彭景[1]2016年在《基因体外重组与在体编辑介导的肿瘤靶向光学分子成像》文中认为目的:利用体外基因重组技术,构建组成型及组织特异型启动子调控的Luc光学基因分子探针,对比研究无靶向及靶向肿瘤光学分子成像的特点、区别及各自技术局限;根据CRISPR/Cas9基因编辑系统原理,借助该系统的精准靶向性及在体基因编辑特点,设计并实现利用该系统对失活Luc基因进行在体基因编辑介导的光学基因分子成像,为将本研究设计的在体基因靶向成像策略用于活体内多靶点条件下的靶向光学基因成像奠定基础。方法:1、以不同转染试剂及腺病毒为递送载体,将体外重组基因p CMV-Luc转染前列腺癌肿瘤细胞后进行光学成像,探讨非靶向光学基因细胞成像效果;将上述转染后的细胞继续培养后注入小鼠皮下,完成光学成像以评价活体细胞示踪效果,同时构建前列腺癌小鼠模型,以瘤内注射的方式向其肿瘤内直接注射腺病毒载体Ad.p CMV-luc后进行活体光学成像;2、利用含前列腺癌组织特异性启动子的体外重组基因p DD3-Tf R-Luc的腺病毒载体感染正常细胞、前列腺癌细胞及其他肿瘤细胞,完成细胞光学成像,并用Western-blotting方法检测基因探针处理后Tf R的表达水平,评估该类基因介导的细胞靶向光学成像特点;3、构建前列腺癌小鼠模型,向其肿瘤内注射组织特异性表达探针Ad.p DD3-Tf R-Luc后进行光学成像,分析图像荧光强度及范围的变化,进而评估基于靶向基因探针的活体内肿瘤靶向成像效果,对比第一、二部分成像结果讨论体外基因重组用于基因成像的优势与不足;4、设计并合成survivin启动子序列、stop sequence(SS)序列及靶向SS序列的g RNA(SS)序列;以质粒PX459和p SG-target为模板构建CRISPR/Cas9系统的载体质粒p U6-g RNA(SS)-pβactin-Cas9、p U6-g RNA(N)-pβactin-Cas9和失活Luc基因质粒p CMV-Luc L-SS-Luc R、p Sur-Luc L-SS-Luc R;5、将质粒p U6-g RNA(SS)-pβactin-Cas9、p U6-g RNA(N)-pβactin-Cas9分别与p Sur-Luc L-SS-Luc R、p CMV-Luc L-SS-Luc R共转染PC-3细胞和293T细胞,进行体内基因重组介导的细胞光学报告基因成像,实现并验证CRISPR/Cas9基因编辑系统用于分子成像的可行性。结果:1、含组成型启动子的Luc基因分别经腺病毒、阳离子脂质体Lipofectamine2000、阳离子聚合物PEI处理后,肿瘤细胞后均可发出荧光,其中以腺病毒转染方式成像效果最佳。转染试剂及腺病毒载体转染后的肿瘤细胞注射小鼠体内后均可实现细胞示踪;以腺病毒载体Ad.p CMV-Luc感染前列腺癌种植瘤小鼠后,肿瘤区域可见较强荧光,所示荧光区域与肿瘤范围无相关性。2、Ad.p DD3-Tf R-Luc转染不同细胞后,仅前列腺癌细胞发出荧光,而正常细胞、及其他肿瘤细胞无荧光显示;WB结果显示仅前列腺癌细胞出现Tf R蛋白过表达。Ad.p DD3-Tf R-Luc介导的活体光学成像显示小鼠体内仅肿瘤部位发出荧光,而瘤周组织及全身其他器官均无荧光显示,肿瘤边界显示清楚,其荧光范围与与肿瘤增长保持一致。3、经测序验证,本实验设计的CRISPR/Cas9载体质粒p U6-g RNA(SS)-pβactin-Cas9和类Luc基因载体质粒p CMV-Luc L-SS-Luc R及p Sur-Luc L-SS-Luc R构建成功。由p U6-g RNA(SS)-pβactin-Cas9质粒和组成型启动子调控的p CMV-Luc L-SS-Luc R质粒共转染后,293T及PC-3细胞均有荧光显示,且成像效果较好。由p U6-g RNA(SS)-pβactin-Cas9质粒和组织特异性启动子调控的p Sur-Luc L-SS-Luc R质粒共转染后,PC-3细胞有荧光显示。结论:1、腺病毒、阳离子脂质体、阳离子聚合物均可实现肿瘤细胞的Luc基因成像,其中在细胞层面上腺病毒载体的转染效率较高,同时,腺病毒介导的光学基因成像可获得较好的活体光学分子成像结果,但受组成型启动子调控的基因成像无法实现肿瘤靶向成像,因此该类Luc基因探针在分子成像中的应用主要局限于细胞示踪与分子生物学实验研究领域。2、基于腺病毒载体Ad.p DD3-Tf R-Luc的成像研究成功验证了由组织特异性启动子介导的基因成像在细胞及活体层面肿瘤靶向成像中的应用,表明利用体外重组技术,借助组织特异性启动子可为肿瘤靶向性报告基因成像提供了一个有效的生物“开关”。3、本研究成功构建了一种基于CRISPR/Cas9系统的新型光学基因成像系统,实现了由CRISPR/Cas9在体基因重组技术介导的正常及肿瘤细胞的靶向光学基因成像,从而将目前国际前沿的CRISPR/Cas9在体基因重组技术创新性地融入到分子影像研究中,为未来实现精准分子成像、检测基因水平的生物学行为以及实现活体、“多靶点”、“多因素”成像为目的的新型基因分子成像研究提供了一种全新的、基于在体基因编辑技术的基因成像方案。
