潘刚[1]2004年在《高效甘蓝型油菜遗传转化体系的建立及细胞周期基因的花粉特异表达分析》文中研究说明甘蓝型油菜是我国乃至世界最重要的经济作物之一。传统常规育种技术在油菜重要经济性状的遗传改良中起到重要作用，但随着生产需求对品种要求的日益提高，常规育种技术的局限性也日显突出。因此采用新技术将新的基因资源引入油菜十分必要。利用农杆菌介导的遗传转化引入外源基因为油菜产量、品质、抗性和其它性状的遗传改良提供了新途径，该技术也是现代生物学研究中了解特定基因功能与表达模式不可缺少的手段。但现有农杆菌介导的冬油菜转化程序还存在着严重基因型依赖性和转化周期长等问题，因而限制了该技术的广泛应用。细胞周期基因是一类对植物生长发育有重要影响的功能基因，但它们对植物花粉发育形成的影响还很少研究。 本研究以甘蓝型冬性和半冬性油菜为主要材料，研究了影响冬性和半冬性油菜子叶外植体芽再生和遗传转化的因素；利用优化的遗传转化体系，将拟南芥的细胞周期基因导入春油菜Westar中，研究了细胞周期基因对油菜花粉发育和形态发生的影响；此外，建立了一种利用超声波分离油菜、小麦等花粉细胞核的新方法，借助流式细胞仪对野生型和转细胞周期基因的油菜花粉细胞核进行了DNA含量分析。获得的主要结果如下： 1 通过对培养基、激素配比、预培养时间、蔗糖浓度等影响油菜子叶外植体芽再生因素的优化筛选，建立了适合于冬性和半冬性油菜子叶的优化再生体系。将子叶在附加1 mg／L BA和1 mg／L 2，4-D的MSB5培养基中预培养3天，再转入含有4.5 mg／L BA的MMO培养基中培养，可显着增加芽再生率，并且可将再生周期比对照缩短1／3。在这一条件下10个冬性和半冬性油菜品种的平均再生率达80.82％，其中9个品种的芽再生率均在75％以上，最高可达98.89％。 2 在业已建立的高效快速再生体系的基础上，通过优化预培养和共培养时间，采用合适的选择压，建立了适用于冬性和半冬性油菜的子叶高效快速遗传转化体系。利用这一体系对8个品种进行遗传转化测试，结果遗传转化效率均在12.09％以上，最高的可以达到28.29％。PCR和DNA杂交分析证明了转基因的整合及拷贝数的分布。同时，通过对预培养基的激素配比、MES、对无菌幼苗进行4℃低温处理等因素进行优化，降低了下胚轴褐化率，从而初步建立了适合于冬性和半冬性油菜下胚轴的遗传转化体系。 3 通过对超声波处理时间、分离花粉培养基等因素的研究，利用超声波破碎花粉壁法，成功地分离到比较纯的油菜单核、二核和叁核期花粉细胞核。这些核可用于流式细胞仪DNA含量分析和高纯度的核DNA制备。利用此法，分离的花华中农业大学博士学位论文2004粉细胞核,并用流式细胞仪测定了两个物种不同时期的花粉细胞核的DNA含量。首次探测到油菜成熟花粉群体中存在Zn花粉核。4利用农杆菌介导的遗传转化方法,将花药特异启动子控制下的细胞周期基因导 入春油菜Westar中。并对周期蛋白基因CycDZ转基因后代的花粉发育进行了详 细分析。结果显示:(l)由于周期蛋白基因的表达,导致花粉形态由对照的具 3个萌发孔的花粉变成2个或多个萌发孔的花粉:(2)在转基因的花粉形成过 程中,除了正常的4分体外,还出现了5分体、6分体以及7分体,从而导致 成熟花粉的数目增加;(3)对不同株系的成熟花粉进行了DNA测定,发现有 些株系花粉中ZC DNA含量明显增加。关键词:甘蓝型油菜;农杆菌介导的遗传转化;预培养;细胞周期基因;CycDZ; 超声波;Zn花粉;流式细胞仪
邹智[2]2008年在《油菜安全高效转化体系研究》文中指出随着分子生物学和生物技术的飞速发展，转基因技术取得了长足的进步，仅成功应用于植物的转化方法就不下10种，如何高效地获得单拷贝、无选择标记、稳定可育的转基因植株成为植物遗传转化发展的方向。油菜是最早从基因工程中获益的物种之一，自1986年第‘例转基因油菜诞生至今，油菜遗传转化技术发展迅速，其中，农杆菌介导法以易操作、低费用、插入片段明确、拷贝数低等独特优点成为首选。但传统的农杆菌介导法主要依赖受体细胞的脱分化和再分化过程获得转基因植株，存在基因型依赖性强、操作繁琐、影响因素众多、转化效率低、转化周期长、易发生体细胞变异和出现转基因沉默等缺陷，不依赖受体细胞的脱分化再分化过程、不或很少依赖组织培养的整株转化技术的出现为解决这一矛盾提供了契机。鉴于农杆菌介导的共培转化体系转化周期过长、影响因素众多等问题，本研究构建了含GFP和Gus(插有一拟南芥基因内含子)等易于瞬间表达分析的植物表达载体。利用这些载体对影响农杆菌介导油菜遗传转化效率的因素对进行了系统研究，建立了油菜子叶柄和和下胚轴等外植体的高效瞬间表达体系。在此基础上，通过对影响子叶柄和和下胚轴再生、褐化等的冈素进行优化，最终使稳定转化效率提高到5％以上，成功获得了pBILBar—iGUS、pBINPTII—iGUS、pBILBar-GFP、pNapin—fael RNAi(500，800，1500)、pFael一fael RNAi(500，800，1500)等9个载体的转基因植株。考虑到不同物种、同一物种的不同品种或生态型对农杆菌的敏感性不同，本研究从拟南芥中克隆了影响农杆菌转化的植物因子VIPl和H2AI的全基因序列，并进行了生物信息学分析、载体构建和转化实验，以期通过向油菜等植物导入这些植物因子，探讨其在农杆菌转化中的作用和探索提高植物遗传转化效率的新途径。与此同时，通过借鉴拟南芥等物种中成熟的整株转化体系，本研究在油菜上对花粉管通道法、花粉介导法、花序浸染法、花序喷雾法等进行了一系列摸索。其rfl，用花粉管通道法、花粉介导法、花序浸染法成功获得了转基因油菜，转化效率分别为0．43~／0、0．31％、0．19％。此外，考虑到转基因植物的安全性问题，本研究构建了便于标记基因删除的位点特异性载体Cre／loxP系统，并成功获得了含Cre或loxP的转基因烟草、拟南芥和油菜植株。
