应旭旻, 王笑云, 沈霞[1]2004年在《生物人工肾小管体外构建及对氨基酸、钠离子、肌酐转运功能的研究》文中研究表明目的探讨体外构建生物人工肾小管(RAD)的方法及5h内RAD在体外对肌酐(Cr)、葡萄糖(Glu)、钠离子(Na+)和天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸的转运功能。方法采用猪肾近曲小管上皮细胞株(LLC-PK1)体外培养,然后植入FH66血液滤过器内腔继续培养两周构建RAD。测定RAD对Na+、Cr、葡萄糖及4种氨基酸的转运功能,并与未植入LLC-PK1的滤过系统做对照,并观察哇巴因、根皮苷对转运的特异性抑制作用。结果RAD组肌酐滤过率明显低于对照组(P<0.01)。RAD组Na+、葡萄糖、氨基酸的滤过率在哇巴因及根皮苷作用后明显低于对照组(P<0.01);去除药物抑制因素后,滤过率又能恢复,与对照组比较差异有显着性意义。结论体外构建的RAD具有对氨基酸、葡萄糖、钠离子、肌酐的选择性转运功能,且能在5h内稳定维持。
应旭旻[2]2001年在《生物人工肾小管体外构建及功能测定的研究》文中提出目的 研究用猪肾近曲小管上皮细胞株（LLC-PK1）构建生物人工肾小管（bioartificial renal tubule assist device，RAD）的方法并鉴定其功能，探讨体外构建生物人工肾小管的可行性。方法 采用LLC-PK1细胞株体外培养并传代，培养至一定数量后将细胞以10~5/ml浓度植入血液滤过器（FH66）内腔继续培养。一周后在体外模拟液体滤过，以一定成分的透析液以固定速度通过滤器内腔，测定不同时间点Na~+、Cr、葡萄糖的重吸收率，并观察哇巴因、根皮苷对Na~+、葡萄糖重吸收的影响。以未植入LLC-PK1细胞的同种滤器作为阴性对照。同时以电镜观察空心纤维内细胞形态。结果 RAD组肌酐重吸收率明显低于对照组（6.3±1.39％vs89.9±5.65％，P＜0.01）。在透析液中加入哇巴因及根皮苷前，Na~+、葡萄糖重吸收率与对照组相比无明显差异（Na~+：89.2±6.91％vs86.7±8.52％；Glu：85.1±4.74％vs84.6±6.75％，P＞0.05）。而加入哇巴因与根皮苷后，RAD组Na~+、葡萄糖重吸收率明显降低，对照组则无明显变化，两者有显着性差异（Na~+：11.3±2.07％vs88.5±9.31％；Glu：7.2±0.58％vs90.7±3.62％，P＜0.01）。在透析液中祛除哇巴因及根皮苷后，Na~+、葡萄糖重吸收率又能恢复，与阴性对照组比较差异不明显（Na~+：83.6±7.73％vs85.9±4.81％；Glu：83.9±9.33％vs90.2±9.07％，P＞0.05）。电镜观察显示肾小管上皮细胞与空心纤维内表面紧密贴附。结论 采用LLC-PK1细胞株作为细胞来源构建的RAD同样具有理想的体外选择性重吸收功能。证明本实验中所采用的更为简便的方法构建RAD具有可行性。
应旭旻[3]2004年在《生物人工肾小管的体外构建、功能优化、治疗MODS/MOF并ARF的实验研究》文中提出研究目的 探讨生物人工肾小管的体外构建方法，对急性肾衰竭合并多脏器功能障碍综合征／多器官衰竭(ARF并MODS／MOF)的治疗作用以及通过基因工程的方法使其功能进一步优化(肾小管上皮细胞永生化)，旨在体外能生物性模拟。肾小管功能，完善目前肾替代治疗只能替代肾小球滤过功能之不足，提高肾替代治疗的存活率。 方法 猪肾近曲小管上皮细胞株(LLC-PK1)体外培养后植入血液滤过器(FH66)中空纤维内腔继续培养。期间以MTS方法测定滤器内细胞活性。二周后在体外模拟液体滤过，测定钠离子(Na~+)、钾离子(K~+)、钙离子(Ca~(2+))、肌酐(Cr)、葡萄糖(Glu)及氨基酸重吸收功能的变化。