陈炳兰[1]2003年在《孕期弓形虫感染胎盘部位细胞免疫功能的实验研究》文中研究指明目的：探讨孕期胎盘细胞免疫功能在阻断弓形虫感染母婴垂直传播中的作用。方法：1．采用流式细胞仪技术检测外周血及蜕膜T淋巴细胞分化群(cluster of differentiation,CD)CD4~+、CD8~+两个亚群的变化。2．通过弓形虫感染细胞免疫中主要的免疫调节因子γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)的运用，透射电镜观察了IFN-γ对弓形虫感染孕鼠子宫及胎盘部位的免疫保护作用。 结果：1．流式细胞仪测定外周血及蜕膜局部T淋巴细胞CD4~+、CD8~+两个亚群变化的结果显示：在外周感染孕鼠较之未感染孕鼠主要表现为CD4~+T细胞显着增多(P＜0.01)，CD8~+T细胞几乎无改变，CD4~+／CD8~+细胞比值显着增大(P＜0.01)。而在蜕膜，T淋巴细胞的变化表现为CD4~+T细胞减少(P＜0.05)，CD8~+T细胞增多(P＜0.05)，CD4~+／CD8~+细胞比值显着减小(P＜0.01)。2．经透射电镜观察显示：IFN-γ使用组子宫及胎盘组织中虫体数明显减少，活化巨噬细胞增多且杀虫活性明显增强，细胞内虫体大多细胞器蜕变、崩解，有的虫体崩解呈絮状，有的呈无结构的团块状。 结论：1、孕期胎盘局部的细胞免疫功能在阻断弓形虫感染母婴垂直传播中具有重要作用。胎盘作为一个特殊的免疫器官，在急性弓形虫感染早期具有同机体外周不同的免疫应答特点，蜕膜部位CD8~+T细胞的增多，提示胎盘局部对弓形虫的杀伤能力增强，对于阻断弓形虫感染母婴间的垂直传播具有重要作用；而CD4~+T细胞的减少，则可能与蜕膜免疫抑制因素的作用，从而保持胎盘局部的免疫微环境，减少流产的发生有关。2、增强胎盘细胞免 南京医科大学硕士学位论文疫功能对于阻断弓形虫感染母婴垂直传播具有一定的作用。IFN寸作为弓形虫感染中的主要免疫调节因子，可以明显地提高胎盘部位免疫活性细胞对弓形虫的吞噬和杀伤能力，从而显示了其对于阻断弓形虫母婴间垂直传播的免疫治疗作用。
周永华[2]2006年在《弓形虫感染对雄性生殖损害的实验研究》文中研究表明弓形虫病是一种世界范围内广泛存在的人兽共患性疾病，是猪、羊等经济动物感染性繁殖障碍的重要原因，同时也是人类生殖健康损害的感染性因素之一。弓形虫作为专性细胞内寄生的重要机会性致病原虫，进入宿主机体后，能引起包括生殖系统在内的多脏器损害。弓形虫可侵入雄性生殖系统，如睾丸、前列腺、附睾等，引起弓形虫性睾丸炎或雄(男)性不育。实验动物小鼠对弓形虫感染高度易感，常用于建立急性弓形虫病研究的动物模型；实验动物大鼠对弓形虫感染则与人类、猪、羊等的感染相类似，呈现一种亚临床感染经过，因此常用于人类弓形虫病亚临床感染的比较研究。本研究目的是将清洁级雄性实验动物小鼠和大鼠为研究对象，建立弓形虫感染的雄性动物模型；同时将纯化的弓形虫速殖子与正常生育男性精子一起孵育，建立弓形虫人工感染精子的实体模型；以此研究弓形虫感染对雄性生殖的损害作用与一些可能的作用机制，同时探讨阿奇霉素对大鼠雄性生殖损害的药物控制效果。主要研究内容包括：一、弓形虫感染对清洁级实验动物小鼠和大鼠的雄性生殖损害1、弓形虫感染对小鼠雄性生殖机能的影响将1×10~3／mL弓形虫(RH株)速殖子悬液0．3mL腹腔接种清洁级NIH小鼠，感染4天后，将感染小鼠睾丸制成直接印片及病理切片，观察小鼠睾丸的病理学变化及弓形虫侵入生精细胞情况，并对弓形虫感染小鼠的睾丸乳酸脱氢酶—同工酶、精子密度、精子活力、精子畸形数，以及与正常雌鼠交配后雌鼠的怀孕活胎数进行检测。结果显示：弓形虫急性感染小鼠睾丸直接印片中可见生精细胞胞质及核内弓形虫速殖子，睾丸切片病理学改变为生精停滞，精原细胞胞质空泡性变。弓形虫急性感染小鼠的睾丸乳酸脱氢酶—同工酶活性、精子密度、精子活力、以及与正常雌鼠交配后雌鼠怀孕活胎数，均比正常对照低，但精子畸形数则显着升高(P＜0．05)。提示：弓形虫感染对雄性小鼠的生殖机能有明显的影响。2、弓形虫感染对大鼠的雄性生殖损害将2×10~5／mL速殖子腹腔接种成年雄性SD清洁级大鼠，感染9周后，对大鼠血清性激素、精子数、精子活率、活力、精子质量、睾丸酶活性及睾丸组织的病理学进行检测。同时将雄性弓形虫感染大鼠与正常雌性成年SD大鼠按1：2合笼交配1周，于妊娠第21天解剖雌性大鼠，检查雌鼠的黄体数、胎鼠的性别、体重、身长和尾长等。结果表明：弓形虫感染9周，大鼠的睾丸和附睾的相对重量有所下降，精子数、活力、活率降低，血清性激素睾酮水平下降，睾丸组织呈明显的形态学变化。