张国裕[3]2006年在《甘蓝显性细胞核雄性不育相关基因及其启动子序列的克隆与功能分析》文中提出甘蓝类(Brassica oleracea)作物是世界范围内普遍栽培的重要蔬菜,在我国也有很大的栽培面积,利用雄性不育杂交制种在甘蓝生产上具有重要的意义。但育性作为一个发育性状涉及到雄蕊形态建成及花粉形成中的大量结构与调节基因,任何基因的结构或者表达的变异均会直接影响小孢子的发育而导致雄器败育,因而研究起来非常困难。虽然已经有很多的生理生化、细胞学、分子生物学的研究结果报道,但是要彻底阐明小孢子发育的分子机理尚需要对育性相关基因进行深入广泛的研究,以最终明确各基因间以及基因与雄蕊阶段性发育间的相互关系。本研究利用与甘蓝显性细胞核雄性不育相关的差异表达片段(TDFs Transcript Derived Fragments),通过电子克隆的策略获得了基因BoRALFL1、BoPMEI和BoDHAR的全长序列,并构建了BoRALFL1和BoPMEI基因的正、反义植物表达载体,经农杆菌介导对菜心(Brassica campestris L.var. Parachinesis)与拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行了遗传转化,以探讨其在植株雄蕊发育中的作用;同时克隆了叁个基因的5’端非编码区序列,构建了基因BoRALFL1和BoPMEI 5’端序列的植物表达载体,利用瞬时表达系统与稳定表达系统对其启动子活性进行了研究;利用原核表达系统探讨了BoPMEI蛋白的表达、纯化与蛋白活性分析。获得的主要结论如下:1.快速碱化因子BoRALFL1基因(GenBank序列登录号DQ059310)的cDNA序列全长490 bp,开放阅读框ORF 240bp,编码79个氨基酸。经序列分析,编码蛋白存在长度为28个氨基酸的前导信号肽与多个磷酸化位点,与同源基因RALFL8核酸序列在88 bp上有82%的相似性,推导的氨基酸序列在74个氨基酸上存在56%的相似性;不同植物来源的RALFL蛋白氨基酸序列N-端差异大,C-端序列具有较高的保守性,四个半胱氨酸残基在所有RALF蛋白中位置保守。果胶甲酯酶抑制蛋白基因BoPMEI(GenBank序列登录号DQ116449)的cDNA序列长750 bp,与同源基因AT1G10770在核酸序列与氨基酸序列上分别存在81%与73.8%的相似性。该基因编码一个含有169个氨基酸的蛋白多肽,分子量18.323 kD。预测分析表明N-端存在信号肽(32个氨基酸)与一个跨膜序列结构;可能参与成熟蛋白正确折迭的4个保守半胱氨酸残基在所有的PMEI氨基酸序列中位置高度保守。脱氢抗坏血酸还原酶基因BoDHAR的DNA序列长842 bp,含有两个内含子(+59 bp~
易斌[4]2008年在《甘蓝型油菜隐性核不育基因Bnms1的精细定位和克隆》文中指出杂种优势利用是提高油菜产量、品质和抗性的有效途径。雄性不育是油菜杂种优势利用主要的途径,但是对于雄性不育机理的研究却远远滞后。甘蓝型油菜细胞核雄性不育(GMS)败育彻底,不育性表现稳定,细胞质来源丰富,恢复源广泛,在国内已成为油菜杂种优势利用的重要途径之一。S45AB来源于四川大学,由潘涛等(1988)在Oro中发现的自然突变体衍生而来,经过多代的兄妹交(25代以上)保存,通过杂交试验证明S45A的不育性受两对重迭隐性基因控制(潘涛等,1988)。在近等基因系S45AB中,一个不育位点处于杂合状态,另外一个不育位点处于隐性纯合状态。本研究以S45AB作为基础材料,对处于杂合状态的隐性核不育基因进行了遗传定位和克隆的研究,主要结果如下:1.3年的育性调查结果表明:兄妹交后代的育性分离比稳定在1:1,可育株自交后代的育性比例符合3:1。这一结果进一步证实了在两型系S45AB中控制育性的两个位点中只有一个处于分离状态,我们将这个位点的不育基因命名为Bnms1;另外一个位点处于隐性纯合状态,不育基因命名为Bnms2。2.半薄切片观察发现可育花药和不育花药在减数分裂前没有明显差异。四分体时期四分体没有明显差异,不育花药的绒毡层比可育花药的稍厚。在单核花粉期小孢子差异明显,不育小孢子没有花粉外壁的合成,发育长时间停留在单核花粉期并最终解体;不育花药的绒毡层表现为径向扩大,液泡化明显。S45A败育发生的关键时期在四分体至单核花粉期,绒毡层异常、花粉外壁的缺失是导致败育的主要原因。3.应用AFLP与BSA结合的方法分析近等基因系S45AB,共筛选了2560对AFLP引物组合,获得7个与目的基因(Bnms1)连锁的AFLP标记AF1-AF7。用包含310个单株的近等基因系群体将Bnms1基因定位在标记AF3和AF7之间,标记与基因间的遗传距离分别为1.6cM和0.3cM,标记AF1和AF2与基因共分离。4.回收、克隆了以上7个AFLP特异片段,测序结果表明AF1-AF7的精确长度分别为203bp、241bp、211bp、186bp、187bp、284bp和362bp。通过PCR-walking分离AFLP标记的侧翼序列,将AF1、AF3、AF6和AF7分别延长至7,499bp、997bp、1,203bp和656bp,并转化为4个SCAR标记SC1、SC3和SC6和SC7。用1,974个单株的S45AB近等基因系将Bnms1基因定位在标记SC1和SC7之间,标记与Bnms1基因间的遗传距离分别为0.1cM和0.3cM。5.利用DH群体(Zhongyou821×Bao604)为作图群体,构建了一张包含237个标记的遗传图谱,图谱总长1,625.6cM,包括2个RFLP标记,65个RAPD标记,86个SSR标记,84个SRAP标记。