并观察哇巴因、根皮苷对Na~+、Glu、氨基酸重吸收的影响。 应用盲肠结扎和穿孔(CLP)合并双侧输尿管结扎术(UL)制作MODS并ARF猪模型。随机分为RAD治疗组(A组)、假RAD治疗组(B组)、CVVH治疗组(C组)和未治疗组(D组)。观察生命体征、肝肾功能、细胞因子IL-10、TNF-α和生存时间。 在上述实验基础上，进一步构建永生化人肾近曲正义南京医科人学博}学位论文小管上皮细胞株以优化RAD功能。人胚肾细胞株(293细胞)培养后，用RT一PCR方法扩增出ad5EIA基因。Kpnl和Ehol双酶切后与pshuttle CMV载体连接并测序。联合应用Lipofectamine转染原代培养的人肾近曲小管上皮细胞，筛选出阳性克隆，RT一PCR鉴定目的基因的表达，免疫荧光测定蛋白表达。并用MTT及流式细胞仪测定其生长特性。通过AKP、LDH、NAG及钠钾ATP酶的检测明确转化后细胞的功能并与H KZ细胞株作比较。 结果 采用上述方法构建的RAD体外实验中肌醉重吸收率较对照组明显降低(P<0.01);初始RAD组与对照组的Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率无明显差异(P>0.05)。液体中加入哇巴因及根皮普后，Na+、葡萄糖、氨基酸的重吸收率明显降低且与对照组相比有明显差异(P<0.01)。祛除药物抑制因素后，重吸收率又能恢复，与阴性对照组差异不明显(P>0.05)。 利用RAD治疗MODs/ARF动物的实验中，四组动物治疗前平均动脉压(MAP)无显着性差异。RAD组(A组)治疗后血压逐渐回升，MAP显着高于同时间点的假RAD组(B组)、常规CVVH组(C组)和非治疗组(D组)(P<0.01);四组动物治疗前血肌醉(SCr)无显着差异;治疗24hA、C组SCr水平明显低于B、D组(P<0.05)，A、C组之间则无显着性差异。A组治疗后IL一10的峰值显着高于其余叁组 (P<0.01)。A组治疗开始24小时后血TNF一a水平较治疗前显着降低(P<0.05)，亦低于同时间点C组血TNF一a水平(P<0.05);而B、D组治疗过程中各时间点血浆TNF一a水平未见明显变化(P> .05)。A组的平均生存时间为110.25士18.69h，明显长于其余叁组。IF文南京医科人学博}丫一位论文 永生化细胞构建实验中，RT一PCR方法成功从293细胞扩增出ad5E IA基因。经双酶切与载体连接后，测序结果证明重组质粒构建成功。随后应用Lipofectamine转染成功筛选出阳性克隆，能持续生长并稳定传代30代以上。RT一PCR证实ad5EIA基因在转化后细胞的表达，免疫荧光证明了ad5EIA蛋白的表达。MTT测定结果显示ad5EIA表达的人近曲小管上皮细胞与对照组细胞相比，生长速率明显增快(P<0.05)。流式细胞仪结果显示转化后细胞GO/Gl期比例较对照组明显减少(P<0.05)。转化后细胞的AKP、NAG、钠钾ATP酶活性均高于HKZ细胞株 (P<0 .05) 结论 采用LLC一PKI细胞株作为细胞来源构建的RAD具有理想的体外选择性重吸收功能，其功能在5小时内能稳定维持，证明本实验中所采用的更为简便的方法构建RAD具有可行性。 用RAD治疗改善了MODS/MOF的生命指标(如MAP)和肾功能(SC:)，并使血中IL一10升高、TNF一a下降，进而延长了动物生存时间。 利用ad5EIA基因转化原代培养人肾近曲小管上皮细胞具有可行性，转化后的细胞具有永生化特征，其部分功能优于HKZ细胞株，为今后进一步的RAD优化研究打下基础。