段升森[2]2013年在《中小企业基因重组与转型成长研究》文中研究指明中小企业是我国国民经济和社会发展的重要力量,在促进经济发展、扩大社会就业、推动科技创新、产业结构优化等方面发挥着至关重要的作用。然而,受资金、技术、人才、信息等制约,加之资源环境约束强化、金融危机负面影响、市场竞争日趋激烈、国内金融市场发展缓慢等多种因素,其发展面临严峻生存危机,低能源成本、低生产资料成本、低劳动力成本和低环境要求的时代已经一去不复返。因此,实现转型成长以更好地应对环境变化是我国中小企业不得不解决的现实问题。本文视中小企业为生命体,认为其成长是由一系列相互作用、相互影响的企业基因决定的,因此中小企业基因重组过程——中小企业基因及其作用关系的整合与变革会从根本上转变中小企业的成长状态,促进中小企业实现转型成长。在上述理念的指导下,本文从企业基因重组的视角探讨中小企业转型成长问题,搭建了“中小企业基因——中小企业基因重组——中小企业转型成长”的研究路径,以期为从基因层面研究中小企业转型成长提供新证据,深化有关企业转型成长的理论研究。按照上述逻辑主线,本文主要研究内容包括以下方面：第一,中小企业转型成长的内涵及其分析框架。在揭示中小企业生命特征及界定中小企业基因内涵的基础上,依据我国中小企业的成长现状和存在的问题分析中小企业转型成长的内涵、动因和基本目标,并进一步在仿生学视角下运用企业基因重组理论提出中小企业转型成长的分析框架。第二,中小企业基因实证甄别。基于中小企业基因的内涵,通过对企业基础资源和价值链的分析构建中小企业基因甄别指标体系,并用因子分析、方差分析、多重比较、层次分析、熵值法等方法,实证检验中小企业基因的主要构成及其对中小企业成长而言的相对重要性。第三,中小企业转型成长的基因重组机理。依据中小企业转型成长的基因重组分析框架,在对中小企业基因进行有效甄别的基础上,运用复杂适应系统理论和自组织理论系统探讨中小企业转型成长的基因重组机理,并据此揭示中小企业转型成长的基本策略和策略选择方案,从而为中小企业转型成长实践提供有效的参考和建议。第四,基因驱动的中小企业转型成长仿真。基于中小企业基因的实证甄别结果以及中小企业基因重组的理论分析结果,运用多主体建模理论和方法,构建仿真模型,模拟基因作用下的中小企业转型成长过程,以揭示中小企业转型成长的动态演化特征及其影响因素。综合以上分析内容,主要得出了如下五点结论：第一,基因重组视角下中小企业转型成长的内涵及其分析框架。中小企业转型成长是中小企业通过主动地对企业内部业务能力要素(企业基因)的整合和变革(企业基因重组)谋求企业长期经营方向、运营模式及其相应的组织方式、资源配置方式的整体性转变,以期构建高环境适应力组织形式、重塑企业核心竞争力并提升社会和市场价值的过程。因此,“中小企业基因甄别——中小企业基因重组机理——中小企业转型成长策略”是基因重组视角下中小企业转型成长问题的可行分析框架。第二,中小企业基因甄别指标体系、甄别方案设计及甄别结果。根据中小企业基因的内涵,本文从中小企业价值链和基础资源交叉的视角通过理论分析提出了包括33个具体指标的中小企业基因甄别体系,并依据该体系的特点设计了专门的甄别方案。依据甄别体系和甄别方案,中小企业基因组主要包括企业家、技术、制度和产品四个基因组,具有企业家战略决策能力、企业家创新能力等十一个企业基因。第三,中小企业基因重组的内涵及重组机理。中小企业基因重组包括企业基因整合和企业基因变革两种类型,其中企业基因整合即企业基因的排列顺序或组合方式的重新组织,企业基因变革是企业主动寻找和培育决定性企业基因并充分挖掘提升非决定性基因价值潜力的过程。中小企业基因重组的自组织演化模型显示,中小企业转型成长主要受三个方面的影响：一是企业原有的成长能力,二是企业基因整合和变革的影响,三是环境随机涨落外力的作用。第四,中小企业转型成长的策略选择。