与弓形虫感染雄性大鼠成功交配的雌性大鼠的受孕率和产仔数均显着减少，但胎鼠的平均体重、身长、尾长和胎鼠的性别比例与对照组比较无显着性差异。提示：弓形虫感染对大鼠雄性生埴系统和雄性生育功能均有一定程度的损害。3、弓形虫速殖子体外对人类精子运动功能的影响将经CF-11纯化的活弓形虫(RH株)速殖子悬液，对10例健康生育男性手淫获得、并经上游优化处理的精子进行体外感染孵育。按弓形虫速殖子的虫体含量分成A组(1×10~3／mL)、B组(1×10~4／mL)、C组(1×10~5／mL)、D组(1×10~6／mL)、E组(1×10~7／mL)、F组(空白对照组)，分别孵育，并于0、1、2、4h后取样，应用计算机辅助精子分析系统(CASA)，分别检测其精子运动的直线速度、曲线速度、平均路径速度、头部侧摆幅度、前向性运动百分率等参数，观察精子存活率，精子形态及凝集情况。另将1×10~5／mL纯化的活弓形虫速殖子悬液，在体外与15例经上游优化处理的生育男性精子一起孵育0、2、4、8、16、24 h后，检测其精子运动方式参数。结果显示：弓形虫速殖子与精子体外孵育后，其精子运动速度和前向运动百分率等随虫体含量增加及孵育时间的延长而下降，其他参数与对照组相比也相继出现显着性差异。1×10~5／mL弓形虫速殖子在体外与精子孵育8h后，精子运动速度显着下降。孵育8h、16h后的精子运动方式为原地转圈和锯齿形运动，孵育24h后，精子的运动速度小于10μm／s，有活力精子则全是原地转圈运动。并观察到精子凝集和虫体黏附现象。提示：弓形虫速殖子体外可显着降低精子存活率和抑制精子运动功能，弓形虫速殖子对精子运动速度和运动方式有明显影响。其机制可能与弓形虫速殖子对人类精子的黏附作用和虫体侵入精子形成精子损伤等有关。二、弓形虫感染对小鼠和大鼠雄性生殖损害作用的可能机制研究1、弓形虫感染对小鼠睾丸组织细胞周期和生精细胞凋亡的影响应用流式细胞术检测弓形虫(RH株)感染10~3／mL、10~4／mL、10~6／mL3个剂量组小鼠睾丸组织细胞周期，并设生理盐水和环磷酰胺对照组。应用瑞-姬染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷酸原位末端标记法对弓形虫腹腔感染0．2mL×10~5／mL小鼠的睾丸生精细胞凋亡率进行检测。结果显示：不同剂量的弓形虫感染均可使小鼠睾丸组织细胞各时相的细胞百分数发生变化，并随着剂量的增加，G_0／G_1、S时相的细胞百分数明显减少，与阴性对照组比较差异具有显着性(P＜0．05)。G_2／M时相的细胞百分数逐渐增多，各剂量组与阴性对照组比较差异具有显着性(P＜0．05)。弓形虫腹腔感染小鼠的睾丸生精细胞凋亡率显着高于正常。提示：弓形虫感染可能抑制小鼠睾丸细胞的DNA合成，可引起G_2期细胞阻滞，从而使细胞的有丝分裂延伸。并且弓形虫感染可能有促进小鼠生精细胞凋亡的作用。2、弓形虫感染对大鼠T细胞免疫功能的动态研究应用流式细胞术分别检测腹腔感染经CF-11纤维素纯化的活弓形虫(RH株)速殖子2×10~5／mL悬液2mL后第3、7、14、21、28、35、42、60d大鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的百分率，并应用酶联免疫吸附试验测定其外周血IFN-γ、TNF-α、IL-4等细胞因子水平。结果表明：CD8~+T细胞亚群水平在感染弓形虫后3d、7d、14d、21d时均显着低于正常水平(P＜0．05)，至感染后28d恢复至正常。而CD4~+T细胞亚群水平在整个感染过程中则无显着性变化。CD4~+／CD8~+比值升高，以感染后第14d最为明显；大鼠外周血中IFN-γ和IL-4水平在感染后7d开始升高(P＜0．05)，至感染后60d时仍高于正常水平，TNF-α至感染后28d时方高于正常(P＜0．05)，至感染后60d时也仍高于正常水平。结果提示：大鼠感染弓形虫初期(急性期)可引起其T细胞亚群的分布失衡，但随着感染时间的延长而得到修复。3、弓形虫感染对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响腹腔感染2×10~5／mL活的纯化弓形虫速殖子悬液(CF-11纤维素纯化)2mL于SD大鼠，建立大鼠弓形虫病模型。9周后解剖大鼠，取睾丸制成睾丸组织单细胞悬液，应用流式细胞术检测其细胞凋亡和细胞周期。结果表明：弓形虫感染大鼠睾丸组织细胞凋亡率显着高于正常对照组(P＜0．05)。提示：弓形虫感染可引起大鼠睾丸组织细胞发生凋亡。叁、弓形虫感染对大鼠雄性生殖损害的药物控制研究通过对腹腔感染弓形虫的雄性实验动物大鼠模型进行药物治疗实验，开展了阿奇霉素对弓形虫感染大鼠雄性生殖系统和雄性生育力的保护作用研究，并从睾丸细胞凋亡和细胞周期及外周血NO、T细胞亚群和IFN-γ、IL-4、TNF-α细胞因子水平等方面对阿奇霉素抗弓形虫的作用机制进行了探索性研究。研究结果提示：阿奇霉素可有效地治疗弓形虫感染对大鼠的雄性生殖损害。
