陈效友[1]2000年在《TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临床应用》文中认为为探讨TaqMan聚合酶链反应(TaqMan-PCR)技术在肺结核诊断中的价值。本文对168例活动性肺结核、57例肺癌患者的痰和外周血及34例健康对照外周血，同时应用TaqMan-PCR、PCR检测，并与痰涂片法、BACTEC法及改良罗氏培养法结果进行比较。 研究结果发现：TaqMan-PCR检测的痰和外周血总阳性率分别为53.0％和61.3％，显著高于PCR、痰涂片法、BACTEC法及改良罗氏培养法(P<0.05)。TaqMan-PCR检测痰和外周血的特异性分别为96.5％和94.7％与PCR检测痰和外周血的特异性为93％相比，无显著性差异(P>0.05)。在105例痰涂片阴性／或痰培养阴性肺结核患者中TaqMan-PCR检测外周血的阳性率达45.7％。 TaqMan-PCR具有较高的敏感性和特异性，对肺结核尤其痰涂片阴性及(或)痰培养阴性肺结核的诊断是一项有用的指标。
陈效友, 马玙[2]2000年在《TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临床应用(摘要)》文中提出目的:应用TaqMan聚合酶链反应(TaqMan-PCR)技术检测活动性肺结核患者痰和血中的结核分支杆菌DNA,探讨其在活动性肺结核诊断中的价值。方法:对168例活动肺结核、57例肺癌患者的痰和外周血及34例健康对照外周血,进行相关的前处理,同时应用TaqMan-PCR、
陈效友, 王洪平, 金玉生, 高薇薇, 张树才[3]2000年在《TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临床应用》文中研究表明目的 探讨TaqMan聚合酶链反应 (TaqMan PCR)技术在肺结核诊断中的价值。方法对 16 8例活动性肺结核、5 7例肺癌患者的痰和外周血及 34例健康对照外周血 ,同时应用TaqMan PCR、PCR检测 ,并与痰涂片法、BACTEC法及改良罗氏培养法结果进行比较。结果 TaqMan PCR检测痰和外周血总的阳性率分别为 5 3 0 %和 6 1 3% ,显著高于PCR、痰涂片法、BACTEC法及改良罗氏培养法 (P <0 0 5 )。TaqMan PCR检测痰和外周血特异性分别为 96 5 %和 94 7% ,与PCR检测痰和外周血的特异性为 93%相比 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。在 10 5例痰涂片阴性及痰培养阴性肺结核患者中TaqMan PCR检测外周血的阳性率达 45 7%。结论 TaqMan PCR具有较高的敏感性和特异性 ,对肺结核尤其痰涂片阴性及痰培养阴性肺结核的诊断有价值。
张金福, 李传友, 陈效友, 张健源, 田苗[4]2003年在《Taq Man-PCR技术诊断结核病的临床应用研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨TaqMan -聚合酶链反应 (TaqMan -PCR)技术在结核病快速诊断中的临床价值。方法 对 15 5例活动性肺结核患者的痰和外周血、130例结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血以及 6 1例结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血应用TaqMan -PCR检测结核分支杆菌DNA ,痰、胸腔积液和脑脊液进行抗酸染色涂片检查 ,另外 ,痰标本还进行了BACTEC和改良罗氏培养 ;同期以5 2例肺癌患者的痰和外周血、5 0例恶性胸腔积液患者的胸腔积液以及 33例健康人的外周血作为对照进行TaqMan -PCR检测。 结果 15 5例活动性肺结核患者的痰和外周血、130例结核性胸膜炎患者的胸腔积液和外周血以及 6 1例结核性脑膜炎患者的脑脊液和外周血TaqMan -PCR的阳性率分别为 4 9.0 %和 5 1.6 %、4 5 .4 %和 38.5 %以及 5 0 .8%和 4 2 .6 % ,痰、胸腔积液和脑脊液TaqMan -PCR的阳性率显著高于抗酸染色涂片以及BACTEC和罗氏培养 (P <0 .0 5 )。TaqMan -PCR检测痰、胸腔积液和外周血的特异性分别为 96 .2 %、98%和 96 .5 %。结论 TaqMan -PCR具有较高的敏感性和特异性 ,对结核病的快速诊断具有一定的价值。
