罗燕[1]2005年在《伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株的研究》文中认为本研究从四川某猪场流产死胎及木乃伊胎中分离了一株猪细小病毒,命名为PPV-SC1株。该株病毒能在猪肾原代细胞、PK-15细胞、ST细胞和IBRS-2细胞上增殖并引起细胞病变,细胞出现聚集、融合现象:分离毒能凝集2%的豚鼠红细胞,血凝效价可达2~(110),血凝抑制效价可达2~(-9);荧光抗体染色在细胞核和细胞质中均可见特异性荧光,呈苹果绿色;电镜正染观察病毒为无囊膜、球形、大小约23nm的病毒粒子。 根据Ana I.Ranz等报道的PPV NADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0 kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建了重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC1 VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异:密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC1 VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC1 NS1基因在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV—SC1 VP2蛋白在77-82、291-304、362-373、400-411、465-477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显着意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60-68、81-88、266-275、351-357、398-404等位点处。 以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuI位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据PPV-SC1株VP2基因的序列及其pPI-2.EGFP多克隆位点的酶切位点,重新设计一对引物,以质粒pPVP2 DNA为模板扩增得到用于表达的PPV VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,pPI-2.EGFP.VP2 DNA真核转染后24h的荧光观察和转染液的ELISA检测结果表明同时表达PPV VP2基因和EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2构建成功,为进一步构建PRY重组PPV VP2基因活载体病毒奠定了基础。 采用磷酸钙转染系统,将PRV基因缺失疫苗SA215株DNA与PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2.EGFP.VP2 DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blots核酸
付朋飞, 乔涵, 杨兴武, 张宇, 王林青[2]2016年在《重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化》文中进行了进一步梳理参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。
吴凤笋[3]2006年在《猪细小病毒重组伪狂犬病毒的研究》文中提出猪细小病毒(PPV)与伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的两个主要病原。PPV和PRV引起的疾病在我国有很高的感染率和发病率，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。传统的常规疫苗对防制PPV和PRV的感染有一定的效果，但是存在不可避免的缺陷，为了更好的控制PPV和PRV感染，研制更加安全有效的PPV-PRV二价基因工程疫苗是解决这一问题的最好途径。 伪狂犬病病毒基因组为一双链、线状DNA，在长约150kb的基因组上存在许多与病毒复制无关的非必需基因，这些基因可供外源基因的插入，而使之成为活载体疫苗。以含PPVNADL-2株全部序列的GH质粒为模板，扩增了完整的PPV VP2基因和部分VP1基因，并将其连接到PGEM-T Easy载体中，构建了重组质粒pVP2。为了构建猪细小病毒和伪狂犬病毒重组病毒，我们根据AnaI．Ranz等报道的PPV NADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物，以复制型DNA为模板，通过PCR扩增出长约2.114bp的DNA片段，与经Stu Ⅰ和Sph Ⅰ双酶切处理的pPR128质粒DNA连接，转化大肠杆菌DH5α，构建了转移重组质粒pPR-VP2。经酶切鉴定证明插入片断是VP2片断，并证明插入方向正确。 利用脂质体介导的方法，将pPR-VP_2和PRV基因组共转染于亚单层PK-15细胞，用低熔点琼脂糖和中性红筛选重组病毒，经数次蚀斑纯化后，得到重组病毒PRV-VP2。为进一步制备抗猪细小病毒的重组伪狂犬病毒活载体疫苗奠定了基础。
王岩[4]2002年在《表达猪细小病毒VP_2基因的伪狂犬病毒转移载体构建》文中研究指明以含PPV NADL-2株全部序列的GH质粒为模板，扩增了完整的PPV VP_2基因和部分VP_1基因并将其连接到POEM-T-EASY载体中，构建了重组质粒。经酶切鉴定证明插入片段是PPV的VP_2片段，并将重组质粒命名为PPW。以伪狂犬病毒的gG基因上的BamHI、NotI为插入位点。把已构建的PPW质粒(含PPV VP_2基因)和PUSK质粒(含完整的PRV gG基因)用BamHI和NotI双酶切，回收、连接、转化、提取后，经酶切鉴定证明插入片段是PPV的VP_2片段，并证明其插入方向正确，成功地构建了转移载体PUSP。为下一步构建表达PPV VP_2基因的伪狂犬重组病毒载体奠定了基础。