周雪[3]2018年在《弓形虫致小鼠不良妊娠原因的RNA-Seq分析》文中研究指明弓形虫可以感染温血动物几乎所有的有核细胞,世界上感染弓形虫的人数大于人口总量的30%,口腔、血液、胎盘均是发生弓形虫感染的重要途径。孕期弓形虫感染导致妊娠异常的比率是正常孕妇的叁倍,导致的不良影响主要表现为不孕、流产、胎儿重吸收、死胎及产出弓形虫携带者。弓形虫可入侵包括子宫在内的多种脏器,并通过如直接损伤子宫、破坏子宫内环境、损伤下丘脑破坏激素调节平衡等多种方式来影响妊娠结局。RH株是国际标准I型虫株,小鼠对其具有高度敏感性,腹腔感染72 h内可在子宫几乎所有种类的细胞的胞浆中检测到弓形虫虫体。转录组测序可以帮助研究者有效地获得机体的基因表达状况和转录调控规律,从而对弓形虫影响机体的生长发育和疾病发生的原因及潜在途径进行全面地分析。利用RNA-Seq技术结合后续的生物信息学分析,可以从基因的差异表达挖掘出导致妊娠异常的关键分子,或从差异基因富集通路的角度解释弓形虫急性感染与某些对妊娠有影响的并发症间的联系。本研究的目的是寻找弓形虫感染致不良妊娠结局的关键基因和通路,以及弓形虫速殖子在孕期如何对宿主具体的妊娠有关的基因进行干扰。我们采用弓形虫RH株速殖子,分别感染妊娠前3天,妊娠后3天以及着床后3天的昆明雌鼠,以与实验组相同时间的生理盐水处理组为对照组,对感染后3天的不良妊娠鼠的子宫样本进行转录组测序,叁组分别检测到4561、2345和2997个显着差异表达基因。我们选择了10个上调和下调的差异表达基因进行荧光定量PCR的验证。并对差异表达基因进行GO注释和KEGG pathway分析,得到差异表达基因与解剖结构发育、转运、细胞分化、胚胎发育、激素生物合成过程、免疫反应等密切相关,且多分布于吞噬、癌症、细胞因子-细胞因子受体等通路。分析发现癌症通路是叁个实验组中差异变化最为显着的通路之一,Wnt signaling pathway又在癌症通路中变化最为显着,且该通路中的Wnt/β-catenin经典通路与胚胎植入和胚胎发育都有密切的关系。通过进一步分析,我们发现弓形虫影响妊娠结局的因素有许多,弓形虫感染引发的妊娠高血压、对子宫内环境的破坏、对胎盘的形成和功能的阻碍以及直接影响胚胎的正常发育都可造成妊娠不良的后果。根据最终的分析结果,我们筛选出几个弓形虫感染后与妊娠密切相关的显着差异表达基因,如Hsd11b2、Ifitm1、CD74、CXCL14等,这些差异表达基因转录水平的变化很可能是弓形虫急性感染引起不良妊娠的原因之一。我们的研究可能有助于鉴定参与弓形虫感染后引发不良妊娠结局的关键基因和通路,并从基因转录差异变化的角度更好地了解弓形虫急性感染孕妇导致不良妊娠结局的原因,并有助于进一步开发新的妊娠期弓形虫病的治疗方法。
晋柏[4]2005年在《重组小鼠Γ-干扰素防治弓形虫感染胎鼠的免疫机制研究》文中提出目的研究重组小鼠γ-干扰素(rmu-IFN-γ)对妊娠期感染弓形虫的孕鼠细胞免疫的影响。方法 妊娠第六～十天孕鼠感染弓形虫并分别给予30μ(治疗组A)、300μ(治疗组B)的rmu-IFN-γ腹腔注射。感染72h后取孕鼠外周血及蜕膜组织,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群(cluster of differentiation,CD)CD4~+T、CD8~+T的水平;腿染色切片光镜观察子宫,胎盘,鼠胚的病理变化;SABC免疫组化法检查鼠胚中的弓形虫抗原阳性率;通过透射电镜观察鼠胚脑组织超微结构变化;统计各组剩余孕鼠的存活时间及孕鼠流产率。结果 1.孕鼠感染弓形虫后外周血及蜕膜CD4~+T、CD4~+/CD8~+T降低(P<0.05),两种剂量的rmu-IFN-γ干预后均能提高CD4~+T、CD4~+/CD8~+T水平(P<0.05);治疗组B可以提高外周血CD8~+T水平(P<0.05);2.A、B两种剂量rmu-IFN-γ治疗组中鼠胚的垂直传播率均低于感染组(P<0.05),且两个治疗组鼠胚脑组织中弓形虫体崩解、蜕变较感染组明显,虫体数目明显减少,孕鼠存活时间较单纯感染组延长(P<0.05);但两组孕鼠流产率与单纯感染组均无显着差异(P<0.05)。上述指标在AB两组之间没有显着差异。结论孕鼠感染弓形虫后外周及蜕膜局部细胞免疫受到抑制,注射适量的rmu-IFN-γ可以逆转CD4~+/CD8~+比值,提高机体的细胞免疫水平,对孕鼠具有一定的保护作用并可降低孕期弓形虫感染垂直传播率。