奚经巧, 唐小华[5]2009年在《Taqman聚合酶链反应检测支气管灌洗液中结核分枝杆菌DNA的临床应用》文中研究表明肺结核病是一种危害性十分严重的传染性疾病,全球约有1/3人口感染结核分枝杆菌,每年约有800万～1000万新发病例及300万人死于该病[1-3]。因此,尽早发现新发病例,明确诊断非常重要。由于结核分枝杆菌体外生长缓慢、培养
王祖恩, 汤红丽, 马钰婷, 李志锋[6]2012年在《结核病的分子生物学诊断进展》文中进行了进一步梳理结核病是由结核分枝杆菌感染所致的传染病,全身各器官均可受累,以肺结核最为常见。2002年,世界卫生组织报道全球有800万新增结核感染者,并且有200万人死于结核病[1],中国每年约有13万人死于结核病,是各种传染病和寄生虫病死亡总和的2倍[2]。至今,要想从根源上控制结核病
杨伟洪, 陈罡, 罗殿中[7]2006年在《PCR检测结核杆菌的优越性及局限性分析》文中研究说明PCR由于具有较高的敏感性和特异性而在临床上广泛应用,是目前临床上诊断结核病的主要手段之一,但是在敏感性高,方便快捷的同时,也有很多不足.本文就PCR方法检测结核杆菌的优缺点及改进方法进行分析综述.
谭景尹[8]2011年在《PCR—膜芯片~(?)技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究》文中认为20世纪80年代后期以来,伴随人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药菌株的出现以及流动人口的增加,全球结核病(tuberculosis,TB)疫情急剧恶化,严重威胁着人类健康。目前,全世界每年TB死亡人数高达300万。随着联合药物的使用,MTB的耐药菌株也在不断的出现和传播。据WHO 2008年1月的调查报告[1]显示,耐药结核病(drug-resistant tuberculosis,DR-TB )的发病率创历史最高纪录,中国结核病耐药的严重程度在全球范围内仅次于俄罗斯,DR-TB已成为我国严重的公共卫生和社会问题。结核病实验室诊断和耐药性检测技术研究一直是国内外共同关注的焦点[2]。MTB培养加药敏试验仍是目前临床广泛采用鉴定MTB及其耐药性的“金标准”,但它对结核杆菌尤其是耐药菌株的检出率很低,所需时间较长,无法满足临床辅助诊断与指导用药的需要[3,4]。反向点膜杂交(reverse dot blot hybridization ,RDB)法应用DNA探针、核酸杂交、酶联显色3方面技术,同时检测MTB多个药物的耐药性[5],是目前国内外研究的热点。本课题组在前期研究中,以临床分离株为对象利用RDB法初步构建了检测耐药结核杆菌的膜芯片及反应体系。本研究以石蜡包埋组织标本为对象,从DNA的提取方法、多重PCR的反应体系及膜芯片的杂交条件三方面对整个检测体系进行优化,并将优化后的PCR-膜芯片体系直接用于检测石蜡包埋组织及痰液等临床标本的非培养结核杆菌及其耐药情况,结合药敏试验及测序结果对PCR-膜芯片检测结果进行比较分析。目的:优化结核分枝杆菌耐药基因膜芯片检测体系,探讨PCR-膜芯片技术直接应用于临床标本中结核杆菌耐药性检测的方法。方法:1、以石蜡包埋组织标本为对象,首先对提取DNA的方法进行优化。分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取石蜡包埋组织中结核杆菌的DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、PCR及TB膜芯片分析所提取DNA的质量;2、根据课题组前期建立的结核杆菌多重PCR体系扩增石蜡包埋组织中结核杆菌的耐药基因,通过调整引物组合、模板DNA的加入量及PCR反应的循环次数进行优化;3、根据课题组前期建立的结核杆菌耐药膜芯片体系检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变,通过调整膜芯片杂交时间及显色时间进行优化;4、综合各项优化条件,构建优化后PCR-膜芯片检测体系。