陈刚, 陈懂明, 张林[1]2005年在《非小细胞肺癌组织中p73蛋白的表达及其临床意义》文中认为目的: 检测p73蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨其临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测 85例非小细胞肺癌组织及 32例正常肺组织中p73蛋白的表达。结果:肺癌中阳性表达 56例 (65. 9% ),正常肺组织中阳性表达 4例(12. 5% ),两者差异显着 (P<0.01)。肺鳞癌中阳性表达 23例(54. 8% ),肺腺癌中阳性表达 33例(76. 7% ),二者差异显着 (P<0.05);p73在Ⅰ期阳性表达率为 53. 3% (16 /30);Ⅱ期为 58. 8% (10 /17),ⅢA期为 78. 9% (30 /38),p73蛋白在非小细胞肺癌中随着TNM分期的增加表达增强 (P<0.05)。p73在有淋巴结转移的NSCLC(N1-2 )中阳性表达率为 74. 1% ( 40 /54 ),在无淋巴结转移的NSCLC(N0 )中阳性表达率为51. 6% (16 /31)差异显着 (P<0.05)。结论:p73蛋白在肺癌的发生、发展及转移中可能起重要作用。
陈刚[2]2002年在《非小细胞肺癌组织中p73蛋白的表达及其临床意义》文中研究指明前言 肺癌是我国的常见病、多发病，目前原癌基因与抑癌基因和肺癌的相关性研究已经成为国内外肺癌肿瘤分子生物学研究的热点。p73基因是Kaghad于1997年首次发现的p53家族新成员，其定位于1P36.2-1P36.3。其与p53基因在结构和功能上具有相似性，因此有人认为p73基因可能是候选的抑癌基因。但现有研究认为：其表达水平在不同类型的肿瘤中不尽相同，p73的生理功能以及在肿瘤中的作用等问题均有待进一步研究，并成为肿瘤分子生物学和遗传学领域的一个研究热点，p73基因在肿瘤发生，发展中的地位及作用目前尚存在争议。 肺癌发病率和死亡率50年来不断上升，已成为增长最快的一种恶性肿瘤，作为一个世界性难题严重地威胁着人类健康与生命。本研究应用免疫组织化学方法检测和分析原发性非小细胞肺癌中p73蛋白的表达情况，探讨其在肺癌的发生、发展及转移中的作用。 实验材料及方法 实验对象：抽取2000年3月-2000年6月年间中国医科大学附属第一医院胸外科手术切除的85例非小细胞肺癌及32例肺良性病变的正常肺组织。85例病人，最大年龄为80岁，最小为30岁，平均年龄为60.7±2.6岁；男性48例，女性37例。其中鳞癌42例，腺癌43例。所有病例术前均未行化疗和放疗，术中经系统淋巴结廓清，术后经病理证实。分期标准为国际抗癌联盟(UICC)1997年 10月出版的第五版《恶性肿瘤 TNM分类》中的肺癌分期标准，病理分级按1981年世界卫生组织（WHO）公布的标准。 1．切片制备：常规石蜡包埋，切成4微米厚连续切片，每例标本切成3张，备HE染色及p73免疫组化用，另一张作阴性对照。载玻片经APES液处理。 Zi…3染色：切片常规脱腊至水化后，经抗原修复，滴人非抗原性动物血清O0％正常羊血清）封闭，室温下孵育5分钟，PBS液冲洗一次。按S－P试剂盒步骤分别加一、h抗体，DAB，苏木素复染色，中性树胶透明封片。 3．结果判定…3蛋白均定位在细胞核，呈程度不同，基本均匀的棕色反应。阳性细胞率大于10％为阳性。统计学分析：X’检验P＜0．05为有统计学意义。 实验结果 85例非小细胞肺癌中P73蛋白阳性表达结果为56例，占65．9％，阴性结果29例，占34．l％。肺正常组织32例，阳性4例，占12．5％，阴性 28例，占 87．5％。P73蛋白在肺癌中的表达明显高于正常肺组织（P＜0．0门。4二例鳞癌中阳性为23例，占54．8％；43例腺癌中，阳性33例，占 76．7％。X‘统计分析结果表明肺腺癌中 P73蛋白的表达明显高于鳞癌中 P73蛋白的表达（P＜0．05入P73蛋白在不同组织分化的非小细胞肺癌中的表达无显着差异u＞O．05）；叨3在1＋11期阳性表达率为55．3防（2“轩）；111＾期阳性表达率为78．9％u0乃8XP73蛋白在非小细胞肺癌中随着TN M分期的增加表达增强（P＜0．05八85例非小细胞肺癌中有54例伴有肺门及纵隔淋巴结转移（N＿＊，五例无淋巴结转移（NO入统计分析结果：P73在有淋巴结转移的 NSCLC（NI4）中阳性表达率为 74．1％（40乃4人在无淋巴结转移的 NSCLC（N）中 ·2·阳性表达率为引．6％（1601入具有显着差异瞩＜队05人 P73蛋白在男性肺癌患者的阳性表达率为 70．8％门4／48人女性中为59．4％K2乃7人表达无差异（P＞O．