利用两个DH群体(Tapidor×Ningyou7、Zhongyou821×Ba0604)的遗传图谱将不育基因Bnms1定位于N7连锁群,并在N7连锁群上找到一个与Bnms1基因连锁的共显性标记Na12A02,Na12A02与基因的距离为2.6cM。6.以分子标记SC7、SC1和SC6的特异片段为探针筛选Tapidor BAC文库,得到41个阳性克隆。利用标记SC1和SC7将Bnms1基因定位在BAC克隆BAC1上,对克隆BAC1进行shotgun测序。基于BAC序列开发了6个新标记SCS-SC13,在4132个单株群体中Bnms1基因被定位在标记SC8和SC11之间,标记与Bnms1基因间的遗传距离分别为0.05cM和0.15cM,SC8和SC11在BAC克隆BAC1上的物理距离为21.2-kb。7.用21.2-kb的序列检索GenBank的EST数据库和拟南芥数据库(AGIGenes),结果表明该区域存在四个候选基因,四个候选基因在甘蓝型油菜上的排列顺序与拟南芥基因的排列顺序一致。第一个和第四个候选基因是功能未知的基因,第二个候选基因属于NAP类型基因,第叁个候选基因是CYP450基因家族成员,分析认为第二和第叁个候选基因可能与花粉发育相关,以下用G14、G15表示。8.Northern blot分析表明G14和G15的表达量在S45A和S45B之间没有明显差异。在小于1mm、1mm～2mm、2mm～3mm和3mm～4mm四种大小的花蕾之间G14的表达量没有变化,表达水平很低;G15在1mm～2mm、2mm～3mm大小的的花蕾中特异表达。9.比较测序发现,G14在S45A和S45B之间存在2个错义突变,导致第79位的缬氨酸突变为丙氨酸;第226位的丙氨酸突变为丝氨酸。G15在S45A和S45B之间也有2个错义突变,导致第179位的甘氨酸突变为精氨酸;第297位的缬氨酸突变为丙氨酸。10.构建了转基因载体pBnG15、pAtG15RNAi-1和pAtG15RNAi-2,获得了5株甘蓝型油菜的阳性转化植株和2株表现为雄性不育的拟南芥植株。
夏秀云[5]2011年在《甘蓝型油菜雄性不育相关基因BnATA20功能验证》文中指出甘蓝型油菜细胞核雄性不育因其具有不育性彻底,不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险,在杂种优势利用中具有广阔的应用前景,但关于雄性不育的机理研究却相对滞后。雄性不育即不能形成结构和功能正常的花粉,雄蕊的发生是一个非常复杂的过程,包括雄蕊原基形成,孢原细胞出现和分化,孢子体组织各层的形成、分化及凋亡,孢子体细胞的形成和成熟等一系列过程,这个过程受很多花药特异基因调控。目前已在拟南芥、水稻、番茄、烟草等植物中筛选到大量花药特异表达的基因,这些基因发生突变均会引起花药发育异常,导致雄性不育,模式植物不育机理研究给甘蓝型油菜细胞核雄性不育机理的研究提供了基础。BnATA20是从甘蓝型油菜显性核不育材料Rs1046可育和不育的花药构建的差减文库中筛选到差异表达的基因,为了探究其具体功能和败育机制,从以下四个方面展开工作：1.农杆菌介导甘蓝型油菜遗传转化体系进行改善,主要侧重于激素配比,选择最佳激素配比,提高转化效率。2.通过农杆菌介导的遗传转化方法,将BnATA20反义抑制载体导入受体材料甘蓝型油菜华双5号中,观察基因缺失突变体是否败育及败育性状是否稳定遗传。3.通过制作基因缺失突变体花药发育过程的石蜡切片以及扫描电镜、透射电镜等亚细胞观察,了解花药败育特征,探究花药败育机制,验证BnATA20基因主要功能。4.通过RT-PCR及real time PCR等技术确定BnATA20基因在花药中的表达情况,以及育性相关基因在BnATA20突变体中表达情况,确定BnATA20表达特性。主要结论如下：1.在农杆菌介导甘蓝型油菜遗传转化过程中,BAP/Zeatin组合高效诱导愈伤形成和芽分化,以BAP4mg/L和Zeatin 2 mg/L组合诱导愈伤及BAP3mg/L和Zeatin 2mg/L组合诱导出芽具有最佳效果。2.利用农杆菌介导方法获得BnATA20反义抑制植株63株,11株为PCR阳性,其中3株雄蕊瘦小干瘪,雄蕊花丝较短,为雄性不育植株,雌蕊发育正常。3个不育株系与野生型杂交后代都表现为雄性不育,不育性状稳定遗传。3.bnata20突变体花药发育过程的石蜡切片、扫描电镜和透射电镜观察显示,绒毡层细胞在四分体末期开始异常,胞质变稀松,细胞轮廓模糊,细胞之间没有可辨识间隙,并成团向药室入侵；小孢子受挤压,解体凋亡,花药败育。BnATA20基因在单核小孢子至单核花粉粒时期的绒毡层细胞中特异表达,控制绒毡层细胞的形成和早期功能。基因表达分析显示BnATA20调控MS1、NEF、BnA9、BnA6的表达。
郭学兰[6]2009年在《油菜雌蕊原位转基因方法》文中研究指明油菜在分类上属芸苔属植物,包括重要的油料作物和蔬菜。传统的芸苔属植物转基因方法是基于组织培养的根癌农杆菌介导法。这类方法存在的主要问题是转化效率低,转化和再生受基因型影响,重复性差,严重限制了芸薹属作物的基因研究和分子育种。目前甘蓝、白菜和甘蓝型油菜叁物种的全基因组测序即将完成,将产生大量的功能基因。开发一种不依赖于基因型的、高效高通量的油菜转基因方法意义重大,既可以为基因研究创建突变群体,又可以为优良性状的转基因育种研究提供方法和技术平台。本研究借鉴花粉管通道法,通过建立和优化油菜的雌蕊原位转化方法,分析甘蓝型油菜的转化时间、外源DNA溶剂和雌蕊处理方式对转化的影响,研究转基因的遗传规律,建立了一套高效可重复的甘蓝型油菜基因转化体系。