5、采集100例石蜡包埋的肺或淋巴结组织标本(结核病人80例,非结核病人20例),采集82例痰标本(结核病人64例,非结核病人18例);6、利用TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中的结核杆菌IS6110基因,结果与抗酸染色镜检及痰涂片结果进行比较分析;7、利用优化的PCR-膜芯片检测体系,直接检测TB膜芯片阳性的石蜡包埋组织及痰标本中的结核杆菌及其耐药基因突变,结果与药敏试验及DNA测序结果进行分析比较。结果:1、氯化钠盐析法提取的DNA (19.338±6.270μg)和一步法提取的DNA(20.050±5.591μg)最多(P<0.001),PCR与TB膜芯片验证显示氯化钠盐析法与酚-氯仿法提取到质量较高的结核杆菌DNA;2、扩增石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因的多重PCR的最适条件为:引物组合调整为RKE、IAG、PRP、RRI,模板DNA的加入量为5μl, PCR反应的循环次数为38;3、检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变膜芯片杂交的最适条件为:杂交时间为6h及以上,显色时间为15min;4、TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中的结核杆菌IS6110基因,特异度分别为100%(20/20)和100%(18/18),灵敏度分别为52.5%(42/80)和81.3%(52/64)。5、优化后PCR-膜芯片直接检测石蜡包埋组织结核杆菌耐药基因突变,在42例TB膜芯片确认结核杆菌阳性的标本中,检出5例存在耐药基因的突变,其突变位点与测序结果基本符合。6、优化后PCR-膜芯片直接检测痰样结核杆菌耐药基因突变,在52例确认结核杆菌阳性的痰样中,检出5例存在耐药基因突变,其中4例临床药敏试验显示为耐药,该4例标本的PCR-膜芯片检测结果与药敏及测序结果基本符合;在痰培养阴性的样本中,PCR-膜芯片检测1例出现耐药基因突变,突变位点与测序结果一致,提示异烟肼耐药的可能。结论:1、氯化钠盐析法具有高效简便的特点,是较为理想的石蜡包埋组织结核杆菌DNA的提取方法。2、TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中结核杆菌,检出率明显高于抗酸染色镜检法和痰涂片法。3、优化后PCR-膜芯片体系可直接检测石蜡包埋组织及痰样等临床标本结核杆菌耐药基因突变;48小时内提供耐药信息,为临床耐药结核病的快速诊断提供有意义的辅助参考。
徐亚军[9]2007年在《分子信标荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌技术及产品的开发》文中认为目的建立分子信标荧光定量PCR快速检测结核杆菌方法，为临床结核病的诊断提供特异性强、灵敏度高、可标准化、自动化的检测方法；评价分子信标荧光定量PCR法在检测临床标本中的应用价值；评估分子信标荧光定量PCR法用于监控抗结核治疗的可行性；应用所建立方法开发检测试剂盒。方法1．分子信标与引物的设计与合成查阅文献，选择适合结核分枝杆菌复合群检测的靶基因。在GenBank数据库中查询靶基因序列，找出高度保守的区段。遵循分子信标与引物设计的规则，设计探针与引物并提交公司合成。对新合成的探针与引物进行筛选与反应性确认。选择结核分枝杆菌基因组DNA的最佳提取方法。2．分子信标检测结核分枝杆菌方法的建立与评价1)分别优化荧光定量PCR反应的退火温度、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶用量、PCR Buffer浓度、循环参数等条件，建立荧光定量PCR方法。2)方法评价：特异性：用已建立方法分别检测10株标准菌株与150株临床分离结核分枝杆菌。灵敏度：以结核分枝杆菌H37Ra为试验菌株，对模板DNA 10倍梯度稀释，分析方法的最低检出拷贝数。抗干扰性：接种2支菌量相当(约10~5cfu)的结核分枝杆菌，其中一支加入菌量远大于结核分枝杆菌的其他杂菌，提取模板DNA分别用已建立方法检测。