应旭旻, 王笑云, 沈霞[4]2001年在《生物人工肾小管体外构建的研究》文中认为目的 :探讨体外构建生物人工肾小管 (RAD)的方法和 RAD重吸收钠离子 (Na+ )、肌酐 (Cr)、葡萄糖 (Glu)的功能鉴定。方法 :采用猪肾近曲小管上皮细胞株 (L L C- PK1)体外培养 ,然后植入 FH6 6血液滤过器内腔继续培养 ,体外制作模拟血液滤过加肾小管细胞的系统 ,即 RAD。测定本系统对 Na+ 、Cr、Glu的重吸收功能 ,并与未植入 L L C- PK1的滤过系统做对照。同时观察哇巴因、根皮苷对重吸收的特异性抑制作用。结果 :实验组 Cr重吸收率较对照组明显降低 (5 .9% :84.8% ,P<0 .0 0 1) ,Na+、Glu重吸收率大于 85 % ,且明显受哇巴因及根皮苷抑制 (重吸收率 <10 % ) ,祛除药物抑制因素后 ,重吸收率又能恢复 ,与阴性对照组比较有明显差异。结论 :本实验在体外成功构建 RAD,并且具有选择性重吸收功能
黄大伟[5]2008年在《生物人工肾单位的构建与体外功能评估》文中进行了进一步梳理研究背景:生物人工肾(bioartificial kidney BAK)是目前治疗终末期肾病的有效方法,BAK是肾脏组织工程研究的重点之一,其研究包括两个方面:生物人工肾小管和生物人工肾小球的研究,目前国外生物人工肾系统已经完成由美国食品药品管理局(FDA)批准的Ⅰ/Ⅱ期临床实验,并取得了令人鼓舞的效果。尽管肾脏组织工程研究已取得了极大的进展,但仍存在关键的问题有待解决。首先,生物人工肾的构建需要数量巨大的种子细胞,因此,如何在单位时间内提高肾脏组织工程种子细胞的产量是发展生物人工肾系统的关键之一。其二,生物人工肾小球或生物人工肾小管各自的功能单一,如何构建既有生物人工肾小球的滤过与抗凝功能、同时又有生物人工肾小管重吸收功能的生物人工滤器是发展生物人工肾系统的关键之二。1.肾脏组织工程种子细胞的问题生物人工肾的种子细胞可以来自体细胞或各种来源的干细胞,但是,若采用正常组织提供种子细胞,由于正常成体细胞在体外增殖的能力有限,因此得到的种子细胞数量较少;而胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源,则受到伦理道德的严格约束;其他来源的干细胞的分离及纯化又受到培养或诱导条件等因素的制约。在本研究的实验研究一中,针对提高单位时间内种子细胞产量的问题,我们应用促细胞增殖的人Nanog基因(hNanog)转染肾脏组织工程的两种种子细胞——人脐静脉血管内皮细胞ECV304与人肾小管上皮细胞HKC,结果显着促进了ECV304细胞与HKC细胞的增殖,因而可提高单位时间内肾脏组织工程种子细胞的产量,此为克服肾脏组织工程种子细胞的不足提供了一条有效的途径。2.生物人工肾小球/小管功能单一的问题目前生物人工肾小球、生物人工肾小管如肾小管辅助装置(renal assistdevice,RAD)只是分别模拟了肾小球、肾小管部分的功能,各自的功能单一,且存在着如下弊端:①由于整个过程需要血液滤过装置和生物人工肾泄茏爸?因而结构较复杂;②生物人工肾小管不具备抗凝功能,需持续给予肝素进行抗凝;③生物人工肾小球无重吸收功能,不能对超滤液中的营养物质进行重吸收,因而影响患者的预后。针对目前BAK系统的缺陷,我们考虑采用如下方法进行改进:把生物人工肾小球与生物人工肾小管进行“组合”,以利于生物人工肾系统功能的复合化。在本研究的实验研究二中,我们把血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC等比例混合后种植在层黏连蛋白包被的AV400滤器中,让构建的生物人工滤器同时兼备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能,形成一个类似生理意义上的“肾单位”,可称之为“生物人工肾单位”。方法:1.