张玲[5]2015年在《TGF-β1在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究》文中认为目的：本研究旨在探索TGF-β1及TGF-β1/Smad3信号通路在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制。方法：实验将C57BL/6孕鼠分为四组：正常组,弓形虫感染组,感染加TGF-β1治疗组及感染加TGF-β1抗体中和组。用流式细胞术分析各组CD4+T细胞中Foxp3、Treg细胞表面抑制性分子CTLA-4、PD-1的表达和胞内Smad3磷酸化程度；并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胎盘上清中IL-10和TNF-α的表达水平。用Spearman目关性分析统计了pSmad3与Foxp3、CTLA-4、PD-1及细胞因子IL-10和TNF-α的相关性。结果：正常组孕鼠胎盘胎鼠血供正常,形状大小正常；感染组胎鼠血供不足,胎鼠、胎盘形状小,重量轻,胎盘有出血坏死。感染组孕鼠脾脏和胎盘中CD4+T细胞中Foxp3的表达减少,pSmad3表达水平较正常组显着降低,同时Treg细胞的增殖能力明显下降。感染加TGF-β1治疗组孕鼠较感染组孕鼠妊娠结局得到改善,其吸收胎率显着下降,胎鼠重量增加,胎盘出血坏死减轻；同时孕鼠体内pSmad3和Foxp3的表达水平显着升高,Treg细胞数量增多,而且Treg细胞的抑制性功能分子CTLA-4、PD-1表达量增加；母胎界面细胞因子IL-10/TNF-α比值显著升高。而与感染组相比,感染加TGF-β1中和组孕鼠的妊娠结局更加恶化,胎鼠体积更小,重量更轻,胎盘出血坏死加重,吸收胎率也显着增加；且孕鼠pSmad3和Foxp3的表达水平明显降低,Treg细胞数量也明显减少,而且Treg细胞的抑制性功能分子CTLA-4、PD-1表达量降低,IL-10/TNF-α比值显著降低。用Spearman相关性分析发现pSmad3的表达水平与Foxp3、CTLA-4、PD-1及IL-10的表达水平均成正相关,与TNF-α的表达水平成负相关。另外,本研究发现,感染加TGF-β1治疗组和TGF-β1抗体中和组孕鼠Treg细胞的增殖分子Ki-67与感染组相比无明显差异。结论：TGF-β1治疗可通过TGF-β1/Smad3言号通路有效改善孕期弓形虫感染所致的不良妊娠结局。
陈炳兰, 王海琦, 王玲, 卢勤, 周丽玲[6]2003年在《γ-干扰素抗孕鼠弓形虫感染子宫及胎盘部位的超微结构研究》文中研究表明目的 探讨IFN γ对弓形虫感染之孕鼠的免疫保护作用。方法 弓形虫感染 (感染后 72h)及感染前 2 4h加用IFN γ的孕鼠 ,均于受孕 18d脱臼处死 ,取子宫及胎盘组织 ,包埋切片 ,然后经透射电镜观察免疫活性细胞及弓形虫的形态、超微结构的改变。结果 IFN γ使用组子宫及胎盘组织中虫体数明显减少 ,活化巨噬细胞增多且杀虫活性明显增强 ,细胞内虫体大多细胞器蜕变、崩解 ,有的虫体崩解呈絮状 ,有的呈无结构的团块状。结论 IFN γ可明显增强免疫活性细胞的功能 ,对弓形虫感染的孕鼠具有一定的免疫保护作用。
李宁[7]2015年在《滋养细胞胞内DNA识别受体抵抗李斯特菌感染的机制研究》文中研究说明妊娠疾病不仅严重威胁人类生殖健康,还给畜牧业生产造成重大的经济损失。近年来,越来越多的流行病学调查和实验证据表明子宫内感染是导致不良妊娠结局的重要诱因。妊娠期间母体出现全身性的免疫抑制状态以保护胎儿免受母体的免疫排斥,但是却极大地增加了妊娠感染的风险。因此,母-胎界面有效的抵抗子宫内病原感染的分子机制对于维持正常妊娠至关重要。胎盘是胚胎发育过程中的一个附属器官,是胎儿和母体进行营养物质和气体交换的场所。胎盘的天然免疫功能不仅有利于胚泡植入、妊娠建立和维持、胎儿生长发育等正常妊娠进程,同时还有利于积极应对感染或应激损伤刺激,通过局部免疫调节来实现妊娠保护。事实上,妊娠期间母-胎界面免疫系统并非处于完全抑制状态,而是受到来自胎盘天然免疫功能的精细调节,建立了新的免疫平衡状态。胎盘滋养细胞不仅是正常妊娠建立和维持的物质基础,还是母-胎界面特殊的天然免疫细胞。近年来,滋养细胞的免疫学屏障功能逐渐为人们所揭示。其中,滋养细胞表达的天然免疫识别受体在抵抗病原微生物感染、维持母-胎界面微环境免疫平衡中发挥至关重要的作用。尽管滋养细胞天然免疫识别受体的表达模式和功能作用越来越受到关注,但是滋养细胞能否识别病原微生物感染所释放的双链DNA尚不明确,DNA-DNA受体识别信号在妊娠免疫保护中的作用仍有待阐明。