05厂小于6O岁的阳性表达为 64．9％汪407人大于等于 60岁的阳性表达率为 66．7％门2／4幻；二者表达也无显着差异河＞0．05人 讨 论 p73基因是 Kaghad等于 1997年发现，其与 P53基因具有相当的同源性。后来根据此序列编码的多肽分子量将其命名为 P73基因。p73基因定位于 lp36．2－lp36．3。p73基因在人体正常组织内有广泛的低水平表达，通过RT－PCR方法在人脑，心，肝，脾，肾等器官组织中均可检测到p73基因的转录。由于p73蛋白与 p53蛋白具有非常相似的结构和功能，有人将其作为一个候选的抑癌基因。后续的研究表明…3基因的表达水平在不同类型肿瘤细胞中不尽相同：本实验中p3在肺癌组织中表达显着强于正常肺组织，未表现出抑癌基因的作用（P＜0．m人本实验也证实了肺癌组织中的确存在p73基因的过渡表达，提示p73基因的过渡表达可能是肺癌发生过程中的分子事件，参与了调控肺癌的发展过程。据此我们分析认为：①P73基因与经典的抑癌基因不同，具有肿瘤特异性，即在肿瘤组织中的表达和基因特征具有个体特异性和组织特异性，在某些肿瘤发生及发展中起抑癌基因作用，而在另一些肿瘤中…3基因的高表达导致肿瘤的发生。本实验证实了肺癌组织中的确存在p73基因的过渡表达，提示这可能是肺癌发生过程中的分子事件，参与了对肺癌发生、发展过程的调控。②p73在肺癌组织中的表达特异性也可能是机体对恶性肿瘤的防御和应激反应。机体力图通过上调P73蛋白的表达来抑制肺癌的发生与发展。 ·3· 本实验也得出p73蛋白的表达与性别，年龄，无关，而与病理类型?
李奇志, 毛永荣, 吴建平, 吴昌鸣, 张胜名[3]2003年在《非小细胞肺癌中p73的表达及意义》文中研究指明目的 探讨p73蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法 NSCLC 40例,用免疫组化二步法检测组织标本中p73蛋白的表达,按组织学分类后进行统计学处理。结果 p73蛋白在肺癌组织中的表达和肺癌淋巴结转移癌组织中的表达均明显上调,分别与肺支气管粘膜上皮不典型增生的表达比较,差异均有极显着意义(P<0.01);p73蛋白的阳性表达在肺癌的不同病理类型及分化程度中比较,差异均无显着意义(P>0.05);p73蛋白阳性表达在伴有淋巴结转移的肺癌组织中与无淋巴结转移的肺癌组织中比较,差异有显着意义(P<0.05)。结论 p73蛋白表达上调可能是NSCLC发生的重要因素;p73蛋白在伴有淋巴结转移的肺癌组织和肺癌淋巴结转移癌组织中表达均上调,推测p73上调可能促进肺癌的浸润与转移,这一基因变化可作为肺癌恶化、预后不良的动态监控标志物。
宋宇[4]2007年在《Survivin、p53、p63、p73、p21在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义》文中研究说明目的检测Survivin、P53、P63、P73、P21在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)组织中的表达及其临床意义，并探讨Survivin、P53、P63、P73、P21之间的相互关系。方法运用SP免疫组织化学染色法，分别检测50例非小细胞肺癌组织及15例肺良性病变及癌旁组织中的Survivin、P53、P63、P73、P21蛋白表达。结果1、Survivin、P53、P63、P73、P21在非小细胞肺癌组织、肺良性病变及癌旁组织中均有表达，但非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于肺良性病变及癌旁组织，其中Survivin在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为62％，在肺良性病变及癌旁组织中的阳性表达率为6.66％；P53、P63在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为66％，在肺良性病变及癌旁组织中的阳性表达率为6.66％；P73、P21在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率为62％，在肺良性病变及癌旁组织中的阳性表达率为13.33％(p＜0.001)。差异均有统计学意义。2、Survivin、p53、p73、p21在不同的病理类型、性别的非小细胞肺癌组织中的表达差异无统计学意义。