继而通过比较不同白菜型油菜、甘蓝和甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律和转化率,得到表达报告基因的除草剂抗性植株,实现了不同类型和基因型油菜的高效转化,扩展了方法的应用范围。在此基础上,本文通过分析外源GUS基因在转化种子中的表达形式,探讨了雌蕊原位转化法的生物学机理,从理论上分析了这种转基因方法的基因型非依赖性和核遗传规律。研究的结果将对油菜的转基因研究和应用起到良好的推动作用。本研究取得的主要结果如下:1.花粉管生长观察。通过对花粉管进行组织化学染色和光镜观察,比较研究了甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝的花粉管生长规律。发现供试的甘蓝品种及甘蓝型油菜品种的花粉管生长规律基本相同,授粉后12～18h在子房中穿行并开始发生90°左右的转折,然后沿珠柄向珠孔延伸。白菜型油菜花粉粒萌发早, 6～8h后花粉管束密集地穿越花柱进入子房。2.转化方法的初步确定。根据油菜花器官特征、授粉受精过程和预实验结果,初步确定了甘蓝型油菜的雌蕊原位转基因方法的操作程序:选择健壮植株上的主花序和上部第一次分枝,去除已经开放的花和角果,去除长度3mm以下的花蕾;剥开1～3d后即将开放的花蕾,去除花药,露出雌蕊的柱头和花柱。人工授粉后切除雌蕊的一小部分柱头,在新鲜的切面上点滴2～3μl质粒溶液(5μg/μl);角果成熟后收获种子。用此方法,从收获的种子中筛选到12株PCR阳性的转基因幼苗。3.以中双9号为转化对象,研究优化了影响该转基因方法的主要因素。1)探索了最适合的转化时间。授粉后6h进行转化,从转化处理的种子中筛选得到了5株除草剂抗性苗,转化率约为1.8%。随着从授粉到转化操作的时间延长,转化率逐渐升高,授粉后12～18h转化的转化效率最高,达到4%,之后转化率很快降低,从21h的2.7%降到24h的0.3%,而27h后转化的效率率为0。据此确定授粉后12～18h为甘蓝型油菜最佳的转化时间。这一时间与花粉管发生向胚囊转折的时间相吻合。转化效率的计算方法为:抗除草剂的转基因幼苗÷处理的雌蕊数×100.2)探索了最佳的雌蕊/柱头的切除方式。结果发现,当花柱被切除一半时,结实率居中,但转化率最高(3.8%);切柱头的一半时结实率最高,转化率仅1.8%;花柱全部切除时结实率最低,转化率也只有0.9%。因此,平衡结实率和转化率,确定花柱切除一半为最佳切除方式。3)探索了最佳的外源DNA溶剂种类。实验以植物表达载体pGreen0229为bar基因供体,分别以0.1×SSC+10mMCaCl2、0.1×SSC、0.5×SSC和1×SSC为溶剂。结果发现,以0.1×SSC+10mMCaCl2为溶剂结实率最高(每角果13.9粒),但转化率仅0.4%;而以0.1×SSC为溶剂结实率最低(每角果11.2粒),转化率最高,为5.4%。平衡结实率和转化率,确定以0.1×SSC为载体溶剂最佳。4.抗除草剂转基因植株的分子验证。分别用PCR和Southern杂交的方法验证抗除草剂植株,并用Southern杂交方法检测外源基因插入的拷贝数。结果表明,每株被测转基因油菜都能扩增到与质粒对照相同的预期条带,而非转基因阴性对照则没有扩增产物。Southern分析显示,转化植株的基因组DNA中均有bar基因插入。5.转基因的遗传和表达。对转基因油菜7个株系自交后代T2、T3进行调查,发现外源基因bar T2代多数株系表现为一对基因的3:1分离,回交后代按1:1分离,与Southern杂交结果一致。T3代可以稳定遗传。正反交结果显示:除草剂抗性表型在供试株系杂种中主要按1:1的比例分离,表明雌蕊原位转化获得的转基因油菜没有细胞质遗传特点。通过构建植物表达载体pGrGUS用于转基因表达的研究发现,甘蓝和甘蓝型油菜转化植株均能够正确表达外源基因GUS。分析转化后的幼嫩种子发现,GUS在种子胚和部分种子的胚乳中均有表达。由于胚和胚乳分别由受精卵和极核细胞发育而来,因此推测受精卵和极核都可能是转化受体,而受精卵更容易被转化。6.雌蕊原位转化法具有物种和品种基因型的非依赖性。依据花粉管生长的特点,将白菜的转化时间调整到授粉后6h,甘蓝及甘蓝型油菜品种的转化时间调整到授粉后15～18h。经除草剂筛选、PCR和Southern鉴定后验证转基因植株。结果表明以中双9号为模式建立起来的雌蕊原位转化体系可适用于2个白菜、2个甘蓝及6个甘蓝型油菜供试品种的基因转化。快生油菜转化率为16.3%,黄籽沙逊转化率为10.3%,绿宝芥蓝为2.7%,甘蓝型油菜品系583为3.1%。7.雌蕊原位转化法创造的突变体。目前从已筛选到的转基因油菜植株及其后代中,发现具有重要农艺性状突变的变异材料,突变包括种子颜色、脂肪酸组成、雄性不育。其中转基因雄性不育突变体油菜05-84,经PCR验证、除草剂涂抹和育性观察,其不育性状与外源bar基因共分离,因此其不育性可能由转基因插入引起。其它突变还包括多个油脂成份改变的突变体、黄籽和叶毛增多等突变体。这些突变体经自交繁殖获得了T2和T3代,突变性状稳定遗传。研究表明本文的转化方法可用于创建突变材料和新种质。