因此,我们首先明确了滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达情况。人早孕期滋养细胞表达FI16、AIM2、DHX9/36、LRRFIP1、KU70和ZBP1等多种胞内双链DNA识别受体。HTR-8/SVneo细胞表达除ZBP1以外的多种胞内双链DNA识别受体。其中,IF116主要定位于细胞核,而AIM2主要定位于细胞胞浆。为了分析滋养细胞AIM2和IFI16对胞内双链DNA的识别反应,接下来验证胞内双链DNA对滋养细胞AIM2和IFI16识别信号的影响。结果表明,滋养细胞识别双链DNA后,能够诱导AIM2和IFI16的mRNA和蛋白水平上调表达。双链DNA以时间和剂量依赖的方式促进多种细胞因子和趋化因子表达和分泌。其中,IL-8、IL-6和CXCL10的分泌依赖于p38和JNK信号,但不经由ERK信号；MCP-1的分泌依赖于p38和JNK信号,但不经由IκB和ERK信号；IL-1p的分泌依赖于AIM2炎性体信号；IFN-β的表达依赖于IRF3信号。此外,双链DNA刺激产生的IL-1β、IL-6、IL-8和MCP-1依赖于AIM2,但不依赖于IFl16:mM2和IFI16都能够调节CXCL10的分泌；而双链DNA诱导的IFN-β转录活化依赖于IFI16受体。单核细胞增生李斯特菌是一种广泛存在的、食源性革兰氏阳性胞内寄生菌,它能够打破胃肠道粘膜屏障、胎盘屏障和血脑屏障,导致胃肠炎、胎盘胎儿感染和脑膜脑炎。年龄大于60周岁的老人、新生儿、免疫系统受损的病患以及妊娠妇女感染该菌的几率很高。其中孕产妇感染占据了所有病例报道中的27%,其感染风险也是其他易感群体的20倍。在妊娠期间,单增李斯特菌能够在母-胎界面的子宫蜕膜基底层和胎盘定植和复制,且具有明显的组织细胞专嗜性,能够导致流产、早产、死产、先天畸形、围产期和新生儿发病率和死亡率等不良妊娠结局。尽管单增李斯特菌是妊娠感染的重要病原之一,但是其在母-胎界面的免疫识别和免疫清除机制仍有待阐明。接下来以单增李斯特菌为模式病原菌,建立了小鼠流产模型。实验结果表明,AIM2基因缺失的妊娠小鼠与C57BL/6J妊娠小鼠相比,在感染单增李斯特菌后表现出更为严重的母体阴道出血、子宫角收缩、胎儿吸收、胎儿和胎盘重量减轻、胎儿和胎盘炎性介质分泌增多、胎盘组织损伤和功能障碍等不良妊娠结局。滋养细胞通过识别单增李斯特菌基因组DNA感受单增李斯特菌感染后,能够迅速活化AIM2受体信号,诱导IL-1β、IL-6、IL-8和MCP-1的分泌。滋养细胞DNA-AIM2信号分泌的IL-1p和IL-6能够促进滋养细胞限制单增李斯特菌的胞内增殖；此外,IL-8和MCP-1能够募集嗜中性粒细胞和单核细胞到达母-胎界面杀伤和清除单增李斯特菌,从而起到妊娠免疫保护作用。综上所述,本文的研究表明滋养细胞表达多种胞内双链DNA识别受体,其中AIM2受体能够识别外源性DNA,活化下游信号通路,促进细胞因子和趋化因子分泌,在抵抗单增李斯特菌诱导的不良妊娠结局中发挥妊娠免疫保护作用。
王海凤[8]2013年在《sHLA-G在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究》文中研究表明目的：探索可溶性非经典主要组织相容抗原G（soluble non-classic MajorHistocompatibility Antigen/Human Leukocyte Antigen-G，sHLA-G）在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制。方法：1.体内试验:建立C57BL/6小鼠妊娠期弓形虫感染动物模型，实验分为正常对照组、感染组。感染组于孕8天腹腔注射弓形虫速殖子400条；正常组于孕8天腹腔注射等体积的生理盐水。孕14天，对孕鼠进行眼底静脉取血，断颈处死孕鼠，记录妊娠结局，收集羊水、分离子宫和胎盘，制备胎盘组织上清。ELISA检测孕鼠外周血、羊水及胎盘组织上清可溶性非经典主要组织相溶性抗原（Qa-2）的浓度；制备子宫和胎盘细胞悬液，流式细胞术检测Qa-2受体，即蜕膜NK细胞表面抑制性受体NKG2A表达。2.体外实验:建立滋养层细胞系BeWo细胞体系，分别设正常对照组和弓形虫感染组，ELISA检测其上清分泌液中非经典人可溶性白细胞抗原G(sHLA-G)的水平；建立人早孕期蜕膜NK细胞体系，分别设正常对照组和弓形虫感染组，感染组组内再分别设单纯感染组、sHLA-G干预组（sHLA-G组）及sHLA-G抗体中和组（抗体中和组），用流式细胞术检测蜕膜NK细胞表面抑制性受体KIR2DL4表达。