(p＞0.05)3、Survivin、p53、p63、p73、p21表达和TNM分期有关，TNM分期越晚，Survivin、p53、p63、p73、p21表达越强，其中Survivin在Ⅰ期中阳性表达率为43.48％，Ⅱ期中阳性表达率为71.43％，Ⅲ期中阳性表达率为84.62％；p53在Ⅰ期中阳性表达率为39.13％，Ⅱ期中阳性表达率为85.71％，Ⅲ期中阳性表达率为92.31％；p63在Ⅰ期中阳性表达率为43.48％，Ⅱ期中阳性表达率为78.57％，Ⅲ期中阳性表达率为92.31％；p73在Ⅰ期中阳性表达率为39.13％，Ⅱ期中阳性表达率为78.57％，Ⅲ期中阳性表达率为84.62％；p21在Ⅰ期中阳性表达率为43.48％，Ⅱ期中阳性表达率为64.29％，Ⅲ期中阳性表达率为84.62％(p＜0.05)。差异均有统计学意义。4、Survivin、p53、p63、p73、p21在淋巴结转移组阳性表达率高于无淋巴结转移组，其中Survivin在淋巴结转移组阳性率为77.78％，在无淋巴结转移组阳性率为43.48％(p=0.02，r=4.55)；p53在淋巴结转移组阳性率为85.19％，在无淋巴结转移组阳性率为43.48％(p=0.002，r=7.475)；p63在淋巴结转移组阳性率为81.48％，在无淋巴结转移组阳性率为47.83％(p=0.009，r=5.6)；p73在淋巴结转移组阳性率为85.19％，在无淋巴结转移组阳性率为34.78％(p=0，r=10.781)；p21在淋巴结转移组阳性率为81.48％，在无淋巴结转移组阳性率为39.13％(p=0.003，r=6.844)。其中r为相对危险度。差异均有统计学意义。5、p53、p63、p73在非小细胞肺癌组织中的表达呈正相关，相关系数r=0.7197，p=0.0188。6、p63在鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、肺泡癌、大细胞癌中均有表达，但在鳞状细胞癌中表达明显高于腺癌、腺鳞癌、肺泡癌及大细胞癌(P＜0.05)结论1、Survivin、P53、P63、P73、P21在非小细胞肺癌组织中呈高表达，提示它们可能与非小细胞肺癌的发生发展有密切关系。2、Survivin、P53、P63、P73、P21在非小细胞肺癌中与TNM分期及淋巴结转移有关，提示Survivin、P53、P63、P73、P21可能与非小细胞肺癌的生长、浸润和转移有关。3、P53、P63、P73表达呈正相关，功能具有相似性，可能与P53功能异常导致替代性或损害性的P63、P73表达上调，过度表达的P63、P73可代偿P53的功能有关。4、P63在鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、肺泡癌、腺鳞癌中均有表达，但在鳞状细胞癌中高表达，提示P63可作为非小细胞肺癌诊断的一个辅助指标。对患者治疗及预后具有一定的参考价值。
杨波, 房新志[5]2010年在《非小细胞肺癌组织中p73、BRCA1的表达变化及临床意义》文中认为目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中p73、BRCA1的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测115例NSCLC组织、65例癌旁组织中的p73、BRCA1蛋白。结果NSCLC组织中p73、BRCA1蛋白阳性率(66.96%、60.87%)明显高于癌旁组织(23.07%、15.38%),P均<0.05;p73、BRCA1蛋白表达与NSCLC患者年龄、性别、组织类型、分化程度和淋巴结转移均无关(P均>0.05),p73与BRCA1蛋白表达呈正相关(r=0.194,P<0.05)。结论NSCLC组织中p73、BRCA1表达上调在NSCLC发生发展中起重要作用。
佚名[6]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中研究指明14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
刘瑞芬[7]2013年在《凋亡相关基因P53、Fas/Fasl在非小细胞肺癌中的表达及临床意义研究》文中研究说明1背景及目的肺部恶性肿瘤是目前临床较多见的危害人类生命健康的恶性肿瘤之一,近年来肺癌的发病率逐年增高,发病人群越来越年轻化。肺癌的发生、发展是一个复杂的过程,包括多种基因、多种因素的共同作用,包括原癌基因被激活、抑癌基因失活、凋亡相关基因的异常表达等。P53基因是一种抑癌基因,其可以通过调节转录、稳定基因组等方式,从而抑制肿瘤细胞的周期,抑制肿瘤细胞无限恶性增殖,达到抑制癌基因增殖,肿瘤发展的作用。突变型P53和野生型P53是P53基因的常见两种类型,突变型P53则不同于野生型P53,它是一种促癌基因,与可能发生癌变或已经发生癌变的细胞结合,不能抑制肿瘤细胞的周期。