洪晓敏[7]2009年在《甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育相关基因2-I05功能研究》文中认为本研究在获得了甘蓝型油菜细胞核雄性不育相关基因2-I05 cDNA(GenBank登录号EU306599)的基础上,利用生物信息学方法对其进行分析,然后构建反义抑制载体并转化拟南芥和甘蓝型油菜以明确该基因的功能和对拟南芥和甘蓝型油菜植株生长和育性的影响。所做工作及主要结论如下:1.对雄性不育相关基因2-I05基因(GenBank登录号EU306599)进行了生物信息学分析。2-I05的cDNA编码357个氨基酸。其编码蛋白质主要位于细胞核内,在拟南芥中检索到与之同源的RAD23-like蛋白,该蛋白是一种参与DNA核苷酸切除修复的蛋白质。对来自不同植物的9个RAD23-like蛋白质氨基酸序列的系统进化分析结果表明:RAD23-like在氨基酸序列上的进化与植物的进化基本保持一致,同科植物来源的RAD23-like蛋白质较科间植物来源的遗传变异小。2.构建了基因2-I05反义抑制植物表达载体并对拟南芥进行了遗传转化。成功构建了2-I05反义抑制植物表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染的方法将基因2-I05反义序列导入拟南芥Columbia中,收获的种子经30mg/L的潮霉素(Hyg)的抗性筛选,获得了具有潮霉素抗性的T_1代阳性植株23株。但因培养条件差,最终只有4株T_1代拟南芥存活下来;经PCR检测验证,其中有2株为阳性植株。3.对T_2代拟南芥进行了潮霉素(Hyg)的抗性筛选、抗性植株PCR检测、UV处理和RT-PCR检测。RT-PCR结果表明:在组成性启动子的作用下,2-I05反义抑制基因能够在花蕾、叶片中抑制野生型拟南芥中编码RAD23-like蛋白质的同源基因。UV处理结果表明,相对Columbia野生型而言,T_2代拟南芥对UV更为敏感,说明2-I05基因其功能主要是参与了植物体UV损伤修复。实验结果并未证实前人的这一假设即,参与植物体UV损伤修复的2-I05基因能引起植株不育;但该基因可能参与了雄蕊长度的调控。4.尝试了用2种转基因方法将基因2-I05反义抑制植物表达载体导入甘蓝型油菜中。但因载体本身带有潮霉素(Hyg)的抗性基因,Hyg又对甘蓝型油菜外植体毒性过大,所以导致在对甘蓝型油菜转化后外植体的筛选过程中一直未找到合适的筛选浓度;后续工作就未能进行下去。但对所使用的2种转基因方法进行了比较和分析。
范爱丽[8]2009年在《大白菜细胞质雄性不育基因orf224和orf138表达载体构建及遗传转化》文中研究指明线粒体基因组中的开放阅读框orf224和orf138分别是造成PolCMS、OguCMS雄性不育的主要原因,利用这些开放阅读框的特异性表达有可能控制植物育性表达、创制新的雄性不育材料。本研究分别构建了含有组成型启动子ED35S和白菜花药特异启动子(BcA9)的两类不同来源的大白菜PolCMS orf224细胞质雄性不育基因和OguCMS orf138细胞质雄性不育基因的植物表达载体。进一步优化了大白菜离体再生体系,并以携带pWR-CMS7311-orf224表达载体质粒的农杆菌进行了大白菜遗传转化体系研究,获得了转基因植株,为大白菜不育系种质资源创新及细胞质雄性不育机理研究奠定了基础。本试验的主要研究结果如下:1利用PCR技术从萝卜细胞质雄性不育材料B1-5#线粒体基因组中扩增出特异片断orf138,对其进行克隆、测序及序列分析。序列分析表明:获得orf138基因的全序列,开放阅读框完整,该基因与NCBI上报道的orf138序列同源性为99%。2用XbaⅠ和SacⅠ双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确。在构建pWR-CMS7311-orf224基础上,再用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pWR-CMS7311-orf224质粒和pMD18-T-BcA9质粒,将pWR-CMS731-orf224表达载体与BcA9启动子定向连接,把ED35S组成型启动子置换成BcA9白菜花药启动子,得到pWR-BcA9-orf224植物表达载体,酶切和PCR验证pWR-BcA9-orf224载体构建正确。采用快速冻融法,将orf224两个表达载体质粒分别导入农杆菌EHA105。3用BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pMD18-T-orf138和表达载体pWR306后,将orf138基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因orf138的植物表达载体pWR-orf138,通过酶切和PCR验证pWR-orf138载体构建正确。在构建pWR-orf138基础上,再利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pWR-orf138质粒和pMD18-T-BcA9质粒,将pWR-orf138表达载体与BcA9启动子定向连接,ED35S组成型启动子被置换成BcA9白菜花药启动子,得到pWR-BcA9-orf138植物表达载体,通过酶切和PCR验证pWR-BcA9-orf138载体构建正确。采用快速冻融法,将orf138两个表达载体质粒分别导入农杆菌EHA105。4建立了的大白菜子叶段离体再生体系:最优苗态为两片子叶绿色将展平、第一片真叶未露出、小苗直立生长时(播种5-6 d)。最佳切割和接种方式是保留单片子叶,在生长点处(即子叶柄基部和下胚轴交接处),先横切,然后纵切,去除顶芽,切除子叶顶端的1/3,竖直插入培养基。优化的培养程序为外植体先在MS+7.0 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA的培养基上启动培养2-3 d;再转入MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA的芽诱导培养基培养,再生频率最高。在供试的6种基因型材料中,橙色大白菜06J28子叶段再生频率最高,为90.4%,每块外植体再生芽数最高达1.14个。