（泸州医学院附属医院中药房 四川 泸州 646000）
【摘要】 目的：优选鹿茸水溶性蛋白的最佳提取工艺。方法：以马鹿茸为原料，采用组织匀浆结合浸提的方法提取可溶性蛋白，以鹿茸可溶性蛋白得率和含量为评价指标，通过单因素实验研究匀浆方法、匀浆次数、提取溶液浓度和pH对鹿茸可溶性蛋白得率的影响，优化提取工艺。结果：鹿茸可溶性蛋白的最佳提取工艺为，以pH为7，50mmol•L-1的Tris-HCl缓冲溶液为提取溶剂，采用电动匀浆机，匀浆次数为3次。结论：优化得到的提取工艺稳定、可行，可为进一步研究鹿茸蛋白的药理药效提供参考。
【关键词】 鹿茸；水溶性蛋白；提取工艺
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）02-0367-02
Optimization of Extraction Technology of Soluble Proteins from Velvet Antler of Cervus elaphus Linnaeus Zhou Jie.
Pharmacy of Chinese medicine Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan China
【Abstract】Objective To optimize the appropriate extracting technology for soluble proteins from velvet antler. Methods Extracted the soluble proteins with homogenate method, studied the effect of homogenate method, homogenate times, concentration and pH of extraction solvent, using soluble proteins extraction rates and content as the indices. Results: The optimal extraction technology for the soluble proteins was as follows: electric homogenate, the extraction solvent of 50 mmol•L-1, pH of 7.The extraction rate of he soluble proteins from velvet antler was and the content of the soluble proteins was .Conclusion The optimal extraction technology is stable and feasible, and can provide reference for further study on velvet antler.
【Key words】Velvet antler; Soluble proteins; Extraction technology
鹿茸为鹿科动物梅花鹿 (Cervus nippon Tennminck )或马鹿 (Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等作用[1]。鹿茸中含多种活性物质，其中鹿茸蛋白占鹿茸总质量的52%以上[2]，现代研究表明，鹿茸蛋白能在多方面调节人体生理功能，对内分泌、免疫、血液系统等均有影响[3-4]。目前对于该成分的提取工艺研究方面，大多采取简单的静置和搅拌方式[5-7]，张梦莹等[8]采用碳酸盐缓冲溶液结合超声波技术提取，Tris-HCl缓冲溶液结合组织破碎的提取方法还未见报道。本研究将Tris-HCl缓冲溶液浸提和组织破碎的提取方法相结合，并优选出较优提取工艺参数，为进一步开发和利用鹿茸这一宝贵资源提供科学依据。
1.仪器与试药
1.1 仪器
TU-19系列紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；Neofuge23R高速冷冻离心机（Heal Force公司）；ULT1386-3-V30超低温冰箱（日本三洋电器公司）；pHS-3C型酸度计（上海伟业公司）；电动匀浆器（美的公司）；FSH-2A可调高速匀浆机（江苏金坛市医疗仪器厂）。
1.2 实验材料
内蒙古赤峰巴林左旗雄性马鹿鹿茸；采茸方式为全身麻醉消毒锯茸留血密封后冷藏运输，2小时内放置-80℃冷冻保存。
1.3 试药与试液
标准牛血清白蛋白（BSA）（北京拜耳迪公司）；考马斯亮蓝试剂（G-250）（北京拜耳迪公司），并参照文献方法配制成溶液[8]；三羟甲基氨基甲烷（Tris，Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1 蛋白质含量测定方法学的建立