因此与肿瘤的预后差,转移率高,化疗耐药,放疗不敏感有关。Fasl是肿瘤坏死因子家族的叁聚体跨膜蛋白,Fasl与其受体Fas结合而诱导携带Fas的细胞凋亡。最新研究表明Fas/Fasl表达异常是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的新机制。本实验通过对凋亡相关基因P53、Fas/Fasl在非小细胞肺癌中的表达,以及这些基因之间的相关性,为NSCLC的早期诊断、治疗提供实验依据。2对象与方法2.1研究对象实验组：郑州大学第一附属医院病理科2011年～2012年间由胸外科手术切除标本,共60例,均被病理学证实为非小细胞肺癌组织。对照组：已经被病理学证实为非小细胞肺癌的癌旁正常组织(即距肿瘤边缘超过3cm),共20例。所选非小细胞肺癌的患者均为首次发现,之前未接受任何方式的有关抗癌治疗。2.2实验方法本实验通过运用免疫组化(S-P法)检测P53、Fas、Fasl在非小细胞肺癌(肺腺癌、肺鳞状细胞癌)和癌旁的正常组织中的表达。凋亡细胞检测则用TUNEL法。2.3判定标准2.3.1P53、Fas、Fasl的阳性结果判定标准在400倍光镜下随机选取5个视野计数,计数方法为：100个细胞/每视野×5=500个细胞。细胞核内出现棕黄色颗粒表示P53阳性表达,细胞浆/细胞膜内出现棕黄色颗粒表示Fas表达阳性,细胞浆内出现棕黄色颗粒则是Fasl表达阳性。判定因素：显色强度分值+阳性细胞数分值,①细胞显色程度分值设置方法：无棕黄色颗粒,颜色与背景无明显区别记为0分；有棕黄色颗粒,颜色高于背景底色记为1分；有染色较清晰的棕黄色颗粒,介于1分与3分之间记为2分；深棕黄色颗粒多,颜色明显比背景颜色强的记为3分。②阳性细胞比例分值设置方法：0分：无阳性细胞；1分：阳性细胞比例小于10%；2分：阳性细胞比例介于10%-50%；3分：阳性细胞比例大于50%。①+②结果所得分值综合判断阳性表达,最后得分超过或等于4分为表达阳性,低于4分为表达阴性。2.3.2判定凋亡细胞的阳性以及凋亡指数(AI)通过采用TUNEL法检测凋亡细胞,凋亡细胞阳性就是检测出来的那些细胞核被染成棕黄色的细胞。凋亡指数(AI)的计算方法：在400倍视野下任意选取10个视野,计数所测的凋亡细胞,凋亡指数=凋亡细胞总数/计数总细胞数×100%。2.4统计学处理分析本实验所得出的数据均使用的统计软件为SPSS17.0。所运用到的统计方法有：①卡方检验,②卡方检验的连续性校正(理论频数<5),③配对资料的关联性分析(spearman分析),④直线相关分析。检验水准为a=0.05。3结果3.1P53在非小细胞肺癌组织的表达及其与临床病理特征的关系P53阳性表达表现为细胞核染成棕黄色,P53在60例NSCLC中表达的阳性率为58.3%(35/60),P53在正常肺组织中不表达(0/20),两者差异性具有统计学意义(χ2=20.741,P=0.000)。P53在伴有淋巴结转移者的表达的阳性率为70.6%,不伴淋巴结转移者的表达的阳性率为42.3%,两者差异性具有统计学意义(χ2=4.848,P=0.028)。P53的表达与NSCLC患者的自身因素中的性别、年龄、是否吸烟,以及肿瘤因素的肿瘤直径、分化程度、TNM分期、病理分型、有无胸膜转移无关。3.2Fas在非小细胞肺癌组织的表达及其与临床病理特征的关系Fas阳性表达主要定位于细胞膜或细胞浆。Fas在60例NSCLC组织中表达的阳性率为46.7%(28/60),在20例正常组织的表达的阳性率为100%(20/20),两者差异性具有统计学意义(χ2=14.359,P=0.000)。Fas在NSCLC的高分化组中的表达的阳性率为78.6%,在中、低分化组表达的阳性率为37.0%,两者差异性具有统计学意义(χ2=7.468,P=0.006)。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的表达的阳性率为57.5%,Ⅲ、Ⅳ期的表达的阳性率为25%,两者差异性具有统计学意义(χ2=5.658,P=0.017)。Fas的表达与NSCLC患者自身因素中的年龄、性别、是否吸烟,以及肿瘤因素中的肿瘤直径、病理分型、伴或不伴淋巴结转移以及有无胸膜转移无关。3.3Fasl在非小细胞肺癌组织的表达及其与临床病理特征的关系Fasl阳性表达主要定位于细胞浆。Fasl在60例NSCLC组织中表达的阳性率为68.23%(41/60),在20例正常组织中表达的阳性率为15%(3/20),两者差异性具有统计学意义(χ2=17.239,P=0.000)。Fasl在伴有淋巴结转移者表达的阳性率为85.3%,不伴淋巴结转移者中的表达阳性率为53.8%,两者差异性具有统计学意义(χ2=10.431,P=0.001)。