制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC,光镜下观察两种细胞转染后细胞形态的状况、同时应用MTT检测转染后细胞增殖的情况;转染hNanog基因48小时后,用BrdU(S期细胞的标志物)间接免疫荧光和流式细胞仪分别检测ECV304与HKC两种细胞处在DNA合成期的细胞数目、处于S期细胞的百分比;经G418筛选获得表达hNanog基因的ECV304—hNanog细胞与表达hNanog基因的HKC—hNanog细胞、鉴定hNanog基因在ECV30—hNanog细胞以及HKC—hNanog细胞中的表达;2.以层粘连蛋白包被的AV400滤器(Fresenius公司0.7m~2)为载体,分别检测ECV304细胞、HKC细胞、ECV304与HKC两者的等比例混合细胞、ECV304—hNanog细胞、HKC—hNanog细胞、ECV304—hNanog与HKC—hNanog两者的等比例混合细胞对聚砜膜中空纤维材料的黏附状况;3.在明确ECV304—hNanog细胞与HKC—hNanog细胞对聚砜膜中空纤维材料黏附状况的基础上,通过ECV304—hNanog与HKC—hNanog等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位,并设立对照组及空白对照组,用Hoechst染色、PKH26/PKH67染色检测两种转染细胞混合种植后在聚砜膜中空纤维上的密度及各自的分布情况,用扫描电镜观察种植细胞的生长状态;4.采用ECV304—hNanog与HKC—hNanog等比例混合种植的方法构建混合细胞生物人工肾单位,设立对照组及空白对照组,在体外对构建的生物人工肾单位进行内分泌功能与重吸收功能的测定,并对其重吸收功能的特性进行研究。结果:1.rAAV2-hNanog转染肾脏组织工程种子细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在ECV304—hNanog细胞及HKC—hNanog细胞中稳定表达;2.ECV304及HKC细胞在转染后的增殖能力显着增强(P＜0.05);3.光镜下观察发现,ECV304与HKC细胞转染前后的细胞形态无明显改变;4.两种细胞转染后,BrdU间接免疫荧光证明ECV304和HKC细胞处于DNA合成期的细胞数量明显增多(p＜0.01);5.两种细胞转染后,细胞周期检测发现ECV304细胞的S期细胞的百分比明显增大(p＜0.01)、HKC细胞的S期细胞的百分比也明显增大(p＜0.05);6.ECV30A—hNanog细胞及HKC—hNanog细胞可在中空纤维的表面混合生长,并形成单层;7.转染细胞混合组(ECV304—hNanog与HKC—hNanog细胞等比例混合种植构建)、转染ECV304组(ECV304—hNanog细胞构建)、转染HKC组(HKC—hNanog细胞构建)及空白组(未种植细胞)比较,转染细胞混合组比转染HKC组及空白组能分泌更高的内皮素(P＜0.01),但低于转染ECV304组(P＜0.05);转染细胞混合组比转染ECV304组与空白组能分泌更高的6-酮-前列腺素F1α,但低于转染HKC组(P＜0.01);转染细胞混合组对葡萄糖、钠的重吸收量显着高于转染ECV304组与空白组(P＜0.01),但低于转染HKC组(P＜0.01)。结论:1.hNanog基因能提高血管内皮细胞ECV304与肾小管上皮细胞HKC的增殖能力,进而增加单位时间内血管内皮细胞与肾小管上皮细胞的产量,此为生物人工肾的快速构建及应用提供了一种新方法;2.采用转染的血管内皮细胞与转染的肾小管上皮细胞混合种植所构建的生物人工滤器,具备生物人工肾小球与生物人工肾小管的功能,可作为一个“生物人工肾单位”,此为生物人工肾系统功能的复合化奠定了实验基础。
