黄宁江（通讯作者）1 黄仕芳1 姜卓2 胡昊良3 徐婵1
（1永州职业技术学院 湖南 永州 425000）
（2永州市第一人民医院 湖南 永州 425000）
（3湖南师范大学生命科学学院 湖南 长沙 41081）
【摘要】目的：观察洛伐他汀（LVT）对同型半胱氨酸硫内酯（HTL）所致血管内皮细胞损伤以及白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6）表达的影响。方法：取HTL处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）复制内皮细胞损伤模型，将HUVECs分为对照组、HTL处理组、低浓度LVT处理组、中浓度LVT处理组和高浓度LVT处理组，用Westernblot检测HTL及LVT对HUVECs中IL-1和IL-6表达的影响。结果：与对照组相比，HTL能诱导HUVECs细胞内ROS生成，并上调IL-1表达和IL-6表达（P＜0.05）；与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05）。结论：LVT对HTL所致血管内皮细胞损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制IL-1和IL-6表达有关。
【关键词】洛伐他汀；同型半胱氨酸硫内酯；血管内皮细胞；IL-1；IL-6
【中图分类号】R318.11 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）07-0170-02
高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是导致心脑血管疾病的独立危险因素之一[1-2]。目前认为HHcy与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、血栓性疾病密切相关，但是HHcy导致AS的发病机制目前尚不清楚。研究发现，HHcy致病的病理学基础主要与同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）在体内转变成同型半胱氨酸硫内酯（homocysteine thiolactone，HTL）有关[3]，HTL能导致血管损伤，但具体机制尚未明确。他汀类药物是临床常用治疗高胆固醇血症的药物，除了有调血脂的作用外，还具有改善内皮功能[4]、抗血管炎症等非调脂性作用。文献报道，他汀类对HHcy引起的血管内皮功能损伤有保护作用。洛伐他汀（lovastatin，LVT）是临床用于治疗高胆固醇血症的他汀类药物之一，本课题组在前期实验中发现LVT可显著减轻HTL对EDR的抑制作用，减少血管组织中丙二醛的生成和保护SOD的活性，但LVT对HTL所致血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）损伤的保护作用及机制目前尚不清楚。本研究将在前期工作的基础上进一步探讨LVT对HTL所致血管内皮细胞损伤的保护作用，也为他汀类药物抗AS作用提供新的依据。
1.资料与方法
1.1 主要试剂
人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）购自中国典型培养物保藏上海中心细胞库；LVT、HTL和DMEM培养基等均购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。荧光定量PCR引物（IL-l序号为Hs00174097，IL-6序号为Hs00l74131，GAPDH序号为4326317E-0503008）均购Applied Biosystems公司。蛋白定量检测（BCA）试剂盒、蛋白裂解液、IL-1和IL-6单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验分组与细胞培养
HUVECs用含10%胎牛血清的F12K培养基在37℃条件下用含5%CO2的孵箱培养。当HUVECs长到对数期时换成含0.5%FBS的F12K培养基预处理24h使HUVECs出现同步化，然后用于下一步的实验研究。本实验共分为对照组、HTL处理组（1mmol/L的HTL处理24h）和低浓度LVT处理组（先用0.025μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）、中浓度LVT处理组（先用0.05μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）和高浓度LVT处理组（先用0.1μmol/L的LVT预处理HUVECs4h，然后再用1mmol/L的HTL处理24h）。
1.3 细胞内活性氧（ROS）含量测定
各组处理后的HUVECs细胞用胰酶进行消化（0.125%的胰酶与0.02%的EDTA比例为1:1），然后用无血清的F12K培养基洗3次，并用PBS重悬细胞（4×108/L）。加入用１μL无水乙醇配置的DCFH-DA，于37℃避光水浴30分钟。采用仪器检测各组HUVECs细胞的活性氧含量。
1.4 Western Blotting分析IL-1和IL-6蛋白表达水平