Fasl的表达与NSCLC患者自身因素中的年龄、性别、是否吸烟,以及肿瘤因素中的肿瘤直径、病理分型、TNM分期、分化程度、有无胸膜转移无关。3.4NSCLC组织中P53、Fas、Fasl表达的相关性分析应用配对资料的关联性分析结果示：P53和Fas在NSCLC组织中的表达存在负相关(r=-0.361,χ2=7.837,P=0.005)。P53和Fasl在NSCLC组织中的表达存在正相关(r=0.297,χ2=5.284,P=0.022)。Fas和Fasl在NSCLC组织中的表达不存在相关性(r=-0.225,χ2=3.038,P=0.082)。3.5P53、Fas、Fasl与细胞凋亡之间的关系分析采用直线相关分析结果示：P53与凋亡指数(AI)成负相关(r=-0.684,P=0.000),Fasl与凋亡指数(AI)成负相关(r=-0.702,P=0.000)。Fas与凋亡指数(AI)成正相关(r=0.732,P=0.000)4结论1、P53、Fas及Fasl的表达与NSCLC的发生、发展过程关系密切,叁者的表达异常可能作为临床检测NSCLC的新指标。2、P53、Fasl的表达与淋巴结转移有关,Fas的表达与TNM分期有关,有可能用来判断非小细胞肺癌的预后。3、Fas与凋亡指数呈正相关,可能成为治疗非小细胞肺癌的新手段。
陈福春, 陈洪雷, 陶鸿潮, 张玉霞, 叶波[8]2004年在《非小细胞肺癌组织p53基因家族成员的不同表达及意义》文中指出目的 探讨p5 3基因家族成员 p5 3、p63和p73在非小细胞肺癌 (NSCLC)中的不同表达及其临床意义。方法 利用免疫组化S P法在 60例NSCLC和 7例正常肺组织中检测 p5 3、p63和p73蛋白的表达。结果 在NSCLC中 ,p5 3、p63和 p73蛋白的阳性表达率分别为 61.67%( 3 7/60 )、80 .0 0 %( 4 8/60 )和 73 .3 3 %( 4 4/60 ) ;与正常肺组织相比 ,p5 3、p63和 p73蛋白阳性表达率的差异均有显着性 (P <0 .0 5 )。p5 3蛋白表达与肺癌细胞分化程度有密切关系 (P =0 .0 2 3 ) ,而与组织学类型、淋巴结转移和临床分期均无明显关系 (P >0 .0 5 )。p63蛋白表达与肺癌组织学类型 (P =0 .0 0 1)和淋巴结转移 (P =0 .0 2 8)有密切关系 ,而与细胞分化程度和临床分期无明显关系 (P >0 .0 5 )。p73蛋白表达与肺癌的临床病理特征均无明显关系 (P >0 .0 5 )。在NSCLC中 ,p63和p73蛋白表达之间呈显着正相关 (P =0 .0 0 0 1) ,p73与 p5 3蛋白表达之间无显着相关性 (P>0 .0 5 )。结论 p5 3基因家族可能与NSCLC的发生发展有关。p63和 p73蛋白有不同于p5 3蛋白的生物学功能 ,二者可能均起癌基因的作用
胡文霞[9]2017年在《骨膜蛋白在非小细胞肺癌中的作用及相关机制的研究》文中研究表明背景:骨膜蛋白(periostin,POSTN)也被称为成骨细胞特异性因子-2(osteoblast-specific factor 2,OSF-2),是由成骨细胞分泌的一种多功能胞外基质蛋白。据文献报道其在胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多种不同类型的肿瘤中高表达,并由此成为恶性肿瘤转移的候选基因之一。研究显示骨膜蛋白的高表达与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的不良预后密切相关。此外骨膜蛋白还可影响肿瘤细胞对化疗的敏感性,卵巢癌及直肠癌基础研究中表明骨膜蛋白可激活某些信号通路而导致化疗耐药。而骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂(Cisplatin,CDDP)耐药之间的关系及其可能的机制,至今尚未有学者探讨和研究。基于此,本课题系统探讨了骨膜蛋白在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用及其相关的作用机制。第一部分,我们通过梯度增加顺铂给药剂量,构建了人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨了骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。第二部分,通过构建骨膜蛋白过表达载体,在体外研究了过表达骨膜蛋白对顺铂诱导的A549细胞部分生物学行为,如细胞的增殖及细胞周期、细胞凋亡等的影响;同时研究了抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。