一般而言,必要性和有益性基因占主导地位的中小企业在行业中的实力相对较弱,要实现转型成长,就需要提升企业基因的价值潜力,培育和创造决定性企业基因。而对那些拥有决定性基因的中小企业而言,往往有能力和实力在行业内和所在市场控制其关键能力和决定性能力要素,因此可以采用排他性经营的策略保持其优势所在和主导地位。第五,中小企业转型成长动态演变规律。企业基因作用下的中小企业转型成长的软件模拟结果表明,在前期阶段,个体数量增长速度较快,但在后期个体数量增长逐渐平缓,表现出一定的波动性,整个行业中个体的数量达到动态平衡。同时,环境动态性与复杂性程度越高,中小企业实现转型成长的概率越低。此外,组织管理主体扩张能力变化,对中小企业规模、技术以及财务增长有明显作用。据此,本文创新点归为以下三方面：第一,对中小企业转型成长的内涵及本质进行了仿生学视角的界定和解读。国内外学者主要从组织行为角度和战略管理角度对企业转型成长进行了大量研究,均认同企业转型成长是对企业成长方式的一种根本的、系统性的变革,是一项复杂的系统工程。然而上述界定虽然指出了企业转型成长的彻底性和复杂性,却无益于揭示企业转型成长的本质和一般规律。本文从企业基因层面对中小企业转型成长的内涵进行重新界定,并依托企业基因这一概念深刻揭示其本质。第二,提出了基于企业重组理论的中小企业转型成长分析框架。本文从仿生视角对中小企业转型成长的内涵进行重新界定和解读的基础上,揭示了企业基因、企业基因重组与中小企业转型成长的内在逻辑,进而提出了基于企业重组理论的中小企业转型成长分析框架。企业重组理论系统论述了企业基因的内涵与特征以及企业基因的整合与变革途径,并倡导基于企业基因的整合与变革构建新型的企业组织形态和成长模式,因此该分析框架展现了“企业基因——企业基因重组机理——中小企业转型成长”的逻辑和思路,为从企业基因出发剖析中小企业转型成长提供了一种新的分析途径。第三,揭示了中小企业转型成长的机理和有效策略。在企业基因重组理论的分析框架下,首先运用复杂适应系统理论和自组织理论分析中小企业转型成长的基因重组机理,然后在借鉴现有企业的转型模式研究文献尤其是梳理西方企业转型模式资料的基础上,揭示了中小企业转型成长的基本策略：基于企业基因整合的中小企业转型成长策略和基于企业基因变革的中小企业转型成长策略,并结合中小企业在行业中的实力及其在价值链中的价值提出了中小企业转型成长的策略选择方案。
胡潇[3]2007年在《表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因重组鸭瘟病毒的构建》文中进行了进一步梳理高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza HPAI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种高度接触性传染病,几乎所有的野生及家养禽类都可感染,该病经常给养禽业造成严重的经济损失。安全有效的抗AIV疫苗一直是AIV研究的重点。活载体疫苗可同时诱导体液免疫反应和细胞免疫反应,有利于抵抗变异性强的病毒。鸭瘟病毒(DPV)作为一种疱疹病毒,拥有庞大的基因组和许多非必需区,具有用作表达外源基因的病毒活载体的巨大潜力,被认为是理想的活疫苗载体。本研究从感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的鸭瘟病毒(DPV)疫苗毒株中提取了总DNA,并以此为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-T easy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2Ⅰ与SmaⅠ之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)本研究初步获得了一株能同时表达禽流感HA、NA的重组鸭瘟病毒rDPV-HA-NA,同时,构建的转移载体pGTK-EGFP为开发鸭瘟病毒二价基因工程疫苗提供了条件。本研究结果为研制抗AIV的重组鸭瘟病毒活载体疫苗奠定了基础。重组的DPV疫苗在将来进一步的研究中可作为新型AIV基因工程疫苗代替禽流感传统的全病毒灭活苗,为禽流感的防治带来新的技术。