5建立了大白菜遗传转化体系:技术要点是先进行大白菜子叶段切割,子叶段在芽启动培养基(MS+7.0 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA)上预培养2-3 d;投入到活化的农杆菌菌液中浸染5 min,然后在芽诱导培养基(MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA)上共培2-3 d,再转入筛选培养基(MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA+10 mg.L~(-1)AS+5 mg.L~(-1)Hyg+ 500 mg.L~(-1)Cef)中筛选抗性芽。每两周更换一次培养基,最后获得9株06J28大白菜抗性植株。6用携带pWR-CMS7311-orf224质粒的EHA105农杆菌转化06J28大白菜,在获得9株抗性苗中,其中5个植株PCR检测扩增出约690 bp条带,这5个PCR阳性转化植株中有4株GUS染色呈现蓝色。进一步RT-PCR检测有2株在690 bp左右处有明显的条带,初步判断此基因已转入大白菜基因组中,并已经转录。Southern Blotting正在进行中。
刘茜[9]2014年在《转TiERF1基因油菜的获得及分子检测》文中认为油菜是我国重要的油料作物。近年来,由核盘菌所引起的油菜菌核病已成为严重影响油菜生产。推广和选育抗菌核病油菜品种是控制该病害最安全、经济和有效的措施。然而,目前缺乏有效的抗菌核病油菜品种,基因工程技术为油菜抗抗菌核病育种提供了一条新途径。本研究利用已有的单子叶植物表达载体pA20-TiERF1,构建双子叶植物表达载体pBI121-TiERF1,在建立油菜再生体系及遗传转化体系的基础上,采用农杆菌介导法,将TiERF1基因转入甘蓝型油菜湘油15号和中双9号中,获得了转基因油菜植株。主要结果如下：1.pBI121-TiERF1植物表达载体的构建根据TiERFl基因序列,使用primer5软件设计引物,并加入BamH I和SacI酶切位点,采用PCR扩增TiERF1基因,并将其连接到pEASY-T1载体上进行测序。测序结果表明：扩增片段与原有TiERF1序列完全一致,没有发生错配。将pEASY-T1-TiERF1载体和pB1121载体分别用BamH I和Sac I双酶切,将得到的TiERF1片段与pBIl21载体片段连接,构建表达载体pBI121-TiERF1。通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404,并进行菌落PCR检测。2.中双9号再生体系的建立在所筛选的生长素浓度配比中,中双9号最佳预培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2.4-D,最佳分化培养基为MS+3.Omg/L6-BA+0.02mg/L NAA+4.5mg/L AgNO3,再生率为92.5%。3.中双9号和湘油15号遗传体系的优化通过单因素对农杆菌转化效果的研究表明：湘油15号对TiERF1基因最优转化条件为：选取5d苗龄的幼苗,预培养3d、菌液OD600为0.6,侵染5mmin,共培养2d,加入AS200nmoI/L;中双9号对TiERFl基因最优转化条件为：选取5d苗龄的幼苗,预培养3d、菌液OD600值0.4,侵染5min,共培养2d,加入AS200μmol/L。4.中双9号和湘油15号再生植株的获得及分子检测在经过Kan严格筛选后获得湘油15号抗性植株8株,中双9号抗性植株9株。对再生植株进行PCR检测得到湘油15号阳性植株4株,中双9号阳性植株5株,分别占再生植株的50.00%和55.56%。本研究获得了转TiERF1基因油菜。
施松梅[10]2016年在《甘蓝S-位点受体激酶互作相关蛋白的研究》文中认为自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是植物为了限制自交衰败和促进杂交优势,在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要遗传机制。芸薹属植物表现为孢子体自交不亲和性(Sporophytic self-incompatibility,SSI),当前国际前沿对于SSI的分子研究内容主要集中在SI信号转导元件协同作用以抑制自体花粉萌发或花粉管生长的机制上。早期普遍认为在自花花粉落到干性柱头上后,花粉S-位点半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)与柱头S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase,SRK)胞外结构域结合,从而导致SRK的构象发生改变,使其释放原本结合在SRK激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2(Thioredoxin-h-like protein 1/2,THL1/2),激发SRK激酶活性,而后激活的SRK与M-位点受体激酶(M-locus protein kinase,MLPK)发生某种瞬间的相互作用,将SI信号传递到柱头乳突细胞的胞内。接着SRK与臂重复蛋白1(Arm repeat containing 1,ARC1)结合引发ARC1的磷酸化作用与细胞质定位,随后ARC1泛素化Exo70A1,进而致使柱头乳突细胞中水分和一些小分子物质不能正常分泌,最终实现SI反应。