吴凤笋, 李文刚, 樊淑华, 王岩, 唐桂芬[5]2006年在《表达猪细小病毒VP_2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建》文中研究指明根据已发表的细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)NADL-2株全基因序列,设计1对引物,用PCR方法扩增出PPVVP2基因,将其克隆入pGEM-T载体中,获得了VP2基因的转移载体质粒,命名为pVP2。对含伪狂犬病病毒Min-A株gD、gI、gE、11K全基因,gG、28K基因部分编码区的质粒pPR128进行改造,用StuⅠ和SphⅠ双酶切,切去部分gI,gE基因。把两端带有StuⅠ和SphⅠ酶切位点的细小病毒VP2基因插入,构建了含VP2基因的转移载体pPR-VP2。
吴凤笋, 李文刚, 樊淑华, 项朝荣, 韩勇[6]2006年在《表达猪细小病毒VP_2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建》文中认为根据已发表的细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)NADL．2株全基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出PPV VP2基因,．将其连接到pGEM-T载体中,此重组质粒命名为pVP2．对含伪狂犬病病毒 (pscudorabics virus,PRV)Min-A株gD、gI、gE、11K全基因,gG、28K基因部分编码区的质粒pPR128进行改造,用StuI和SphI双酶切,切去部分gI、gE基因。然后把两端带有StuI和SphI酶切位点的细小病毒 VP2基因插入,构建了含VP2基因的转移栽体pPR-VP2．上述结果为进一步研制猪伪狂犬病-细小病毒病的二价基因工程疫苗奠定了基础。
刘晓[7]2011年在《水貂阿留申病毒VP2基因在伪狂犬病毒中表达》文中研究指明水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)是自主复制型细小病毒,主要侵害水貂的免疫细胞,导致机体免疫系统紊乱并逐渐衰竭,由ADV持续感染而引起水貂免疫系统性疾病称之为阿留申病(Aleutian disease, AD)。该病是目前危害世界养貂业的叁大病毒性传染病之一。由于该病的特殊致病机理,对该病的免疫预防缺少有效的方法,研制开发针对AD的疫苗,一直是动物医学界很棘手的问题。VP2是ADV的重要结构蛋白,其在病毒衣壳粒中占有较大的比重,现研究己证明VP2蛋白有良好的抗原性,是抗原决定簇载体,是制备基因工程疫苗重要的候选保护性抗原。伪狂犬病毒(PRV)是近些年才被应用的一种表达载体,PRV具有宿主范围广、不感染人,若缺失主要毒力基因对动物也不致病,安全性较高,其分子背景也比较清楚，.可供外源基因插入或替代的非必需基因位点多,可插入的外源基因容量大,而且重组病毒的遗传特性稳定,因此PRV很适合于改造成病毒表达载体,已被国内外公认为可直接用于构建活载体疫苗。因此,以伪狂犬病毒作为载体表达其它病原的主要保护性抗原蛋白,构建重组伪狂犬病毒成为基因工程疫苗研究的热点之一。本研究利用PCR技术从水貂阿留申病毒中扩增出免疫原性良好的VP2基因,将其与克隆载体pMD18-T连接后,转化到E.coli JM109感受态中,经蓝白斑筛选,挑取阳性菌落,提取质粒,进行电泳,并进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列测序鉴定,阳性质粒命名为pMD-VP2-1。然后根据所测得的基因序列,在原有引物的基础上加上SalI和BamHI两个酶切位点,重新克隆了VP2基因,所得的阳性重组质粒命名为pMD-VP2-2,然后对该质粒和转移载体pIESlacz分别用SalI和BamHI两个限制性内切酶进行酶切,经T4 DNA连接酶连接后获得携带水貂阿留申病毒VP2基因的转移载体质粒,命名为pIESZVP2,用脂质体介导将PRV和该载体一起转染vero细胞,构建含VP2基因的重组伪狂犬病毒,并利用LacZ筛选标记进行多次蓝色噬斑筛选和重组病毒纯化,再用PCR法和间接免疫荧光法鉴定重组病毒,结果表明成功构建重组病毒,且其表达的蛋白具有反应原性。用得到的重组伪狂犬病毒接种vero细胞,对基因表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,在约80KDa处有目的条带出现,符合VP2基因序列表达蛋白大小。综上,本研究为制备用来防治水貂阿留申病和伪狂犬病的二价基因工程活载体疫苗打下了良好的基础。
陈弟诗[8]2011年在《猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究》文中指出猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)的叁大主要病毒性病原,临床上常与免疫抑制性病毒：猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等和一些细菌性疾病等混合或继发感染,除引起严重的繁殖障碍外,更导致猪病临床症状复杂多变性,增加治疗和防控的难度,造成巨大经济损失。为节约人力简化免疫程序、降低免疫干扰、减小动物应激、鉴别疫苗与野毒,研发一种高效、稳定、安全、方便的新型疫苗来同时预防和控制好当前叁种病毒病,是最大幅度降低猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)及相关疫病行之有效的途径。