哈尔滨市传染病院 黑龙江哈尔滨 150036
摘要：目的：探讨肾综合征出血热（HFRS）患者的早期实验室诊断。方法：分别利用酶联免疫吸附（ELISA）法检测HFRS患者抗体IgM，免疫荧光法（IFA）检测患者抗体IgG，套式RT-PCR法检测患者血清中的病毒RNA，同时对PCR产物M基因部分片段进行序列分析。结果：16例发病1周以内的患者的血清样本中，IgM阳性比例为9/16，IgG阳性比例为9/16，2者均阳性者为7例，IgM或IgG最早出现在发病后第4天。结论：相对于血清学检测，利用RT-PCR进行HFRS患者的病毒核酸检测更有利于早期诊断及分子流行病学调查。
关键字：肾综合征出血热；汉坦病毒；诊断分析
Summary：Purpose：Objective to investigate the early laboratory diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome（HFRS）.Method：Using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method for detection of HFRS antibodies in patients with IgM，immunofluorescence（IFA）detecting antibodies of patients with IgG，a virus RNA in serum of patients with RT-PCR was detected，at the same time on the part of the PCR product of M gene fragment sequence analysis.Results：In 16 cases of patients within 1 weeks of the serum samples，the positive ratio of IgM was 9/16，the positive rate of IgG was 9/16，and the positive rate was in all the 2 cases，IgM or IgG first appeared in the first fourth days after onset.Conclusion：Compared with serological detection，the use of RT-PCR in patients with HFRS virus nucleic acid detection is more conducive to early diagnosis and molecular epidemiological investigation.
Keywords：Hemorrhagic fever with renal syndrome；Hantavirus；diagnostic analysis
汉坦病毒（HV）是肾综合征出血热（HFRS）的病原。HFRS起病急，临床表现错综复杂，肾脏损害突出，尚无特效治疗，危害严重。因此，早期诊断、早期治疗是改善患者预后、降低病死率的关键。本研究采集我院临床诊断16例HFRS患者的血标本，诊断方法如下：
1材料与方法
1.1一般资料
采集2016年2月-4月来我院临床诊断HFRS的患者16例，年龄27-53岁，平均42.9岁，其中男9例，女7例。于发病后1周内采血，分离血清，即刻检测。
1.2方法
1.2.1血清学检测
捕获酶联免疫吸附（ELISA）法检测患者血清中特异性IgM抗体，采用IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，按说明书操作。[1]间接免疫荧光法检测患者血清中特异性IgG抗体，以HV感染培养细胞制备抗原片，二抗为荧光素标记抗人单克隆抗体，按常规操作。
1.2.2病毒总RNA的提取
采用QIAamp Viral RNA Mini kit，从患者血清中提取病毒总RNA，按说明书操作。
1.2.3套式RT-PCR
用P14引物和TaKaRa RNA kit（AMV）Ver.2.1试剂盒，按说明书逆转录合成cDNA。套式PCR第1轮在逆转录反应管内再加入10×PCR缓冲液8μL，MgCl2（25mmol/L）6μL，引物MR和MF各2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，加去离子水至100μL；套式PCR第2轮反应体系：10×PCR缓冲液2μL，MgCl21μL，dNTP（各2.5mmol/L）1μL，分型上下游引物各1μL，第1轮PCR产物2μL，Taq酶0.25μL，加去离子水至20μL；反应条件均为94℃预变性5min后，94℃50s，55℃50s，72℃90s，扩增35个循环。[2]反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。试验中以SEO型L99株和HTN型Z10株为阳性对照。
1.2.4M基因G1片段的序列分析
套式RT-PCR阳性的扩增产物直接测序，由英骏生物技术有限公司完成。序列结果应用DNA Star（5.01）软件中的Clustal W方法进行比对，基于核苷酸序列分析结果，绘出系统发生树。
2结果
2.1血清学检测结果
16例患者发病1周以内检测血清IgM阳性表达为9例，IgG阳性表达为9例，其中两者均为阳性者有7例，IgM和IgG最早出现在发病后第4天，见表1。
2.2RT-PCR检测结果
16例患者RT-PCR阳性结果有11例，阳性比例为11/16，基因分型均为SEO型。RT-PCR阳性的11例患者发病均≤5d，其中发病3d的4例患者检测病毒核酸全部为阳性，但抗体检测均为阴性；发病6d以上的4例患者RT-PCR结果全部阴性，见表1。
2.3SEO型标本核普酸序列分析
选取11份SEO型阳性标本序列分析获得其M基因编码G1片段Nt1343-1629的287bp的核苷酸序列，与SEO型病毒株L99相比较同源性为94.8%-99.7%，与HB55株相比同源性为94.1%-99.0%，与HTN型病毒株Z10相比较同源性为71.1%-73.4%。上述序列分析的结果与RT-PCR的基因分型是一致的。
3讨论
本研究选择的HFRS患者，均为临床诊断病例，结合实验室的血清学和核酸检测核实，即为实验室确诊病例。本研究结果表明，发病5d以内的患者采血RT-PCR阳性比例高达11/12，4例发病3d的患者RT-PCR阳性时，抗体检测结果还是阴性，无疑该结果对患者诊断起到关键作用，实现了快速诊断。有报道病后1-3d可以检出HV-IgM，病后3-5d可以检出HV-IgG。[3]本文结果为病后4d检出IgM或IgG，阳性比例均为9/16，两者在辅助HFRS早期诊断上的优势显然不如病毒核酸的检测，特别是单纯HV-IgG阳性尚不能排除患者有过HV隐性感染或相关疫苗接种的影响，尚需随病程延长进行定期观察。此外，理论上HFRS的病毒血症应持续10-14d。本文结果显示病后≥6d的患者采血RT-PCR检测已全部阴性。不可否认本研究的标本量较少，或许也与试验本身的灵敏度有关，有待进一步研究。
RT-PCR结合序列分析的方法已成为HV分型研究的首选方法。不同型别的HVM片段核苷酸有明显差异，尤其编码G1蛋白的片段差异较大，常用来作为基因分型和变异研究的主要区域。
参考文献：
[1]李秀云，赵广寅，王太东.流行性肾综合征出血热的实验室诊断[J].上海医学检验杂志2016，12，3：191.
[2]周莉，肾综合征出血热各期实验室检查变化规律及临床意义[J].医学检验，2015，7，18：82.
[3]黄秀云，李兴阳.肾综合征出血热157例实验室检测指标分析[J].中国冶金工业医学杂志，2014，2，6：668.
论文作者:李伯健
论文发表刊物:《健康世界》2017年第4期
论文发表时间:2017/4/18
标签：患者论文; 阳性论文; 出血热论文; 序列论文; 血清论文; 病毒论文; 抗体论文; 《健康世界》2017年第4期论文;