李文军[4]2017年在《新型藻胆蛋白的制备及其在生物传感和染料敏化太阳能电池中的应用》文中指出光合作用是一种古老而重要的化学反应,通过捕光体系对光能高效的吸收,能够将光能转化为生物能。藻胆体是红、蓝藻中主要的捕光天线复合物,也是光合放氧生物的两大捕光蛋白复合物类型之一。藻胆体由藻胆蛋白和连接蛋白构成,藻胆蛋白则是由藻胆素色基与脱辅基蛋白通过共价键联接而成。藻胆蛋白通过构成有序的藻胆体,使藻胆体可以吸收不同波长的光能,并且能量在藻胆体内能够以95%以上的效率传递到光反应中心。藻胆蛋白由于具有优异的光学特性,被广泛应用于生物医学等领域。近年来通过基因工程构建的体外重组藻胆蛋白,不仅为研究藻胆蛋白的能量传递提供了新的途径,而且为开发生物传感器的提供了新的途径。本文对天然和基因重组藻胆蛋白的制备、光谱特性以及应用展开了以下几方面的研究:1.以紫球藻(Porphyridium cruentum)为材料,研究了B-藻红蛋白(B-PE)的高效分离纯化方法。首先利用渗透压法对细胞进行破碎,使B-PE从紫球藻中释放到溶液中,然后分别利用超滤法,硫酸铵盐析法和壳聚糖吸附法对B-PE进行粗提,最后用SOURCE 15Q离子交换层析进行纯化。纯化后得到分析级的B-PE,纯度(A565/A280)可达5.1,回收率高达68.5%,为商业化生产分析级B-PE提供了参考。SDS-PAGE电泳表明B-PE的α和β亚基分子量为18~20 kDa,γ亚基的分子量约为27 kDa。光谱数据表明,B-PE在545 nm和565 nm有2个吸收峰,在498 nm处有1个肩峰,荧光发射峰在575 nm和620 nm。对B-PE在250~750 nm范围内圆二色谱(CD)数据的解析表明,B-PE在近紫外区260 nm和305 nm有两个CD峰,分别由苯丙氨酸和色氨酸产生,两种芳香族氨基酸可能共同处于疏水的蛋白微环境中。推测B-PE在PEB139α/PEB158β和PEB82α/PEB82β两个位置,形成耦合的激子对,4个耦合分子内以激子分裂的形式进行能量传递,其它色基之间则以福斯特共振进行能量传递,最后对B-PE内能量传递的途径进行了预测。2.对MAC工程菌株的培养条件进行了优化,进行了3次10 L密度发酵,获得大量表达MAC的菌体。MAC(链霉亲和素-藻蓝蛋白α亚基融合蛋白)的表达量占菌体可溶性蛋白的比率可达43%,菌体密度OD600最大达到12.5,收集到MAC菌体湿重总量达到约400 g。随后对工程菌的破碎条件进行优化,并对MAC的进行了层析纯化。SDS-PAGE结果表明,纯化后的MAC仅有一个亚基,分子量为在76 kDa附近,与预期的蛋白分子量相符。MAC在近紫外-可见光区共有3处吸收峰,分别位于340 nm和370 nm和625 nm;在575 nm还有一个肩峰,MAC的最大荧光发射峰位于640 nm,圆二色谱中的吸收峰结果与吸收光谱中一致。当对藻胆素或者芳香族氨基酸进行激发时,能够获得640 nm的荧光发射峰,表明能量能够通过藻胆素或者芳香族氨基酸传递至发色团。光谱结果表明MAC有正确的构象,并且具有良好的光学活性。3.构建基于MF0(基因重组藻蓝蛋白α亚基)和氧化石墨烯(GO)的葡萄糖生物传感器。首先用低分子量壳聚糖(CS)修饰氧化石墨烯,制得CS-GO复合物。GO-CS可以非特异性吸附MF0上的麦芽糖结合蛋白(MBP),造成MF0的荧光淬灭。当体系中存在葡萄糖时,MBP会特异吸附葡萄糖,造成MF0无法再吸附GO-CS,荧光强度增加。通过荧光的强度变化,可以间接对葡萄糖含量进行定性和定量分析。该葡萄糖生物传感器的检测线性范围为0.1~1 mg/mL,最低检测限(LOD)为0.05 mg/m L,具有较高的灵敏度和选择性。4.选择7种不同特性的藻胆蛋白作为染料敏化二氧化钛光阳极,组装成染料敏化太阳能电池(DSSC)并研究其光电特性。结果表明B-PE能够明显提高DSSC的光电性能,得到DSSC的短路电流、开路电压、填充因子和光电转化效率为分别为0.809 A/cm2、0.545 V、0.569和1%。所构建的胶原蛋白/羧基化碳纳米管/聚丙烯酰胺复合凝胶,不仅利于DSSC封装,同时可增进光电转换效率,提高光电池的短路电流,能够作为准固态电解质,推进染料敏化太阳能电池的实际应用。结合晶体结构和圆二色谱数据,解析了藻胆蛋白染料敏化DSSC的IPCE和ICE光谱,为研究藻胆蛋白的结构和功能提供了新的途径。