然而介导SRK与ARC1互作的核心结构域是怎么样的,ARC1在自交不亲和反应中如何介导亲和因子Exo70A1的泛素化降解还是未知的,甚至ARC1是否是SRK唯一下游底物还存在质疑。虽然近年来人们在甘蓝等芸薹属作物孢子体型自交不亲和信号传导机理研究方面取得了显着进展,但是关于SRK下游信号传导通路组成蛋白的分离与鉴定的研究要滞后得多。自从1998年ARC1被鉴定为SRK的下游靶蛋白后,直至2009年才发现Exo70A1作为自交亲和因子与ARC1发生泛素作用被降解。然而转基因试验发现反义抑制B.napus和A.lyrata中ARC1基因表达,以及过量表达B.napus中Exo70A1基因,均只能部分打破材料的不亲和性,由此说明ARC1-Exo70A1组成的信号通路可能只是SRK下游信号传导途径的其中一个分支。植物受体激酶下游信号传导途径通常都是由多个信号元件和信号分支组成的信号网络。对于自交不亲和信号传导过程,当前国际上普遍认为柱头内还存在其他未知信号元件和信号分支,它们可能与ARC1-Exo70A1分支一起共同参与下游信号传导,在芸薹属和拟南芥不同生态型中,不同的信号分支参与信号传导的效应不同,因此当前研究工作的重点就是分离和鉴定这些未知的信号元件和信号分支并探讨其功能。基于此,本研究以高度自交不亲和甘蓝“A4”为材料,扩增SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过酵母双杂交技术筛选SRK-ARC1-Exo70A1的核心互作模体,基于转录组测序筛选与SRK下游响应自交不亲和反应的泛素靶蛋白,同时克隆得到SRK下游MLPK的新转录本MLPKn1,通过生物信息学分析、q RT-PCR、瞬时表达及转基因等技术研究其功能。获得主要研究结果如下:(1)SRK-ARC1-Exo70A1核心作用结构域的确定利用分子克隆技术从高度自交不亲和甘蓝材料中扩增得到SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过生物信息学分析发现SRK激酶域包含DUF3660、Tyrkc和DUF3403结构域,ARC1包含亮氨酸拉链、卷曲螺旋、U-box及4个ARM结构域,Exo70A1包含亮氨酸拉链、高变区、反式SUMO化修饰模体及一个典型的Exo70结构域。构建21个包含所有不同结构域的截短体,将SRK及其截短体,Exo70A1及其截短体分别亚克隆到p GADT7载体中,ARC1及其截短体分别亚克隆到p GBKT7载体中,用PEG/Li Ac法将获得的重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步通过β-半乳糖苷酶活性检测相互作用强度。结果发现,在SRK-ARC1互作组合中,SRK激酶域和ARC1含C端臂重复区截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,说明它们是构成二者互补界面的核心区段,缩短SRK激酶域中的任何结构域,或减少ARC1任意一个臂重复区,都会影响二者的相互作用。在ARC1-Exo70A1的互作组合中,ARC1含亮氨酸拉链和蜷曲螺旋的截短体与Exo70A1含高变区和反式SUMO化修饰模体的截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,二者是构成ARC1-Exo70A1互作界面的的核心区段;此外,比较SRK-ARC1-Exo70A1之间的β-半乳糖苷酶活性发现SRK-ARC1的作用强度小于ARC1-Exo70A1的作用强度。(2)基于转录组测序筛选出3个新的与S-位点受体激酶互作的泛素蛋白对比未授粉和授粉30 min甘蓝柱头转录组数据,筛选出5个显着差异表达的Bo PUB蛋白基因:Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB34、Bo PUB43和Bo PUB44。其中Bo PUB3和Bo PUB9在自花授粉处理30 min后显着下调表达,Bo PUB34,Bo PUB43和Bo PUB44在自花授粉处理30 min后显着上调表达。对5个Bo PUB蛋白基因的克隆和序列分析发现,5个Bo PUB蛋白均属于植物泛素家族成员,其中Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43、Bo PUB44与ARC1一样属于PUB-ARM家族,Bo PUB34属于Ser/Thr kinase家族。进化分析发现ARC1与Bo PUB9遗传关系最近,Bo PUB3次之,与Bo PUB34遗传关系最远。通过酵母双杂交和GST-pull down检测发现,SRK激酶域与Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43及ARC1的臂重复结构域发生相互作用,且相互作用强度为Bo PUB9>Bo PUB3≈Bo PUB43>ARC1。SRK与Bo PUB44和Bo PUB34均不能发生相互作用。表达分析发现Bo PUB3基因主要在柱头中表达,在自花授粉15 min,30 min和60 min处理后,表达量显着降低,而Bo PUB9和Bo PUB43在所有组织中都表达,我们推测Bo PUB3极有可能作为SRK下游靶蛋白参与自交不亲和反应。(3)甘蓝MLPK同源基因MLPKn1的克隆及表达分析以甘蓝“A4”材料gDNA和柱头cDNA为模板,通过高保真DNA聚合酶扩增得到MLPK的叁个转录本Bo MLPKf1、Bo MLPKf2和Bo MLPKn1。Bo MLPKf1cDNA大小为1215bp,编码404个氨基酸,Bo MLPKf2 cDNA大小为1233bp,编码410个氨基酸。