通过以上实验明确妊娠期经弓形虫感染后，母胎界面sHLA-G的变化趋势，并进一步验证sHLA-G与NK细胞抑制性受体KIR2DL4表达的相关性，进而揭示sHLA-G在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制。结果：1.体内试验：正常对照组孕鼠状态较好，行为活动灵活自如，胎盘和胎鼠大小均匀，血供良好，外观肉红色；感染组孕鼠自感染2天后出现耸毛、精神萎靡等现象，感染后7天明显站立不稳、体温下降，胎盘苍白缺血，平均重量下降，胎鼠血供缺乏，大小不一，重量下降。与正常对照相比，感染后胎盘组织上清、羊水及孕鼠外周血Qa-2的浓度明显升高（P＜0.05），蜕膜NK细胞表面的NKG2A的表达亦显着升高（P＜0.05）。2.体外实验：与对照组相比，感染组BeWo培养上清中其sHLA-G水平明显升高（P＜0.05）；与对照组相比，sHLA-G干预组蜕膜NK细胞表面KIR2DL4表达显着升高（P＜0.05）；与sHLA-G干预组相比，sHLA-G抗体中和组蜕膜NK细胞表面KIR2DL4的表达显着降低（P＜0.05）。结论：通过体内外实验均证实弓形虫感染后可导致母胎界面非经典主要组织相容性抗原分泌升高，升高了的sHLA-G导致蜕膜NK细胞表面的抑制性受体KIR2DL4表达升高，sHLA-G及其受体KIR2DL4为母胎界面的参与免疫耐受的一对重要免疫分子，二者表达的升高可能会破坏胎盘免疫防御屏障，而导致弓形虫免疫逃逸，容易穿过胎盘垂直传播，引起胎儿感染，导致流产、胎儿畸形、死胎等不良妊娠结局的发生。
单联喆[9]2002年在《人重组白介素2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群、NK细胞及胚胎的作用》文中研究表明目的：用不同剂量的rhuIL-2给弓形虫感染的孕鼠腹腔注射，研究感染弓形虫后孕鼠的T细胞亚群、NK细胞的动态变化以及rhuIL-2对孕鼠外周免疫及胚胎的作用。 方法：将80只妊娠第0天的BALB／c孕鼠随机分为4组：空白对照组，实验对照组及两个rhuIL-2处理组，每组20只。实验对照组与两个rhuIL-2处理组于妊娠第8天腹腔感染RH株弓形虫速殖子400个／只，空白对照组腹腔注射0.2ml生理盐水；两个rhuIL-2处理组分别于感染-1、0、1天腹腔注射500U(低剂量组)和2000U(高剂量组)的rhuIL-2，实验对照组与空白对照组注射0.2ml生理盐水。于妊娠第10、12、14和16天分别将孕鼠颈椎脱臼处死，每组5只，解剖孕鼠的子宫，观察胚胎发育情况，记录各组孕鼠活胎、死胎、吸收胎、畸胎的数目，计算平均活胎率并比较各组的差异；取妊娠第12天处死的孕鼠的胎盘、胚胎，用4％的甲醛固定，做弓形虫抗原的免疫组化染色，观察胎盘和胚胎弓形虫感染情况，以胚胎感染计算弓形虫的垂直传播率，比较各组的差异。取不同妊娠期处死孕鼠的脾制成淋巴细胞悬液，用流式细胞仪检测各组孕鼠T细胞亚群及NK细胞水平的变化。 结果与讨论：免疫组化结果表明：妊娠第12天已发生弓形虫的垂直传播，胎盘感染弓形虫后，胎盘的滋养层细胞、绒毛间隙均有大量的弓形虫抗原的表达；在孕鼠子宫的腺体和蜕膜细胞胞浆内也有弓形虫抗原的表达。部分孕鼠的胎盘有弓形虫抗原的表达，而胚胎组织却无弓形虫抗原的表达。弓形虫感染胚胎时，弓形虫抗原主要出现在组织分化区。 与空白对照组相比，感染孕鼠脾CD4~+T细胞在各个时期的水平都较低(只0.05)，妊娠第16天后，有轻微的回升;脾CDS+T细胞水平在各个时期呈持续升高的状态，明显高于空白对照组(只0.05)。CD4+/CDS+T细胞比例在妊娠第12、14天都倒置，而妊娠第16天有轻微的回升，但仍低于空白对照组(只0.05)。说明感染弓形虫后，孕鼠T细胞亚群比例失调。感染孕鼠脾NK细胞明显减少，在妊娠各时期的NK细胞都较低，低于空白对照组(只0.05)。孕鼠脾CD4+T细胞水平降低与CDS+T细胞水平升高导致二者比例失调，脾NK细胞水平降低可能是导致弓形虫垂直传播的重要因素。 低剂量rhuIL一2处理组与实验对照组比较，平均活胎率无明显差异，而高剂量处理组明显升高，差异显着(只0.05)。两处理组与实验对照组比较，垂直传播率均明显下降，差异显着(只0.05)。结果显示，一定剂量的rhuIL一2可以使活胎数明显增加、弓形虫的垂直传播率降低，对胚胎起到一定的保护作用。 妊娠第12、14和16天高剂量的rhuIL一2处理组脾CD4+T细胞水平较实验对照组明显升高，可达与空白对照组相近的水平。低剂量组的CD4+T细胞水平与实验对照组相比无明显差异。两rhu1L一2处理组的脾CDS+水平与实验对照组相比，呈明显下降的趋势(只0.05)。