杨兴兴[5]2016年在《工程菌技术强化脱氮及绿锈深度脱氮机制研究》文中认为随着工农业的发展,污水氮污染问题日益严重。本文以含无机氮(亚硝酸盐和肼)配水为研究对象,采用nirS基因重组工程菌体系、HZO基因重组工程菌体系和绿锈体系分别对亚硝酸盐氮、肼和亚硝酸盐氮降解处理。在基因重组工程菌脱氮体系中,着重考察实验的影响因素、细菌的性能,并探讨细菌脱氮的机理;实验对GRI-CO_3~(2-)/NO~(2-)体系的影响因素、Eh变化与还原产物的关系进行深入的讨论,并推导绿锈脱氮可能的反应方程式。主要研究结果和结论如下:(1).nirS基因重组工程菌脱氮实验表明,在NO~(2-)-N初始浓度为20mg/L和工程菌投加量30m L条件下,37℃、200rpm振荡反应600min,NO~(2-)-N去除率达80%以上。增加工程菌投加量(0m L至50m L)和NO~(2-)-N初始浓度(10mg/L至65mg/L),NO~(2-)-N的去除率随呈现先增加后减少的趋势。部分碱基基因突变、表达载体及宿主细菌对NO~(2-)-N的去除影响可忽略不计。(2).在nirS基因重组工程菌/NO~(2-)体系中,nirS基因重组工程菌能快速到达稳定期。NO~(2-)-N初始浓度从10mg/L增加至65mg/L时,细菌基本保持在稳定期。随着nirS基因重组工程菌传代数的增加,其脱氮效率保持在70%左右。由于传代过程中基因突变等因素的影响,nirS基因重组工程菌脱氮性能能稳定传至第七代。由于Fe(II)是细菌生长必备的微量元素,添加微量的Fe(II)可促进nirS基因重组工程菌脱氮过程的进行。(3).在HZO基因重组工程菌/N_2H_4体系中,在N_2H_4-N初始浓度为85mg/L和工程菌投加量20m L条件下,37℃、200rpm振荡反应1600min,N_2H_4-N去除率达到78%,且HZO基因重组工程菌在脱氮过程中表现出良好的传代性能:传至第六代N_2H_4-N去除率保持在70%。(4).HZO基因重组工程菌重组蛋白表达实验表明,在20℃、过夜和37℃、5h诱导条件下,重组蛋白成功表达,且具有一定活性。利用SDS-PAGE电泳测定蛋白纯度达90%,采用SK3071非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度为0.58mg/m L。(5).采用共沉淀法制备绿锈GRI-CO_3~(2-),利用XRD、FTIR及XPS等技术对反应前后固体物质表征。GRI-CO_3~(2-)还原NO~(2-)的实验结果表明,在NO~(2-)-N初始浓度150mg/L、投加150m L GRI-CO_3~(2-)悬浊液和初始pH 9.5实验条件下,在540min内,NO~(2-)-N和TN去除率分别达到97.1%和90%。伴随着氧化产物Fe_3O_4的形成,N_2O(71.34%)和N2(14.06%)逐渐产生,少量的NH~(4+)(4.68%)和NO~(3-)(2.97%)也逐渐形成,且Fe_3O_4的投加促进GRI-CO_3~(2-)的还原能力,有利于Fe_3O_4的循环再利用。(6).在GRI-CO_3~(2-)/NO~(2-)体系中,通过计算方程式Eh和调控体系Eh变化发现,还原产物的形成顺序为N_2O、N_2和NH~(4+),且还原产物的形成种类随Eh变化而改变。相比NO~(2-)-N初始浓度,初始pH对Eh的调控和还原产物的形成起决定性作用。通过建立动力学模拟发现,GRI-CO_3~(2-)还原NO~(2-)-N符合一级反应动力学。
陈鹏[6]2013年在《人类肠道病毒B组山东株优势血清型基因重组和进化起源的分子流行病学研究》文中研究说明[背景]人类肠道病毒(HEV)隶属于小核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA)病毒目(Picornavirales)小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus),基因组为单股正链RNA。病毒基因组的5'非编码区含有基因组RNA复制和翻译所需的结构,3'非编码区具有与基因组复制有关的高度保守的二级机构及多聚腺苷酸(polyA)尾。编码区分为结构蛋白编码区(P1)和非结构蛋白编码区(P2和P3)。结构蛋白编码区(P1)依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共4个衣壳结构蛋白。其中VPl蛋白位于病毒颗粒最外侧,含有主要的抗原位点,是进行基因分型和分子流行病学研究最主要的靶基因。根据VP1序列核苷酸差异,HEV分为HEV A组(HEV-A)、B组(HEV-B)、C组(HEV-C)和D组(HEV-D)4个组。