收集各组HUVECs后加入4℃预冷的细胞裂解液裂解细胞收取总蛋白，各组的蛋白浓度采用BCA法进行测定。每孔上样蛋白量为30μg，用SDS-PAGE胶进行电泳，转膜后用无脂奶粉（5%）于常温下封闭1h。加入不同浓度稀释的抗IL-1、IL-6和GAPDH等一抗，在4度下摇床过夜。用1:5000稀释的HRP标记的二抗于室温下孵育1h，应用化学发光试剂显色，对胶片进行定影和显影，最后对胶片扫描并进行灰度分析。
1.5 统计学分析
采用SPSS15.0统计软件对数据进行分析，以均数±标准差（x-±s）表示，组间的统计比较应用t检验，采用单因素方差分析（One-WayANOVA）对多组间数据进行比较分析，P＜0.05被认为具有统计学意义。
2.结果
2.1 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的ROS的生成
与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞内ROS生成（P＜0.05）；与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05），见图1。
图1 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的ROS
注：*P＜0.05，与对照组相比较；#P＜0.05，与HTL处理组相比较。
2.2 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的IL-1的表达
与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞中IL-1表达；与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05），见图2。
图2 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的IL-1
注：*P＜0.05，与对照组相比较；#P＜0.05，与HTL处理组相比较。
2.3 LVT抑制HUVECs中HTL诱导的IL-6的表达
与对照组相比，HTL能明显诱导HUVECs细胞中IL-6表达与HTL组相比，LVT可呈浓度依赖性抑制HTL所致的效应（P＜0.05）见图3。
图3 洛伐他汀抑制HUVECs中HTL诱导的IL-6
注：*P＜0.05，与对照组相比较；#P＜0.05，与HTL处理组相比较。
3.讨论
文献报道，HTL可通过直接以及间接这两种途径影响血管内皮功能。HTL的酐键可与血浆蛋白的赖氨酸ε-氨基起作用，从而改变蛋白的结构以及理化性质。间接途径与HTL影响细胞内信号通路激活有关，可能与HTL促进脂质过氧化物和细胞内ROS生成有关，但具体的分子机制目前尚未清楚。在本研究中，我们取HTL处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）复制内皮细胞损伤模型，将HUVECs分为对照组、HTL处理组、低浓度LVT处理组、中浓度LVT处理组和高浓度LVT处理组，用Westernblot检测HTL及LVT对HUVECs中IL-1和IL-6表达的影响。结果发现，HTL可明显增加HUVECs内ROS生成，同时可使IL-1和IL-6的蛋白表达水平均明显增高，而LVT可呈浓度依赖性抑制HTL诱导的HUVECs中IL-1、IL-6的表达。
动脉粥样硬化是一种脂质代谢失调以及炎症性血管病变，AS的发生进展过程中均伴有炎症反应，大量研究表明有许多炎症因子以及炎症细胞参与了AS的形成，如高水平的急性反应蛋白和IL-6可促使AS斑块的形成。研究中，我们发现LVT可通过下调HTL诱导的HUVECs中IL-1和IL-6的表达，参与细胞炎症反应的调节，从而推测他汀类药物可能通过减轻炎症反应，保护血管内皮细胞抑制AS的形成和发展，其精确的机制尚有待进一步的研究。该研究手段为研究HHcy致病机制提供了新的方法，其结果也为他汀类药物的抗AS作用提供新的依据。
【参考文献】
[1] Fang P,Zhang D,Cheng Z,et al.Hyperhomocysteinemia potentiates hyperglycemia-induced inflammatory monocyte differentiation and atherosclerosis.Diabetes, 2014,63(12):4275-4290.
[2] McCully KS.Homocysteine Metabolism,Atherosclerosis,and Diseases of Aging[J].Comprehensive Physiology.2015;6(1):471- 505.
[3]苏晓叶，刘志忠，李小波，等.不同剂量的阿托伐他汀对心肌损伤大鼠内皮祖细胞动员及血管内皮功能的影响[J].中国动脉硬化杂志，2007，15(4):277-280.
基金项目：湖南省教育厅科研项目（编号：17C1608)
论文作者:黄宁江（通讯作者）1,黄仕芳1,姜卓2,胡昊良3,徐
论文发表刊物:《医药前沿》2019年7期
论文发表时间:2019/5/10
标签：内皮论文; 细胞论文; 诱导论文; 洛伐他汀论文; 抑制论文; 血管论文; 浓度论文; 《医药前沿》2019年7期论文;