重复性：用已建立方法重复3次测定同一浓度的模板DNA。3．分子信标检测结核分枝杆菌方法的应用与产品开发评估采集临床疑似结核病人痰标本，分别采用抗酸染色、集菌培养和荧光定量PCR方法进行检测，分析三种方法有无显著差异性，比较三种方法的检出率。对已建立方法进行成本分析，评估开发检测试剂盒的前景。结果1．根据结核分枝杆菌插入序列IS6110基因设计了2对探针与引物，选择特异性最强的一对引物与探针建立荧光定量PCR方法。引物与探针序列如下：引物：5’-GTCGCCCGTCTACTTGGTG-3’5’-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3’探针：5’FAM-CCGACGGTGCGTAAGTGGGTGCGTCGG-DABCYL-3’2．热裂解法提取结核分枝杆菌基因组DNA的前处理方法简便、快速、提取效率高。3．最佳PCR反应体系和循环参数(40循环)如下：预变性：94℃3min；变性：94℃20s；退火：52℃20s；延伸：72℃20s。4．分子信标荧光定量PCR方法仅对结核分枝杆菌复合群有扩增，检测灵敏度为10~3 Copies／ml，加入其他分枝杆菌等杂菌对检测没有影响，多次重复试验结果一致。5．分子信标荧光定量PCR方法检测272份临床疑似结核病人痰液标本，阳性182份，检出率为66.91％，远高于抗酸染色(10.75％)和集菌培养法(43.01％)。结论首次建立以分子信标为基础的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，方法的特异性强、灵敏度高、抗干扰能力强，能实现结核分枝杆菌的快速检测，可作为结核病常规诊断方法的补充，有利于结核病的早诊断、早治疗，提高结核病的检出率。
匡红[10]2007年在《结核分支杆菌高特异性分子信标设计及荧光芯片运用的初步研究》文中进行了进一步梳理目前对结核分支杆菌(Bacillus Tuberculosis,TB)的检测,主要靠痰涂片、培养及PCR检测等技术,存在耗时长,敏感度低和特异性差等缺点,常常导致误诊和漏诊,从而给病人带来巨大的经济负担。因此建立快速、敏感、简便的结核分支杆菌鉴定检测系统是目前国内外实验诊断学急需解决的问题,也是有效治疗和控制该类致病菌的有效手段之一。本研究通过自行设计结核分支杆菌高特异性的分子信标,并以其为探针固定在芯片表面,从而将分子信标探针的高灵敏性、高特异性优势运用于生物芯片领域,建立了一种快速鉴定结核分支杆菌的分子信标探针荧光芯片技术,为结核分支杆菌流行病学调查提供了新的技术手段。目的:设计结核分支杆菌高特异性的分子信标并构建分子信标探针型荧光芯片,建立快速鉴定结核分支杆菌的检测技术。方法:1.根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,选择序列号为IS986的基因序列,在Primer Premier V5.0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对TB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。2.从TB PCR反应体系的扩增片段内部取一段序列设计,经用beacon designer 2.1软件分析设计分子信标。对反应体系中的分子信标探针、MgCl2、引物以及dNTP的浓度进行优化后建立TB分子信标直接加入PCR扩增体系的杂交试验。3.通过对杂交温度、杂交时间以及杂交方式的优化,建立PCR反应后再加入TB分子信标杂交试验。4.运用荧光分光光度计和荧光显微镜对MB PCR杂交产物荧光信号的观测条件进行摸索。并进行不同荧光-淬灭分子对标记分子信标的观测试验。5.通过对传统生物素(biotin)-亲和素(avidin)连接方式和自行设计的单侧延长臂的分子信标连接方式的对比研究,对TB分子信标与芯片固定方式进行探索。6.提高单侧延长臂的分子信标芯片杂交效率部分优化包括:5/寡核苷酸探针浓度;分子信标探针浓度及纯度;杂交温度、杂交时间、杂交液配方;点样大小与点样浓度对荧光信号检测的影响;阴-阳性区分的临界值。7.TB-MB芯片的临床应用和方法学比较。主要结果:1.TB PCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。