目前,HEV-B包含59个血清型,为4个组中所含血清型最多的一组。HEV-B病毒不仅血清型别众多,而且流行范围广泛,可导致多种疾病的暴发流行,加之HEV基因组变异迅速,新的血清型不断出现,因而HEV-B血清型病毒成为当前研究关注的热点之一。早在50多年前,人们就发现RNA病毒间复杂的基因变异。近些年的研究发现,在全球多个脊髓灰质炎(以下简称脊灰)病毒(PV)减毒活疫苗免疫覆盖率低的地区,多次出现由重组后的脊灰疫苗衍生株病毒循环(cVDPVs)导致的脊灰暴发,使消灭脊灰的免疫策略及疾病监测变得更为复杂,也引起人们对HEV遗传变异机制的研究产生了新的兴趣,更加关注HEV基因组的易变性,为研究HEV的进化提供了新的视点。HEV基因组的进化方式包括核苷酸点突变和遗传重组。P1编码区的进化几乎均由核苷酸替换所引起的点突变驱动的。P2和P3区编码病毒复制所需的非结构蛋白和酶,这些多肽蛋白序列的相对保守,功能相对稳定,而大多数点突变对于蛋白和酶的功能来说是不利的,基因重组成为其进化的主要手段。HEV的进化就是基因组的各个部分在以不同方式进化的同时,通过遗传重组而产生出的被自然选择的优势毒株的过程。由于3D编码区位于基因组的3'末端,故比较VP1和3D基因在系统发生上的差异,可作为筛选重组发生的指标。在过去20多年里,山东省从急性弛缓性麻痹(AFP)、无菌性脑膜炎(AM)2种疾病监测病例分离到上千株HEV山东株,其中多数属于HEV-B,且有些HEV-B血清型呈现为优势血清型。HEV感染已成为严重威胁广大人群特别是儿童身体健康与生命安全的重大公共卫生问题之一。因此,运用分子流行病学的方法,通过对HEV-B优势血清型山东株基因序列的分析,探索HEV-B在区域性引入和扩散过程中VP1进化遗传学和居群动力学特征,分析不同血清型间重组在HEV进化中的发生频率,对于HEV所致相关疾病的机制及其预防控制均具有重要的理论和实际意义。[研究目的]1.构建并完善HEV-B山东株优势血清型(CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、 Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30)的VP1区和3D区基因数据库,并对其进行基因特征研究。2.探讨HEV-B山东株优势血清型基因重组的发生,阐明各主要血清型在山东省共循环过程中的基因重组规律及重组基因片段的转移方向和频率。3.分析HEV-B山东株优势血清型的基因序列起源、进化速度及流行史重构等进化起源特征。[研究方法]1.毒株来源：本研究所选毒株来自山东省1989-2010年AFP和AM2种疾病监测病例。实验前接种RD或Hep-2细胞进行病毒增殖。2.基因测序：提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1和3D区基因片段,经1%琼脂糖凝胶电泳后对阳性产物进行序列测定。3.型别鉴定：将各血清型的VP1序列通过NCBI在线提供的BLAST程序与数据库序列进行比对,确定HEV山东株的血清型别。4.生物信息学分析：使用Mega4.0软件,构建VP1区和3D区系统进化树,分析HEV山东株优势血清型基因重组情况。通过BEAST1.6.2软件分析HEV-B山东株优势血清型的进化遗传学特征,重构优势血清型毒株在山东省内的流行史。[主要结果]1. HEV-B山东株优势血清型的确定：在前期研究中,已通过HEV分子生物学定型方法对部分山东株的血清型别进行鉴定。本研究在前期研究基础上继续对1989～2010年分离自山东省AFP和AM监测病例的HEV山东株进行型别鉴定,共鉴别出非脊灰肠道病毒(NPEV)1010株,涵盖58个HEV血清型别。其中,CVA9、CVB3、CVB5、Echo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30这10个血清型在山东省历年HEV检测中共分离到792株,占所有已定血清型分离株的78.4%(792/1010),为HEV-B山东株优势血清型别。2.HEV-B山东株优势血清型基因重组分析：本研究共选取458株HEV-B山东株3D序列进行序列分析。通过构建3D区系统进化树发现,山东省10个优势血清型毒株间在非结构蛋白编码区内存在频繁的基因重组现象,山东株在3D区系统进化树中共划分为13个主要的基因簇。(1)3D区系统进化树显示,每个基因簇所包含血清型别不尽相同,同一血清型的山东株在3D区系统进化树中分处不同的基因簇。