第叁部分,首先在耐药细胞株A549/CDDP上,通过沉默骨膜蛋白的表达观察细胞相关生物学行为的改变,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的发生及相关作用机制;然后通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。第一部分骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性分析目的:本研究的目的是通过梯度增加顺铂给药剂量,构建人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。方法:对体外培养的A549细胞给予不同浓度的顺铂刺激,并通过MTT法计算其半数抑制率(IC50),然后采用梯度增加顺铂剂量的方法构建A549的顺铂耐药细胞株A549/CDDP。检测不同浓度顺铂作用下A549细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况;并比较两株细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况,研究骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性。统计方法采用单因素方差分析检验。结果:1采用梯度增加顺铂剂量的方法,最终获得在20μM的含顺铂培养基中稳定增长并持续增殖的细胞株,即为顺铂耐药细胞株A549/CDDP。A549/CDDP及A549的半数抑制浓度(IC50)分别为25μM和10μM,A549/CDDP对顺铂的耐药性明显增加。2采用0~30μmol·L-1CDDP处理细胞48h后,检测骨膜蛋白的表达水平。结果显示,随着CDDP浓度的增加,骨膜蛋白的m RNA和蛋白表达水平均呈现增多的趋势。骨膜蛋白的表达水平与CDDP的浓度呈正相关,差异有统计学意义,P?0.01。3耐药细胞株A549/CDDP中骨膜蛋白的m RNA表达水平是亲本细胞株A549的6倍(P?0.05);且A549/CDDP中骨膜蛋白的蛋白表达水平是A549的5.1倍(P?0.05),差异均具有统计学意义。结论:1针对人非小细胞肺癌细胞株A549,通过梯度增加顺铂给药剂量,成功构建了顺铂耐药细胞株A549/CDDP。2通过对A549和A549/CDDP两株细胞耐药性和骨膜蛋白表达的分析,发现骨膜蛋白的表达与非小细胞肺癌顺铂耐药之间呈正相关。第二部分骨膜蛋白对A549细胞部分生物学行为的影响及相关机制目的:分析骨膜蛋白对人非小细胞肺癌细胞株A549的增殖、细胞周期、细胞凋亡等一系列生物学行为的影响;并研究抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。方法:1构建骨膜蛋白过表达质粒载体,将过表达载体通过瞬时转染的方式转入A549细胞中,检测其转染效率。2采用MTT、流式细胞术、Western blot方法检测骨膜蛋白过表达对顺铂诱导的A549细胞生存率、细胞周期、细胞凋亡的影响,检测Stat3/survivin信号通路的活性。3采用质粒共转染的方法同时在A549细胞中过表达骨膜蛋白和沉默survivin,研究骨膜蛋白调控顺铂耐药的可能作用机制。结果:1将构建的骨膜蛋白质粒转入A549细胞之后,可显着提高骨膜蛋白的表达。2 MTT结果提示,同对照组相比,10~30μM CDDP刺激下骨膜蛋白过表达组细胞活力分别增加1.56±0.37、1.62±0.17、3.43±1.82倍(P<0.05);说明外源性过表达骨膜蛋白可显着增加A549细胞对顺铂的抵抗力。3流式细胞术DNA含量检测细胞的周期分布。结果显示:对照组、10μMCDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组G0/G1期细胞数所占百分比分别为:50.04±3.27%,90.30±4.25%,88.2±3.78%,S期细胞所占百分比分别为:46.44±2.31%,8.69±2.79%,8.92±2.81%,转染pc DNA3.1(+)vector对CDDP抑制的周期转换未见明显影响(P>0.05);相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组G0/G1期细胞所占百分比由90.3±4.25%降低到67.49±5.3%,与之对应的S期细胞比例则由8.69±2.79%增加到28.84±2.11%(P<0.05 vs CDDP)。