Bo MLPKn1为新获得的转录本,其cDNA大小为1257bp,编码418个氨基酸。Bo MLPKf1和Bo MLPKf2编码的氨基酸之间只有N端不同,Bo MLPKf1和Bo MLPKn1N端均存在典型的豆蔻酰化模体,Bo MLPKf2 N端为疏水结构域。和Bo MLPKf1/2相比,Bo MLPKn1有两个插入序列,一个是在1,102-1,114bp之间有12 bp的插入,另一个是在1,152-1,182 bp之间有30 bp的插入。甘蓝叁个MLPK转录文本均具有一个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。利用半定量分析发现Bo MLPKf1和Bo MLPKn1基因在甘蓝的叶片、花瓣、萼片、雄蕊和柱头中均有表达,Bo MLPKf2在柱头中特异表达。q RT-PCR检测发现自花授粉后Bo MLPKf2相对表达量急剧升高,而15 min后开始急剧下降。Bo MLPKf1和Bo MLPKn1在自花授粉后表达量均略有升高,但变化不显着。利用瞬时表达检测Bo MLPKn1和Bo MLPKf1一样定位在细胞膜上,通过Bi FC技术检测Bo MLPKn1与SRK、ARC1均能在细胞膜上发生相互作用。通过线性分析发现芸薹属MLPKn1基因是拟南芥At APK1b的直系同源基因,而不是以前报道的MLPKf1/2基因。MLPKf1/2基因是在芸薹属和拟南芥物种分化之后出现的,在芸薹属物种中通过与SRK互作引起自交不亲和级联反应,MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,且不参与自交不亲和反应。(4)MLPKn1拟南芥同源基因At APK1b的功能研究MLPKn1基因是拟南芥AtAPK1b的直系同源基因,根据AtAPK1b的gDNA序列特征在第一个外显子和第叁个外显子处设计两个sg RNA位点,并合成sg RNA引物,构建p UC119-At U6-g RNA载体,进而将重组载体连接到Cas9-p G626表达载体中,转化农杆菌GV3101感受态细胞,通过花序侵染法转化拟南芥,获得T0代种子,用0.03%Basta筛选获得T1代转基因植株。经过T1代筛选和PCR测序检测共获得13个拟南芥At APK1b突变单株系。其中有碱基缺失长度为21-509 bp的突变,也有额外碱基插入和碱基突变的现象。观察T1代转基因拟南芥初步表型,发现转基因拟南芥较野生型相比,植株矮小,长势较弱,但能够正常开花结子。(5)S-位点受体激酶相关因子在亲和突变材料中编码序列分析以高度自交亲和“Yellow sarson”材料和不亲和结球甘蓝“A4”材料柱头cDNA为模板,扩增其SRK、MLPK、ARC1和Exo70A1基因编码序列,并以花药cDNA为模板扩增SCR基因编码序列。结果发现各个材料中S-位点受体激酶相关因子均具有完整的编码序列,通过对SCR和SRK基因序列比对发现,甘蓝“A4”材料与甘蓝S28单倍型序列一致,“Yellow sarson”材料与白菜f2单倍型序列一致。氨基酸序列比对发现Bo SRKA4与Br SRKB的一致性为99%,与Br SRKQ之间的一致性为97%。Bo SCR与Br SCRB和Br SCRQ之间的一致性均为92%,有5个氨基酸的差异,Bo ARC1与Br ARC1Q和Br ARC1B的一致性均为93%,Bo Exo70A1与Br Exo70A1B和Br Exo70A1Q之间的序列一致性均为99%,只有一个氨基酸的差异。说明SCR、SRK、ARC1和Exo70A1基因在甘蓝“A4”材料和“Yellow sarson”材料中具有较高的保守性。比较两种材料MLPK氨基酸序列发现,“Yellow sarson”材料的Br MLPKf1/2与甘蓝的Bo MLPKf1/2相比,有6个氨基酸的差异,即Bo MLPKf1中K116-R,L183-I,G194-R,S288-N,T350-N,A365-E。根据前人的研究报道,MLPK的G194突变为R后MLPK不具有自体磷酸化活性。因此,两类材料自交亲和性与SCR、SRK、MLPKn1、ARC1和Exo70A1基因序列差异没有直接的关联,但是否是由MLPK基因的突变引起有待进一步研究。(6)恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性的影响由于“Yellow sarson”材料中MLPK发生突变,MLPKf2在柱头中特异表达。为了检测恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性产生的影响,我们根据MLPKf2基因的全长序列,结合植物双元载体p CAMBIA1300多克隆位点,设计含酶切位点的引物,构建SLR柱头特异性启动子的超表达载体p CAMBIA1300-MLPKf2,通过农杆菌介导法将上述表达载体转化“Yellow sarson”下胚轴和子叶,经预培养、侵染、暗培养、愈伤分化、不定芽增值、生根、移栽等过程,获得“Yellow sarson”转基因植株。提取转基因植株基因组DNA进行PCR检测,结果均能检测到正确的目的片段。通过q RT-PCR检测MLPKf2在转基因植株中的表达水平,结果均能检测到MLPKf2基因的超量表达,说明MLPKf2成功整合到转基因植株中DNA。表型观察发现野生型植株所结种荚正常生长伸长,且多数种荚中可见明显突起,而转基因植株种荚短小、干瘪,几乎看不见突起的籽粒,并且种荚死亡情况严重。说明恢复MLPKf2的表达能部分恢复“Yellow sarson”材料的自交不亲和性。
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