每个基因簇的山东分离株归属于2-9个HEV血清型,第1、4、6、8、12、13基因簇为优势基因簇。(2)3D编码区不同基因簇的主要分离时间不完全相同。3D区系统进化树基因簇的最长分离时间跨度为21年,各基因簇平均优势分离时间跨度约为15(14.8+4.6)年。3. HEV-B山东株优势血清型进化起源分析：本研究所选10个HEV-B山东优势血清型毒株的祖先约起源于1885～1913年之间,不同血清型VP1区核苷酸序列每年每个碱基位点的进化速度为1.007×10-3～9.856×10-3。其中,CVA9、Echo6、 Echo7、Echo25血清型山东株与来自中国其他省份和世界各地的分离株存在共同的进化祖先,而CVB3、Echo11、Echo14、Echo19、Echo30血清型山东株仅与中国其他省份的相应毒株有共同的祖先起源。[主要结论]1.CVA9、CVB3、CVB5、Echoo6、Echo7、Echo11、Echo14、Echo19、Echo25、Echo30血清型为山东省HEV-B优势血清型。在长达22年的AFP和AM疾病监测中,本研究所选10个血清型毒株在山东省历年分离数明显高于其他HEV血清型别,并且在山东省局部地区曾多次引起AM等相关疾病的暴发流行,为山东省内共循环毒株的HEV-B优势血清型。2.基因重组是HEV非结构蛋白区重要的进化方式。HEV-B山东株在3D进化树中划分为13个主要的基因簇,各基因簇中HEV-B血清型种类和数量不同。同一血清型山东株位于多个基因簇,而不同基因簇的主要分离时间不完全相同。提示HEV-B山东株非结构蛋白区基因片段转移频繁,存在活跃的基因重组。3. HEV-B山东株优势血清型VP1区核苷酸变异活跃,在山东省内存在多个传播链的共同流行。重构VP1区流行史发现,HEV-B山东株优势血清型的共同祖先起源于97年前,同一血清型的不同传播链在不同的时期进化速度不一致,提示HEV山东株在人群中的进化不符合匀速增长模型和严格分子钟进化方式。
洪文伟[7]2008年在《供热控制决策管理系统的研究和应用》文中研究指明许多供热锅炉控制与管理系统都已实现计算机化,但现实中的锅炉控制现场大量的监测数据并未充分发挥作用。主要表现在对锅炉的供热品质缺乏量化评价,以及对锅炉运行参数优化目标值的设定缺乏理论依据。基于对我国目前供热领域的设备现状和人员素质的基本认识,供热锅炉的计算机控制管理系统设计的指导思想应该是建立人机和谐的供热控制决策管理系统(Control Decision ManagementSystem——CDMS)。CDMS系统利用供热锅炉运行过程中记录的数据,利用控制理论中IE、IAE、ITAE指标,完成统计、数据挖掘、基因重组等逻辑功能。为管理者提供决策依据,以管理促进控制,通过人机和谐的管控一体化,提高生产效率,降低生产消耗。该模式还可适用于许多过程工业现场,可得到广泛的推广。本课题基于实际工程项目,主要设计研究CDMS,具体包括以下三方面内容:1.使用JSP+SQL Setver设计开发供热品质综合评价系统。充分考虑到系统的通用性并进行模块化设计,通过改变设置参数应用到不同的锅炉控制现场。该功能通过JSP编程并利用Tomcat发布在服务器端,管理者可通过局域网在客户端经正浏览器登陆使用。2.供热品质综合评价系统分炉前运行参数工艺评价、原料使用效率评价和安全参数超限评价三部分内容组成。它较为充分的考虑了实际工业现场的各种情况,为管理者提供一个合理的评价结果。系统中设计的月总结查询,班组对比查询和班组得分查询等功能,充分地体现了综合评价系统的三部分内容。3.运用数据挖掘技术中的关联规则法求取运行优化目标值,以此作为司炉工的操作指导与运行目标;借鉴生物工程中的基因重组法进行优化装配,将源于各班组对各台锅炉操作的实际可达的优化目标集成重组,动态地产生一组集各班组操作所长的优化集合,以其供各班组共同进步的标杆与参照,从而提高企业的运行管理水平。