4流式细胞仪Annexin V/PI双染法定量分析A549细胞凋亡情况。结果发现:对照组、10μM CDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组细胞早期凋亡率分别为:2.45±0.56%,26.32±2.21%,27.93±3.71%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:2.57±0.46%,13.02±2.01%,12.33±2.35%;相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组细胞早期凋亡率由26.32±2.21%降低到11.91±2.74%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由13.02±2.01%降低到7.03±2.05%(P<0.05vs CDDP),外源性过表达骨膜蛋白可显着抑制CDDP诱导的A549细胞凋亡。5 Western Blot检测A549细胞Caspase-3的活化情况,结果显示,10μM CDDP刺激细胞后,A549细胞激活型Caspase-3的表达量明显增加,但是过表达POSTN转染组则可明显逆转CDDP对Caspase-3的活化。6 A549细胞株过表达骨膜蛋白后,检测Stat3/survivin信号通路活性的变化,结果显示:同对照组相比,10μMCDDP处理48h可使A549细胞中Stat3的磷酸化水平降低到0.43±0.05倍,过表达骨膜蛋白之后,CDDP诱导的Stat3的磷酸化水平从0.43±0.05增加到0.87±0.09(P<0.05vs.CDDP);10μM CDDP处理48h后,细胞中survivin的表达减少到0.38±0.03倍,过表达骨膜蛋白后,CDDP诱导的survivin的表达水平从0.38±0.03增加到0.79±0.06(P<0.05vs CDDP)。7在过表达骨膜蛋白的A549细胞中沉默survivin之后,流式细胞术分析结果显示:10μMCDDP处理组,骨膜蛋白过表达组细胞早期凋亡率分别为:26.89±2.24%,13.13±1.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:13.24±2.63%,8.42±2.57%;相对于POSTN过表达组,POSTN+S-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.13±1.54%增加到19.97±2.14%(P<0.05 vs POSTN)。除此之外,过表达POSTN可明显抑制A549细胞上CDDP诱导的Caspase-3的活化,但干扰survivin的表达之后,这一抑制作用被逆转(P<0.05 vs CDDP)。结论:成功构建了骨膜蛋白过表达载体,研究表明在A549细胞中外源性过表达骨膜蛋白可通过促进细胞周期转换,促进细胞增殖,同时抑制细胞凋亡,逆转顺铂的促凋亡作用。其作用机制可能是骨膜蛋白激活Stat3/survivin信号通路,进而导致肿瘤细胞产生凋亡抵抗。第叁部分沉默骨膜蛋白逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的体内外研究目的:利用骨膜蛋白干扰sh RNA构建骨膜蛋白低表达的耐药细胞A549/CDDP,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌耐药的发生及相关作用机制;通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。方法:1利用骨膜蛋白干扰sh RNA沉默耐药细胞A549/CDDP中骨膜蛋白的表达,通过MTT、流式细胞术、western blot检测技术观察细胞生存率及细胞凋亡等相关生物学行为的改变。2建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,观察沉默骨膜蛋白的表达对顺铂抑瘤效率的影响,比较分析肿瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的变化。结果:1采用western blot的方法检测经G418筛选后稳定转染P-sh RNA的A549/CDDP中骨膜蛋白的干扰效率。结果显示:P-sh RNA组骨膜蛋白的表达是对照组的0.42±0.09倍,且位置正确。说明转染P-sh RNA可显着降低内源性骨膜蛋白的表达。