毛慧娟[6]2005年在《人肾细胞构建生物人工肾小管治疗MODS猪的实验研究》文中提出背景和目的 肾脏替代治疗已明显改善了肾衰竭患者的预后,使急性肾衰竭(ARF)死亡率降低至30%。但当合并MODS/MOF时,死亡率仍高达60%-100%。面对严峻的挑战,人们设想并已证明这与目前的人工肾治疗仅仅代替了肾小球滤过功能,而忽略了肾小管的替代,不能完成内分泌、代谢、自身调节等多种功能有关。随着细胞治疗和组织工程学的兴起,人们运用组织工程技术构建生物人工肾小管辅助装置(RAD)来完善、补充现有的人工肾之不足。国际上,美国1997年Humes首次用犬肾近端小管细胞株(MDCK)构建RAD,国内本单位于2001年用猪肾近端小管细胞株(LLC-PK1)构建RAD成功。但用猪肾小管细胞构建的RAD,因为是异种生物细胞,不适用于临床治疗。本研究用原代培养的人肾近端小管细胞构建成功RAD,将其应用于整体动物MODS猪模型,观察疗效,为进一步临床试用RAD提供必备的技术平台和实验数据。 材料和方法 (1) 细胞培养 原代培养人肾近端小管细胞,传代并鉴定;(2) 构建RAD用培养的人肾近端小管细胞构建RAD;(3)制作MODS合并ARF猪模型 采用盲肠结扎和穿孔(CLP),加双侧输尿管结扎术(UL)。证实该模型达到MODS诊断指标;(4) RAD治疗 用人肾近端小管细胞构建的RAD,与人工血滤器相连,对ARF合并MODS猪行RAD串联CVVH(连续性静-静脉血液滤过)的治疗。(5) 观察指标 血清Cr、BUN,电解质,血气,血清抗炎因子IL-10、致炎因子TNF-α水平,动物存活时间。(6) 设立对照组 分为RAD治疗组(A组)前后自身对照;假RAD治疗组(B组);未血液净化治疗组(C组)叁组。 结果1 分离纯化人肾近端小管细胞(PTC),培养5-6天后融合成单层细胞,形态呈鹅卵石样,可传代7-9代,鉴定证实为人肾近端小管细胞,重复培养10次,均能稳定获得同样细胞,每克肾皮质可分离培养出6-12×10~6个PTC。
董兴刚[7]2009年在《生物人工肾小管体外构建的初步研究》文中进行了进一步梳理研究背景生物人工肾小管辅助装置(bioartificial renal tubule assist device,RAD)是目前治疗终末期肾脏病的有效方法,RAD是肾脏组织工程研究的重点之一,目前国外RAD已经完成由美国食品药品管理局(FAD)批准的Ⅰ/Ⅱ期临床实验,并取得了令人鼓舞的结果.尽管RAD研究取得了很大的进展,然而,在RAD构建的许多关键问题仍未解决.首先,构建RAD的支架是肾脏组织工程种子细胞生长和增殖的载体,因此如何把支架构建好,是肾脏组织工程研究工作的关键问题之一.其二,中空纤维聚砜膜与种子细胞的更好地黏附,以及其后的生长、增殖、分化等是作好肾脏组织工程研究工作的关键问题之二.构建RAD的支架的问题:RAD的支架可以用血液透析器,例如F60等,但是如果采用F60,其内的中空纤维的滤过有效面积1.2m~2,假如在1.2m~2的纤维上置入的种子细胞并生长,显然面积过大.在本研究的第一章,针对RAD的支架问题,我们研制了一种生物反应器,以此来克服RAD的支架的缺陷提供了一个有效的办法.中空纤维聚砜膜与种子细胞的黏附不能满足需要的问题:目前种子细胞种植在生物反应器的中空纤维聚砜膜上,由于聚砜膜表面的疏水性和粗糙度不佳,致使中空纤维聚砜膜与种子细胞的黏附不佳,针对这一缺陷,我们考虑采用如下方法进行改进:对材料表面进行纳米修饰,材料表面特性对细胞的黏附、增殖、分化和凋亡起重要作用.将材料表面进行纳米修饰是材料改性研究的热点之一.方法1.研制生物反应器,中空纤维管呈同心圆排列,内植1000根聚砜膜中空纤维,有效表面积0.1m~2,将纳米金组装到中空纤维聚砜膜表面,根据纳米金溶液浸泡纤维的时间分别为0h、2h、5h、14h,共四组,得到4种中空纤维聚砜膜/纳米金仿生支架,观察各组中空纤维聚砜膜的粗糙度、吸水性以及材料的表征等情况。