总体上看，低剂量的rhuIL一2处理组CD4十/CDS十T细胞比值与实验对照组相比无明显差异，而高剂量组的T细胞亚群比值有所上升，可达空白对照组水平。高剂量rhuIL一2组脾NK细胞数量明显上升，与实验对照组相比有明显差异 (只0.05)，提示rhuIL一2可促进NK细胞的增殖。 结论:成功建立了弓形虫垂直传播动物模型。感染弓形虫孕鼠在妊娠期脾T细胞亚群比例倒置，NK细胞数量明显下降，提示细胞免疫受抑是弓形虫垂直传播的重要因素。RhuIL一2应用于感染弓形虫孕鼠，起到一定保护胎鼠的作用，使活胎数目明显增加，并阻止弓形虫的垂直传播。大剂量rhu工L一2可以使感染孕鼠的CD4+T细胞上升，CDS+T细胞水平降低，从而使二者比例回升，同时也起到促进NK细胞增殖的作用，提高了孕鼠的外周细胞免疫水平，对孕鼠和胚胎起到一定的保护作用。弓形虫抗原在胎盘出现的部位提示，胎盘作为局部免疫屏障具有重要的研究价值。
闻慧琴[10]2015年在《弓形虫多态性毒力相关效应分子GRA15_Ⅱ/ROP 16_(Ⅰ/Ⅲ)致小鼠不良妊娠结局的研究》文中指出背景:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,Tg)是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫,且全球广泛传播,可以感染几乎所有温血动物,严重危害人类健康和畜牧业生产。弓形虫感染宿主引起的弓形虫病有不同的临床表现,主要由弓形虫株毒力及宿主差异所决定。弓形虫可以通过胎盘感染胎儿。在产前筛查中(TORCH检测),弓形虫(T)的先天性垂直传播是导致不良妊娠的重要因素之一。近些年,有研究发现弓形虫感染会导致小鼠不良妊娠结局,其机制包括胎盘调节性T细胞(Treg)数量减少和功能障碍和Th17细胞上调等。弓形虫株毒力与不同基因型携带的效应分子多态性(Effectors polymorphisms)密切相关。已知来源于北美及欧洲人兽弓形虫虫株主要有叁个基因型,即Type I、II和III型;而我国则以Chinese 1(Toxo DB#9)型为优势基因型。弓形虫侵入细胞释放的多态性效应分子蛋白主要包括棒状体分泌的ROPs家族如ROP16、ROP18等;以及致密颗粒分泌的GRA家族如GRA15、GRA5和GRA3等。宿主抗弓形虫感染过程中,弓形虫可以逃避免疫相关杀伤机制,因此巨噬细胞(Mφ)和单核吞噬细胞成为感染早期杀伤和抑制弓形虫的主要效应细胞,在宿主固有免疫应答中发挥关键作用。研究发现,弓形虫I和III型虫株的ROP16蛋白可以磷酸化STAT3、STAT6从而使Mφ激活为旁路激活表型(AAMs,也称为M2),导致IL-4、IL-13的大量产生;弓形虫II型虫株的GRA15蛋白可以直接磷酸化NF-κB p65蛋白,使Mφ激活为经典激活表型(CAMs,也称为M1),导致大量促炎性因子如IL-1β、IL-23和IL-6的释放,诱导Th17和NK细胞的活化。本研究通过对弓形虫的Ⅰ/Ⅲ型虫株携带的多态性ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)和II型虫株携带的GRA15_Ⅱ基因与巨噬细胞相互作用免疫机制研究,揭示二种虫源性效应分子激活巨噬细胞的途径,及其对小鼠不良妊娠结局的影响。目的:研究弓形虫ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)和GRA15_Ⅱ基因转染小鼠巨噬细胞是否能够构建稳转细胞系,及转染以后基因对巨噬细胞表型及结构的影响。针对稳转细胞对小鼠妊娠结局的影响,探讨ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)和GRA15_Ⅱ基因与不良妊娠的关系,并探讨不良妊娠发生过程中免疫机制的改变。方法:扩增弓形虫ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)和GRA15_Ⅱ基因片段,构建慢病毒载体,分别与空病毒载体感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,获得re GRA15_Ⅱ-RAW264.7、re ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)RAW264.7及空病毒稳转细胞株。