凋落物及其周围土中的中小型节肢动物的类群和数量较之对照没有明显减少。高抗在节肢动物种类和数量上均有增加的趋势，中抗表现不明显。凋落物分解和对照741杨基本保持同一速率。7一10月份，随着时间的推移，凋落物的分解速率和其中的中小型动物数量基本呈减少趋势。
丁如贤[7]2007年在《Bt和CpTI双价抗虫基因共转化菘蓝提高对害虫抗性的研究》文中进行了进一步梳理本研究构建分别带有CryIA(c)基因和CpTI基因两表达盒的植物表达载体pGBI121S4ABC。采用农杆菌介导转化菘蓝。双基因转化的阳性率二倍体子叶是14.75%,四倍体子叶是16.67%。Southern杂交分析,结果转基因菘蓝出现预期的杂交带,未转化植株没有杂交信号,并都呈单一拷贝。ELISA检测基因的蛋白质表达量,发现CryIA(c)基因蛋白表达量可高达436.33 ng/g, CpTI可达158.31 ng/g。用转基因菘蓝叶片饲喂目标害虫小菜蛾,有两株能完全杀死目标害虫,有4株能部分杀死目标害虫,40%以上的转基因植株具有明显抑制害虫生长的作用。转抗虫基因菘蓝前后有效部位成分含量没有明显变化。
李静[8]2006年在《转抗虫基因（BtCry3A）741杨抗虫性研究》文中进行了进一步梳理为探索转抗虫基因(BtCry3A)741杨对鞘翅目昆虫的抗虫性,本研究以7个转基因株系CC70、CC71、CC31、CC11、CC22、CC84、CC53植株为检测对象,以未转基因的普通741杨为对照,从分子生物学检测、毒蛋白的表达、对鞘翅目昆虫的致死作用和不同外源基因的抗虫选择性4个方面对转抗虫基因(BtCry3A)741杨进行了分析,以期为转抗虫基因株系的扩繁和商品化生产提供科学依据。 根据PCR检测结果可知,转抗虫基因(BtCry3A)741杨7个株系和转双抗虫基因(BtCry1Ac+API)741杨的2个株系均检测到目的基因的存在。Southern杂交分析得出,Bt基因已成功整合到转抗虫基因741杨中。 通过在五月份和九月份对转抗虫基因(BtCry3A)741杨当年生枝上部、中部、下部、韧皮部和木质部进行ELISA检测的结果发现,五月份不同部位的叶片的毒蛋白的分布没有形成一定的规律,而九月份毒蛋白含量成从高到低分布,且五月份的含量高于九月份;两个月份的木质部毒蛋白含量均高于韧皮部,且五月份的含量高于九月份。 通过抗虫性试验得出,柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora(Laicharting))幼虫的死亡率在转基因741杨各株系间差异性很小,各株系对柳蓝叶甲幼虫的致死作用均很强;并且各转基因株系当年生枝上、中、下部叶片对幼虫的致死作用没有形成一定的规律,幼虫的死亡率在1-2d之内均为100%。而在不同的温度下,在35℃下,各株系对柳蓝叶甲幼虫的致死作用最强;而在室温,22℃,28℃下幼虫的存活天数要多于在35℃下的存活天数,幼虫第1d的死亡率也小于在35℃下的幼虫。桑天牛(Apnona germari(Hope))幼虫体重增长均受转基因741杨枝条和木质部的一定影响,用各株系饲养的桑天牛幼虫均没有用普通741杨饲养的体重增长的快,且个体没有用普通741杨饲养的桑天牛幼虫个体大。不同株系间,桑天牛虫体重增长情况不同,存在一定差异。 通过对桑天牛成虫的室外饲养结果可以得出,桑天牛对转抗虫基因(BtCry3A)741杨的其中3个株系不作为产卵对象,其余作为产卵对象的除了CC22产卵粒数明显少于对照。通过接种以后,各株系的当年的存活率均高于对照;但到了第2a调查存活率时,转基因的各株系树体内桑天牛幼虫存活率均小于对照。 检测转不同基因杨树对昆虫的致死作用的选择性,得出转双抗虫基因(BtCry1Ac+API)741杨对柳蓝叶甲幼虫和桑天牛幼虫的生长和发育均没有影响,柳蓝叶甲可以顺利的完成一个世代;桑天牛幼虫的体重增长与用对照饲养的桑天牛幼虫体重的增长趋势相同;转抗虫基因(BtCry3A)741杨对杨扇舟蛾的生长和发育没有影响。
郭艾英[9]2006年在《应用ELISA检测转基因棉花中Bt蛋白的研究》文中研究说明本论文以转Bt(Bacillus Thuringiensis)抗虫基因的所表达的杀虫晶体蛋白为检测目标，建立了双抗夹心酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测转基因棉花中表达的Bt Cry1Ac基因型蛋白。 抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。该实验比较两种液体培养基(1／2LB、1／2NB)，两种培养条件(28℃，150r／min和28℃，200r／min)对叁种苏云金芽孢杆菌(HD-1、HD-2、HD-73)进行培养，经碱液裂解后比较等电点沉淀和高速离心方法提取Bt蛋白的产量和纯度。实验得出叁种菌体在1／2NB培养基，28℃，200r／min培养叁天，蛋白产量均较高，高速离心得到的蛋白收率低于等电点沉淀法，但其纯度较高，满足作为抗原的条件，因此本实验选用了HD-73菌株经高速离心方法得到的特异产Bt Cry1Ac的蛋白作为抗原。 在抗体的制备中选用将蛋白直接溶于液体缓冲液中直接进行免疫和将蛋白电泳后切下蛋白带进行免疫大白兔。结果表明，切胶免疫的大白兔其免疫反应较溶液免疫的强烈，但抗血清效价较低。实验中选择了溶液免疫得到的抗体作为第一抗体，将抗体与常用的腊根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记得到第二抗体即酶标抗体，从而建立了抗体-抗原-酶标抗体的双抗夹心ELISA方法，其检测限为0.005μg／mL，线性范围为0.015-0.25μg／mL。