2.植入非洲恒河绿猴肾细胞细胞株(CV_1细胞)、鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)等细胞在制备的4种生物反应器内的中空纤维聚砜膜/纳米金仿生支架的中空纤维外腔面,继续培养2周,构建生物人工肾小管,通过采用免疫荧光染色、原子力显微镜和扫描电镜等方法观察中空纤维聚砜膜表面贴壁生长细胞的黏附、铺展、增殖、细胞数目和形貌等变化,以及检测RAD对Na~+、葡萄糖转运功能,观察哇巴因、根皮苷对转运的选择性地抑制作用,并与未植入细胞的空白生物反应器内中空纤维做对照。3.我们自行改良的扫描电镜观察的方法,对样品制备中乙醇脱水进行了改进,用改良的方法,观察材料表面的成片细胞的图形完整性。结果1.我们研制的生物反应器,这种壳体装1000根中空纤维膜,封装的壳体里的中空纤维膜通过试压测试,全通;壳体内的中空纤维膜能做成平板状。2.我们自行改良的方法,结果图片可见,材料表面成片细胞连接,无断裂,图形完整,从而避免了原来常规方法的图片失真的缺陷。3.叁组纳米化与一组未纳米化的材料相比,叁组中空纤维聚砜膜/纳米金的吸水率与未纳米化相比明显增加(P＜0.01),叁组纳米化之间比较,5h组的中空纤维聚砜膜/纳米金的吸水率与2h组、14h组相比明显增加(P＜0.05).4.纳米化与一组未纳米化的材料相比,2h组、5h组中空纤维聚砜膜/纳米金的粗糙度与未纳米化相比明显增加(P＜0.05),叁组纳米化之间比较,5h组的中空纤维聚砜膜/纳米金的粗糙度与2h组、14h组相比明显增加(P＞0.05)..5.叁组纳米化与一组未纳米化的材料相比,叁组中空纤维聚砜膜/纳米金的的细胞数目与未纳米化相比明显增加(P＜0.01),能显着提高种子细胞贴壁及增殖,叁组纳米化之间比较,5h组的中空纤维聚砜膜/纳米金的粗糙度与14h组相比明显增加(P＜0.05).。6.培育14天后的RAD组具有对Na~+和葡萄糖的转运功能,转运率在哇巴因、根皮苷作用后明显降低;去除药物抑制因素后,Na~+、葡萄糖转运率又能恢复,与对照组比较差异有显着性意义(P＜0.01)。结论1.成功地研制生物反应器,并用于构建RAD的支架。2.我们研制了一种扫描电镜的样本制备的新方法,这种方法适合观察中空纤维聚砜/纳米金表面生长的细胞,能真实的观察到成片生长细胞的形貌,避免了原来的常规方法对样品的形态的破坏.3.我们研制了中空纤维聚砜膜/纳米金仿生支架,全部叁组纳米化与一组未纳米化的材料相比能显着提高种子细胞贴壁及增殖,其中5小时组的中空纤维聚砜膜/纳米金的生物学性能最佳,中空纤维聚砜膜/纳米金的表面修饰方法对于中空纤维聚砜膜表面改性有着重要意义。4.初步成功建立了一种体外构建生物人工肾小管的新方法.我们体外构建了生物人工肾小管,其具备RAD的Na~+、葡萄糖选择性转运功能,本研究为RAD的临床应用提供了一定的实验证据。
应旭旻, 王笑云, 沈霞[8]2006年在《应用MTS方法检测生物人工肾小管的细胞活性》文中研究表明目的:探讨应用MTS方法在生物人工肾小管(RAD)构建过程中测定血液滤器中肾小管上皮细胞活性的可行性。方法:采用人肾近曲小管上皮细胞株(HK2)体外培养,然后按不同浓度植入6孔板,应用MTS方法测定490nm吸光度(OD)值,判断其测定值与细胞数量之间的关系。然后将培养的HK2细胞植入FH66血液滤过器内腔继续培养构建RAD,在培养过程中每隔3d用MTS方法测定一次OD值,并与无细胞植入的空白滤器作对照。结果:HK2细胞数在105~106范围内,与OD值呈正相关关系,相关系数(r)为0.985,P<0.01。各时间点RAD组MTS测定均值与对照组相比均有统计学意义(P<0.01,n=5)。RAD组MTS测定值随培养时间的延长而增加,提示RAD在培养过程中细胞增殖。结论:MTS方法能较好地反映RAD内的细胞活性,能在RAD培养过程中作为一种简便有效的手段监测滤器内的细胞活性。