2 MTT结果显示:同对照组相比,0~30μMCDDP刺激下P-sh RNA组细胞活力分别为1.0±0.05、0.7±0.04、0.64±0.09倍(P<0.05),说明外源性沉默骨膜蛋白可提高耐药细胞株A549/CDDP对顺铂的敏感性。3流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果发现:对照组(A549/CDDP),30μM CDDP处理组,CDDP+C-sh RNA处理组细胞早期凋亡率分别为:2.15±0.41%,13.41±2.43%,15.14±2.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:1.92±0.32%,8.83±2.01%,10.01±2.37%;相对于CDDP处理组,CDDP+P-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.41±2.43%增加到29.87±3.21%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由8.83±2.01%增加到20.13±3.14%(P<0.05 vs CDDP)。4通过对移植瘤体积的测量发现,用药前各组裸鼠移植瘤平均体积未见统计学差异(P>0.05);给予PBS或CDDP干预20天后,C-sh RNA+PBS组、P-sh RNA+PBS组、C-sh RNA+CDDP组、P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积分别为(2900±150.28)、(2100±135.16)、(1630.75±109.60)、(445±41.04)mm3,均大于各组给药前体积(P<0.01),P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积最小。5对移植瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的检测发现:同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平降低到0.63±0.06倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平则进一步降低至0.32±0.03(P<0.05vs C-sh RNA);同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平降低到0.58±0.07倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平则进一步降低至0.21±0.02(P<0.05vs C-sh RNA)。结论:1沉默骨膜蛋白可显着增加人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。2体内研究同样显示沉默骨膜蛋白可提高顺铂的抑瘤效率,并抑制Stat3的磷酸化及其下游靶基因Survivin蛋白的表达。
陈洪雷, 陈福春, 王敏, 陶鸿潮, 张玉霞[10]2003年在《人非小细胞肺癌组织p63和p73的表达及意义》文中认为目的 :探讨p5 3家族新成员p6 3和p73在非小细胞肺癌 (NSCLC)中的表达及其临床意义。方法 :利用免疫组化S P法对 6 0例NSCLC和 7例正常肺组织检测p6 3和p73基因的蛋白表达。结果 :在NSCLC中 ,p6 3和p73蛋白表达的阳性率分别为 80 0 % (4 8/ 6 0 )、73 3% (4 4/ 6 0 ) ;与正常肺组织相比 ,p6 3和p73蛋白阳性表达的差异均有显着意义 ,P <0 0 5。p6 3蛋白表达与肺癌组织学类型 (P =0 0 0 0 3)和淋巴结转移有关 ,P =0 0 2 8;而与分化程度和临床分期无关 ,P >0 0 5。p73蛋白表达与肺癌组织学类型、淋巴结转移、分化程度和临床分期均无关 ,P >0 0 5。在肺癌中 ,p6 3蛋白和p73蛋白表达之间呈显着正相关 ,P =0 0 0 0 1。结论 :p6 3和p73高水平的表达协同促进肺癌的形成 ,p6 3是肺鳞癌恶性进展的一个标志物。
参考文献：
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[9]. 骨膜蛋白在非小细胞肺癌中的作用及相关机制的研究[D]. 胡文霞. 河北医科大学. 2017
[10]. 人非小细胞肺癌组织p63和p73的表达及意义[J]. 陈洪雷, 陈福春, 王敏, 陶鸿潮, 张玉霞. 肿瘤防治杂志. 2003
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