在与其它5种Bt Cry蛋白(Cry1C、Cry2A、Cry3A、Cry3Bb1、Cry9C)没有交叉反应。 在检测六种棉花样品(GK-12、GK-22、NON、抗虫棉、双价棉、石远321)时，采用了叁种提取缓冲液(Tris-硼酸、Na_2CO_3缓冲液、PBST)提取样品中的Bt蛋白，得出Tris-硼酸缓冲液是较佳的Bt蛋白的样品提取缓冲液。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法来验证所建立的ELISA实验检测样品结果的正确性和可行性，选用了常用的花椰菜花叶病毒的35S(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV-35S)、Cry1Ab+Cry1Ac、Cry1Ac(检测基因)和18S rRNA(内参基因)的特异性引物对六种棉花样品中的DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明GK-12、GK-22、抗虫棉、双价棉和石远321为转Bt Cry1Ac基因棉花，NON为非转基因棉花。
周青[10]2015年在《聚合抗虫基因和cry2A*和cry1C*早粳稻分子检测和抗虫性评价》文中提出水稻是世界上最主要的粮食作物之一,全世界一半以上的人口以稻米作为主食。虫害对水稻生产造成严重危害,每年因此而造成巨大的经济损失。苏云金芽胞杆菌(Bt)是一种革兰氏阳性菌,它能够产生对鳞翅目等昆虫具有特异毒性的晶体蛋白。为了防治鳞翅目昆虫,许多Bt基因已被成功的转入到水稻中,目前已获得许多具有抗虫特性的转基因水稻品系。本文以双价Bt抗虫水稻空育131和松粳9号作为研究对象,利用PCR、real time PCR、ELISA和Southern blot等方法,从DNA水平、mRNA水平、蛋白水平进行研究,从中选育出目的基因遗传稳定、拷贝数低且Bt蛋白表达量高、室内抗虫性效果显着的转基因水稻品系。主要研究结果如下:1.利用根瘤农杆菌EHA105(pbar-cry2A*)和EHA105(pbar-cry1C*)混合菌液介导,对水稻品种松粳9号进行遗传转化,获得含有cry2A*/cry1C*/bar基因的共转化植株;以空育131(cry2A*/bar)与空育131(cry1C*/bar)为亲本,通过有性杂交获得含有cry2A*/cry1C*/bar基因的植株。利用Basta抗感性筛选、试纸条检测、PCR、Southern blot等方法,经过T0~T7代的筛选,成功获得了60个双价Bt抗虫水稻品系(cry2A*/cry1C*/bar),其中以空育131为亲本的10个,松粳9号为受体的50个。2.实时荧光定量PCR与ELISA检测结果表明不同品系相同组织中Bt基因的转录水平存在差异;相同品系的不同组织中Bt基因的转录水平也存在明显差异;此外,在转录水平上cry2A*基因的转录水平明显高于cry1C*。酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明Bt蛋白的表达量与Bt基因的转录水平存在正相关性;相同品系不同组织中Bt蛋白含量由高到低依次为叶片>幼穗>茎鞘>糙米。3.室内抗虫性结果显示,Bt蛋白含量较高的品系对二化螟幼虫表现出较高的致死率。Southern blot结果表明,经过连续的传代之后,外源基因的遗传趋于稳定,且外源基因的拷贝数相对较低,多数品系介于1~2个,同时单拷贝品系表现出较稳定,较高的杀虫活性,这些培育而成的新材料对于品种选育具有重要的意义。4.本实验利用反向PCR方法对转基因品系中表现出较好抗虫能力且单拷贝的2-1品系中的cry2A*基因的侧翼序列进行扩增,通过NCBI数据库比对确定其位于第2号染色体上。
参考文献：
[1]. 转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究[D]. 崔林开. 四川农业大学. 2004
[2]. 转Bt抗虫基因植物的酶联免疫检测技术研究[D]. 严吉明. 四川农业大学. 2002
[3]. 转Bt抗虫基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究 Ⅲ.酶联免疫(ELISA)间接法检测Bt杀虫蛋白研究[J]. 严吉明, 叶华智, 伍光庆, 张敏. 四川农业大学学报. 2005
[4]. MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选[D]. 王晓娟. 内蒙古农业大学. 2007
[5]. 云抗虫（Bt）稻品系螟虫抗性的分子鉴定[D]. 赵越. 云南农业大学. 2016
[6]. 转基因741杨的抗虫效应及生态安全性评价[D]. 刘军侠. 东北林业大学. 2004
[7]. Bt和CpTI双价抗虫基因共转化菘蓝提高对害虫抗性的研究[D]. 丁如贤. 第二军医大学. 2007
[8]. 转抗虫基因（BtCry3A）741杨抗虫性研究[D]. 李静. 河北农业大学. 2006
[9]. 应用ELISA检测转基因棉花中Bt蛋白的研究[D]. 郭艾英. 天津科技大学. 2006
[10]. 聚合抗虫基因和cry2A*和cry1C*早粳稻分子检测和抗虫性评价[D]. 周青. 黑龙江大学. 2015
标签：农业基础科学论文; 植物保护论文; 转基因植物论文; 抗原抗体反应论文; 基因合成论文; 抗原抗体论文; 对照实验论文; 害虫论文; 基因工程论文; elisa论文;