2.1.1对照品溶液制备 精密称取牛血清白蛋白1.0mg，用蒸馏水溶解并定容至10mL，配成浓度为0.1mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，保存在4℃冰箱中，待用。
2.1.2样品的制备 称取鹿茸样品10g，解冻，切薄片，用4℃的蒸馏水冲洗；4℃下，用50mL的Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH值为7）提取24h；将鹿茸放入匀浆机中匀浆3次，每次10s，每次暂停3s；将渗出液合并残渣在4℃下浸提24h；离心20min（10000r/min，4℃），取上清，得到待测样品。
2.1.3标准曲线的制定 分别精密吸取对照品溶液0、100、200、400、600、800、1000μL，于10mL刻度试管中，加入5 mL考马斯蓝G-250显色剂，混匀，放置10min，冷却至室温，并同时制备空白溶液，于595nm处测其吸光度，以对照品溶液的含量为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=0.005X+0.046，相关系数r=0.9991，线性范围为10ug～100ug。
2.1.4精密度考察 精密吸取对照品溶液800 μL，按2.1.3项的方法测定，在595nm波长下，连续测定5次，其 RSD值为0.6%，表明仪器精密度符合方法学考察要求。
2.1.5重现性考察 分别称取相同质量的5份样品，按2.1.2项下制备样品，按2.1.3项下的方法测定，计算RSD值为2.8%，本方法重现性符合方法学考察要求。
2.1.6显色稳定性考察 称取1份样品，按2.1.2项下制备样品，按2.1.3项下的方法测定，在595nm波长处，分别于5、15、25、35、45、55 min时，测定吸收值，计算RSD值为1.4%，表明供试品在显色55 min内保持稳定。
2.1.7加样回收率实验 精密移取已制备的供试品溶液5份，每份0.5mL，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的蛋白质标准溶液，按2.1.3项下的方法测定，样品平均回收率为83.3%，RSD为2.1%。
2.2 匀浆方法对马鹿茸总蛋白提取率的影响
匀浆是破碎机体软组织最常用的方法之一，它的工作原理是通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速、风险小的组织破碎方法。本实验比较了FSH-2A可调高速匀浆机和电动匀浆器两者在鹿茸蛋白提取应用中的优劣，结果见表1。表明FSH-2A可调匀浆机处理鹿茸样品的蛋白提取率更高，但每次处理量少，需要时间更长。
2.3 匀浆次数对马鹿茸总蛋白提取率的影响
考察匀浆次数分别为1、2、3、4、5次对马鹿茸总蛋白提取率的影响，以匀浆次数为横坐标，以蛋白提取率为纵坐标，结果见图1。随着匀浆次数的增加，总蛋白提取率增高，匀浆次数超过3时，蛋白提取率增高的趋势放缓，为了减少蛋白质变性及提取时间，确定匀浆次数为3次。
3.讨论
本实验考察了FSH-2A可调高速匀浆机与电动匀浆机对鹿茸水溶性总蛋白提取率的影响，从实验结果看出FSH-2A可调高速匀浆机蛋白得率较高，但每次处理量少，适合实验室研究，在大工业大生产中，电动匀浆机更方便、处理样品更多、更节约时间。
本实验对匀浆次数、提取液离子强度和pH值进行了单因素考察，确定了马鹿茸水溶性蛋白的最佳提取条件为：电动匀浆机匀浆3次，Tris-HCl浓度为50 mmol•L-1，pH值为7。
由于鹿茸不同分叉、不同部位所含的蛋白成分和含量可能不同，为了减少由此带来的干扰，本实验都选取具有两个分枝的马鹿茸，从分枝顶端开始截取10cm进行切片、混匀，称取10g进行样品制备。
本实验对匀浆方法、匀浆次数、缓冲液浓度和pH值进行了单因素考察，但为了进一步优化工艺，还应采取单因素或正交试验法对浸提时间、料液比等条件进行全面的考察。
【参考文献】
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[8]张梦莹，赵玉娟，李倩竹，等.梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺及免疫活性[J].东北林业大学学报，2014，42（9）：158-163
论文作者:周杰
论文发表刊物:《医药前沿》2016年1月第2期
论文发表时间:2016/5/18
标签：匀浆论文; 鹿茸论文; 蛋白论文; 溶液论文; 方法论文; 样品论文; 可调论文; 《医药前沿》2016年1月第2期论文;