MgCl2、引物以及dNTP在TB PCR体系中优化后最佳终浓度分别为:4mmol/L、0.04μmol/L以及0.3 mmol/L。TB PCR体系的退火温度优化后为55℃。TB标准株及TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TB PCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝/μl的DNA。2.TB分子信标直接加入PCR扩增体系的TB分子信标、MgCl2、引物以及dNTP最佳终浓度分别为:0.04μmol/L、5.0mmol/L、0.04μmol/L、0.3mmol/L。3.PCR反应后再加入TB分子信标杂交试验中水浴、PCR仪、恒温摇床的最适杂交温度和适杂时间分别为:55℃,6h;55℃,4h;50℃,7h。阴-阳性效果区分:水浴﹥恒温摇床﹥PCR仪。4.荧光分光光度仪检测MB PCR杂交阳性产物、MB PCR杂交阴性产物(茎环结构未打开)、无游离分子信标探针PCR产物(空白对照)三者的荧光光亮度比值为:6.102/0.136/0.003。荧光显微镜观测MB PCR杂交阳性产物、MB PCR杂交阴性产物(茎环结构未打开)荧光强度明显区别。本试验Cy3-BDH组成分子信标荧光-淬灭效率较Cy3-DABCLYE高,FAM- DABCLYE组成分子信标荧光-淬灭效率较FAM–BDH高。5.生物素-亲和素(biotin-avidin)能很好的结合在芯片上但这种修饰有相当技术难度;且生物素-亲和素连接无特异性。本设计单侧延长臂分子信标采用淬灭分子中间标记,茎结构单侧(淬灭分子一侧)延长臂,能很好的结合在芯片上,且修饰技术难度低、特异性高。6.单侧延长臂分子信标芯片杂交效率的优化结果:5/寡核苷酸探针最适浓度为40μmol/L。对较理想区分阴阳性的信号强度:Cy3-BDH荧光-淬灭分子对标记分子信标探针浓度约10μmol/L,而FAM-DABCLYE分子对标记分子信标探针浓度约15μmol/L,经65℃杂交17h有较好的杂交效果。Cy3-BDH分子信标探针浓度约15μmol/L、FAM-DABCLYE探针浓度约9μmol/L时杂交反应达到7h可检测到较强信号。杂交液的杂交结果比较:0.15 %SDS效果好于0.2 %SDS , 10×SSC效果好于5×SSC。样本随着点样直径的缩小,荧光强度不变;样本随着点样浓度的倍比减小,荧光强度也减小。7.TB-MB芯片提痰标本总检出率为57.5%( 23/40) ,高于痰涂片27.5%(11/40)和培养35%(14/40),经统计学处理TB-MB芯片与痰涂片、培养相比差异有显著性(分别为χ2=7.366,P=0.006<0.01;χ2=32.281 , P=0.000<0.01)。对照组20例, 1例非结核分支杆菌病痰涂片、培养均阳性, TB-MB芯片阴性;其余19例均为阴性。结论:1.TB-MB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别;相对普通PCR检测具有更高的特异性和灵敏性,为结核分支杆菌高特异性分子信标荧光芯片的检测方法的建立奠定了基础。2.单侧延长臂分子信标探针设计的发明及运用,初步解决了分子信标技术在芯片技术领域运用的固定难题。巧妙地把分子信标高特异性、高灵敏性等优势自然运用到芯片技术上。3.建立起结核分支杆菌分子信标荧光芯片的检测技术,包括样本制备、芯片制备、杂交反应以及扫描和图像分析等方法。并兼顾到各种因素对单侧延长臂分子信标芯片的影响,对反应体系中各条件进行了合理的优化,使所建立的检测体系稳定可靠。4.通过与涂片、培养法共同对40例临床痰标本进行结核分支杆菌检测,证实了分子信标荧光芯片具有较高的阳性检出率和高度的灵敏性、特异性。单侧延长臂分子信标芯片能更好的运用到临床检测中。
参考文献：
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[10]. 结核分支杆菌高特异性分子信标设计及荧光芯片运用的初步研究[D]. 匡红. 第三军医大学. 2007
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