PRV活载体和PPV VP2病毒样颗粒的联合应用,为发展新型动物疫苗提供了思路。本研究开展了对四川省猪场猪只PRV和JEV的血清学调查,以掌握其流行现状；研究了密码子优化的JEV多抗原表位串联基因e与PPV VP2嵌合DNA疫苗；并以猪伪狂犬病毒疫苗株SA215为载体,构建了JEV-PPV-PRV活载体疫苗。主要研究内容如下：1、四川省部分猪场伪狂犬和乙型脑炎的血清流行病学调查采用PRV gE ELISA检测试剂盒对2009年-2010年以四川省18个地区的27个具有代表性大中小型猪场不同批次送检的血清1177份进行了伪狂犬野毒的检测,并对数据进行了统计分析。结果显示,各猪场平均gE抗体阳性率为8.2%,阴性猪场占59.3%,川东北区阳性率最高为18.8%,公猪野毒感染率最高达7.4%,基础母猪规模为100头以下的小型猪场猪只伪狂犬野毒阳性率最高为52.7%。对四川省10个地区的14个猪场进行PRVgB抗体ELISA检测,结果显示,各猪场gB抗体阳性率从最低的66.7%到最高100%,14个猪场平均抗体阳性率达87%,表明四川省PRV的免疫情况参差不齐,差异较大。采用JEV抗体ELISA检测试剂盒对四川14个地区21个规模化猪场从2009年2月至2010年10月的1100份样品进行了检测,并对数据进行了统计分析,结果显示,JEV抗体总阳性率为75.1%,川西区抗体阳性率最高为83.6%,4月份抗体阳性率逐渐升高,到5月份阳性率达到第二高水平92.1%。将826份JEV ELISA检测为阳性的样品按照猪群类别分类随机抽样20%,采用JEV RT-PCR进行检测,结果显示,后备猪阳性率为6.5%最高,表明四川省猪群存在JEV感染。2、乙脑E基因多抗原表位基因的设计和原核表达通过生物信息学方法对JEVE蛋白抗原表位进行了预测,结合文献报道筛选出5个B细胞表位和1个T细胞表位,为了增强细胞免疫应答引入通用辅助T细胞表位(PADRE),选取合适的接头Linker序列将各表位进行不同顺序线性串联组合,初步优化获得基于多抗原表位疫苗分子的氨基酸序列,并用生物软件对串联的乙脑多表位肽进行了分析评价。以原核表达质粒pET-32a为载体,构建了含JEV多抗原表位串联基因的原核表达质粒pET-e,经IPTG诱导成功表达,Western blot结果表明,JEV阳性血清能特异性识别JEV多抗原表位串联基因e的表达产物,表明JEV多抗原表达蛋白e具有免疫原性,为后续研究奠定了基础,以便应用于基因疫苗研制。3、猪细小病毒VP2蛋白N端甘氨酸富集区的缺失对病毒样颗粒的形成及免疫原性的影响PPV VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点,常规PCR扩增容易导致该区段的缺失,为研究该缺失对PPV VLPs的影响,探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点,笔者构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2,并以完整VP2作为对照,采用脂质体介导法转染Vero细胞,通过生物信息学技术,SDS-PAGE和Western-boltting,间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察；进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠,采用间接ELISA试验,淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术,分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答。结果显示,缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs,并具有与完整病毒粒子类似血凝性,pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。结果表明,甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性,△VP2同样可进行PPV VPLs疫苗和抗原转运载体的研制,为VPLs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向,为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据4、密码子优化的JEV多抗原表位e与PPV VP2嵌合真核表达载体pCI-Ve的构建按照哺乳动物密码子偏爱性对JEV多抗原表位串联基因e进行了密码子优化,人工合成密码子优化的e基因,将密码子优化的e基因连接到PPV VP2的N端,以真核表达载体pCI-neo为基础,分别构建了含密码子优化的JEV多抗原表位e的pCI-e和密码子优化的JEV多抗原表位与PPV VP2嵌合基因Ve的真核表达质粒pCI-Ve。构建的重组质粒pCI-e和pCI-Ve由脂质体介导转染Vero细胞,经过SDS-PAGE和Western-blotting,以及间接免疫荧光检测,结果表明e和Ve成功表达,具有免疫原性,电镜观察重组质粒pCI-Ve的细胞表达产物,表明产物可能形成病毒样颗粒。5、JEV-PPV新型核酸疫苗的免疫效果研究将真核表达质粒pCI-Ve、pCI-e和pCI-VP2以肌肉注射方式,100μg/只剂量免疫健康昆明鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,检测其体液免疫和细胞免疫情况,同时检测了中和抗体产生情况,还通过攻毒实验对pCI-Ve的免疫保护作用进行了评价。结果表明,pCI-Ve够诱导小鼠产生良好的体液和细胞免疫应答,对致死剂量的JEV强毒攻击能提供75%的保护率,表明pCI-Ve具有作为预防猪乙脑和细小病毒病的新型DNA疫苗的潜力。