王笑云, 应旭旻, 沈霞[9]2001年在《生物人工肾小管体外构建的研究》文中研究指明血液净化技术的出现使肾衰病人的总体预后大有改善 ,但至今血液净化仍局限于肾小球功能的替代 ,仍不能在体外进行肾小管功能的替代。肾脏 ,特别是肾小管在维持体内酸碱平衡、参与激素代谢、产生细胞因子方面有重要作用 ,如果能通过某种方法在体外模拟替代肾小管的功能
孙京华[10]2010年在《构建表达促红细胞生成素的生物人工肾小管》文中研究表明目的构建可以表达促红细胞生成素(Epo)的新型生物人工肾小管(RAD),并且探索Epo的表达是否影响RAD的转运功能。方法应用标准克隆方法制备真核表达载体pcDNA3.1-hEpo。磷酸钙法转染人肾小管近端上皮细胞(HK-2),G418筛选稳定表达Epo的细胞株。MTT方法测定细胞活性并制作细胞生长曲线。质粒pcDNA3.1-hEpo转染人近端小管上皮细胞株(HK-2细胞),培养后种植到高通量滤器的内腔。酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液、滤器内腔和滤器外腔中Epo表达水平。测定这种新型RAD对钠离子(Na+)、葡萄糖(Glu)的转运功能,并与未植入HK-2细胞的滤器系统做对照。同时观察哇巴因、根皮苷对转运功能的特异性抑制作用。结果成功构建并扩增Epo表达载体pcDNA3.1-hEpo。pcDNA3.1-hEpo转染HK-2细胞并加入G418筛选获得Epo的稳定表达。细胞生长曲线显示转染和未转染的HK-2细胞活性没有显着性差异(P>0.05)。在新型RAD的内外腔观察到Epo的表达。外腔Epo的水平是内腔的37.20% (24h), 42.42% (48h), 51.25% (96h), 45.48% (120h)。新型RAD具有对钠离子和葡萄糖的转运功能,且明显受哇巴因及根皮苷抑制(两者P<0.001),祛除药物抑制因素后,转运功能又能恢复,与传统RAD比较没有明显差异(两者P>0.05)。结论成功构建表达Epo的新型RAD装置,并且Epo的表达没有影响RAD的转运功能。
参考文献：
[1]. 生物人工肾小管体外构建及对氨基酸、钠离子、肌酐转运功能的研究[J]. 应旭旻, 王笑云, 沈霞. 中华肾脏病杂志. 2004
[2]. 生物人工肾小管体外构建及功能测定的研究[D]. 应旭旻. 南京医科大学. 2001
[3]. 生物人工肾小管的体外构建、功能优化、治疗MODS/MOF并ARF的实验研究[D]. 应旭旻. 南京医科大学. 2004
[4]. 生物人工肾小管体外构建的研究[J]. 应旭旻, 王笑云, 沈霞. 南京医科大学学报. 2001
[5]. 生物人工肾单位的构建与体外功能评估[D]. 黄大伟. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[6]. 人肾细胞构建生物人工肾小管治疗MODS猪的实验研究[D]. 毛慧娟. 南京医科大学. 2005
[7]. 生物人工肾小管体外构建的初步研究[D]. 董兴刚. 浙江大学. 2009
[8]. 应用MTS方法检测生物人工肾小管的细胞活性[J]. 应旭旻, 王笑云, 沈霞. 中国中西医结合肾病杂志. 2006
[9]. 生物人工肾小管体外构建的研究[J]. 王笑云, 应旭旻, 沈霞. 南京医科大学学报. 2001
[10]. 构建表达促红细胞生成素的生物人工肾小管[D]. 孙京华. 南京医科大学. 2010
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