张学瑜, 卜海富, 孙和炎[8]2005年在《基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性》文中研究指明目的:观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系。方法:实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成。以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨(基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨)植入小鼠右股部肌袋内。将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只。术后7,14,21d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性。结果:144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析。①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟。②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好。③各组术后不同时间组织学检查结果为:植入含0.4mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成。植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21d有4只出现新骨诱导。单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生。单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现。表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构。④术后不同时间植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义(P<0.05)。结论:①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力。②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比。
郑燕, 张术丹[9]2009年在《基因重组对企业发展的影响》文中提出随着市场经济的发展,企业的目标已不仅仅是获得满意的利润,还在追求企业的长寿、持续发展。而市场环境的不确定性及高度复杂性等特点又加大了企业持续发展的困难,本文针对这样一种状况,将企业看作生命体,借鉴了生物基因重组的思想,从企业基因重组理论的视角,探讨了企业基因重组对企业发展的影响,并认为企业可以通过基因重组产生企业的差异性和多样性,进而形成了企业难以复制的竞争优势,达到企业的持续发展的目的。
陈兴华[10]2017年在《借助模型建构发展学生的理性思维——以基因重组的概念教学为例》文中研究表明理性思维是生物学科核心素养之一。在教学过程中,引导学生进行模型建构,透彻理解和阐释生命现象及规律,对发展学生的理性思维有着非常重要的价值。以基因重组的概念教学为例,借助物理模型的建构,引导学生深刻理解基因重组的内涵,发展学生的理性思维。
参考文献：
[1]. 基因体外重组与在体编辑介导的肿瘤靶向光学分子成像[D]. 彭景. 天津医科大学. 2016
[2]. 中小企业基因重组与转型成长研究[D]. 段升森. 山东大学. 2013
[3]. 表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因重组鸭瘟病毒的构建[D]. 胡潇. 河北农业大学. 2007
[4]. 新型藻胆蛋白的制备及其在生物传感和染料敏化太阳能电池中的应用[D]. 李文军. 中国科学院烟台海岸带研究所. 2017
[5]. 工程菌技术强化脱氮及绿锈深度脱氮机制研究[D]. 杨兴兴. 上海大学. 2016
[6]. 人类肠道病毒B组山东株优势血清型基因重组和进化起源的分子流行病学研究[D]. 陈鹏. 山东大学. 2013
[7]. 供热控制决策管理系统的研究和应用[D]. 洪文伟. 大连海事大学. 2008
[8]. 基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性[J]. 张学瑜, 卜海富, 孙和炎. 中国临床康复. 2005
[9]. 基因重组对企业发展的影响[J]. 郑燕, 张术丹. 科学与管理. 2009
[10]. 借助模型建构发展学生的理性思维——以基因重组的概念教学为例[J]. 陈兴华. 中学生物教学. 2017