6、JEV-PPV-PRV活载体疫苗的研究将密码子优化的JEV多抗原表位基因e和PPV VP2嵌合基因Ve连接到本实验室的通用PRV SA215转移载体中,构建了转移载体pPI-Ve,通过与亲本株PRV SA215同源重组,构建了重组PRV SA215(G)。经Western-blot、PCR、绿色荧光和细胞病变的观察鉴定,结果表明PRV SA215 (G)构建成功。通过在Vero细胞上的致病变效应和电镜观察表明插入外源基因Ve几乎不影响亲本株SA215的生物学特性,电镜观察到PRV SA215 (G)在Vero细胞培养物中形成比VP2病毒样颗粒稍大的类似颗粒,推测表达了Ve嵌合病毒样颗粒。猪只免疫试验结果表明,PRV SA215 (G)以106.0TCID50/只,1次性肌肉注射免疫仔猪,能诱导较好的JEV、PPV和PRV体液免疫应答,能诱导良好的Thl型和Th2型细胞免疫应答,主要为Thl型,能产生亲本株类似的中和抗体效价。表明PRV SA215(G)可作为预防JEV、PPV和PRV的活载体疫苗的优良候选株。
吕建强, 陈焕春, 赵俊龙, 方六荣, 何启盖[9]2004年在《表达猪细小病毒VP_2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究》文中研究表明根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHⅠ位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK VP2。采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+株的基因组DNA与pUSK VP2共转染PK 15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPVVP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP+2株,Southernblotting、SDS PAGE、Westernblotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验。结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中,并获得了表达。表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒。同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。
罗燕, 郭万柱, 徐志文, 刘艳丽, 殷华平[10]2005年在《含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建》文中研究说明分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切含PRVFa株gI片段的质粒pPI,补平连接后得到去除EcoRⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点的大小约5.7kb的质粒pPI-2,再以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据AnaI.Ranz等报道的猪细小病毒(PPV)NADL-2株的序列,设计一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,扩增得到VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,首次构建了含PPVVP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,为进一步构建PRV重组PPVVP2基因活载体疫苗奠定了基础,同时EGFP的引入也为进一步研究PRV在机体内的定植和感染机理打下了基础。
参考文献：
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[2]. 重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化[J]. 付朋飞, 乔涵, 杨兴武, 张宇, 王林青. 中国兽医学报. 2016
[3]. 猪细小病毒重组伪狂犬病毒的研究[D]. 吴凤笋. 河南农业大学. 2006
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[5]. 表达猪细小病毒VP_2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建[J]. 吴凤笋, 李文刚, 樊淑华, 王岩, 唐桂芬. 河南农业科学. 2006
[6]. 表达猪细小病毒VP_2基因重组伪狂犬病毒转移载体的构建[C]. 吴凤笋, 李文刚, 樊淑华, 项朝荣, 韩勇. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集. 2006
[7]. 水貂阿留申病毒VP2基因在伪狂犬病毒中表达[D]. 刘晓. 吉林农业大学. 2011
[8]. 猪乙型脑炎病毒—细小病毒—伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]. 陈弟诗. 四川农业大学. 2011
[9]. 表达猪细小病毒VP_2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究[J]. 吕建强, 陈焕春, 赵俊龙, 方六荣, 何启盖. 病毒学报. 2004
[10]. 含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建[J]. 罗燕, 郭万柱, 徐志文, 刘艳丽, 殷华平. 四川农业大学学报. 2005