通过流式检测细胞表面标志PD-L1、PD-L2,ELISA方法检测细胞培养上清细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-6、IL-23、IL-12、IL-1β、IL-17A)和NO及尿素的含量,荧光定量PCR法(q PCR)检测i NOS和Arg-1的转录,蛋白免疫印迹法检测STAT3、STAT6和NF-κB的表达,判断巨噬细胞的偏移/极化方向(M1或M2)。将叁种稳转细胞系送检全基因表达谱芯片分析。分别将稳转细胞株与小鼠脾细胞磁珠分选的CD4+CD62L+T细胞共培养,通过流式、ELISA及q PCR法检测Th17活化指标。构建C57BL/6孕鼠模型,在孕早期7.5天分别输注1x106个re GRA15_ⅡRAW264.7细胞、空病毒-RAW264.7感染细胞或感染PRU虫株200个速殖子,孕中期14.5天处死小鼠,检测胎鼠、胎盘一般情况及组织病理检查,计算吸收率和子宫活胎数;流式分别检测脾脏及胎盘的TH1/TH2/TH17细胞因子表达情况。结果:成功构建re GRA15_Ⅱ-RAW264.7、re ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)-RAW264.7及空病毒-RAW264.7稳转细胞株,流式结果显示叁种细胞系表面分子CD80、CD86均明显高表达;re GRA15_Ⅱ--RAW264.7细胞表面标记PD-L1表达明显上调,培养上清液中炎性因子IL-6、IL-23、IL-1β、IFN-γ、IL-17和NO明显升高,NF-κB入核导致核内NF-κB p65增多,诱导性一氧化氮合酶(i NOS)表达上调;re ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)--RAW264.7表面标记PD-L2增多,上清液中IL-13、IFN-γ和尿素(Urea)水平升高,Arg-1(精氨酸酶-1)明显上调。re GRA15_Ⅱ--RAW264.7细胞与CD4+CD62L+脾T淋巴细胞共培养,流式检测淋巴细胞表面标记和上清中IL-17A升高。与对照组相比,C57BL/6孕鼠输注re GRA15_Ⅱ-RAW264.7细胞组胎鼠吸收率升高,出现大量死胎、胎盘出血、机化现象,子宫活胎数降低;与正常及对照孕鼠相比,脾细胞表面IL-17表达升高,CD4+CD25+Fox P3(Tregs)表达降低。结论:本次研究成功构建小鼠巨噬细胞来源的re GRA15_Ⅱ-RAW264.7、re ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)RAW264.7及空病毒-RAW264.7叁种稳转细胞株,验证GRA15_Ⅱ是介导小鼠Mφ向M1偏移/极化的重要虫源性效应因子;ROP16_(Ⅰ/Ⅲ)是介导小鼠Mφ向M2偏移/极化的重要因素,但和弓形虫感染的巨噬细胞表型相比又存在差别。GRA15_Ⅱ介导的极化巨噬细胞可以活化初始T细胞转化成Th17,输注该细胞可显着导致小鼠不良妊娠结局的发生,提示弓形虫致畸可能与基因型相关的毒力因子(genotypeassociated virulence factor)GRA15_Ⅱ相关。
参考文献：
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[3]. 弓形虫致小鼠不良妊娠原因的RNA-Seq分析[D]. 周雪. 华南农业大学. 2018
[4]. 重组小鼠Γ-干扰素防治弓形虫感染胎鼠的免疫机制研究[D]. 晋柏. 南京医科大学. 2005
[5]. TGF-β1在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究[D]. 张玲. 滨州医学院. 2015
[6]. γ-干扰素抗孕鼠弓形虫感染子宫及胎盘部位的超微结构研究[J]. 陈炳兰, 王海琦, 王玲, 卢勤, 周丽玲. 江苏药学与临床研究. 2003
[7]. 滋养细胞胞内DNA识别受体抵抗李斯特菌感染的机制研究[D]. 李宁. 吉林大学. 2015
[8]. sHLA-G在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用机制研究[D]. 王海凤. 大连医科大学. 2013
[9]. 人重组白介素2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群、NK细胞及胚胎的作用[D]. 单联喆. 山西医科大学. 2002
[10]. 弓形虫多态性毒力相关效应分子GRA15_Ⅱ/ROP 16_(Ⅰ/Ⅲ)致小鼠不良妊娠结局的研究[D]. 闻慧琴. 安徽医科大学. 2015
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