（1.空军军医大学（第四军医大学）学员旅 陕西西安 710032；
2.空军军医大学（第四军医大学）唐都医院呼吸与危重症医学科 陕西西安 710038；
3.空军军医大学（第四军医大学）病理教研室 陕西西安 710032）
摘要：目的 探讨丹参酮IIA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）对人肺腺癌细胞A549中HIF-1α及VEGF表达影响。方法 实验分为对照组、血清组、生长因子组，采用Western Blotting、QT-PCR及ELISA，观察HIF-1α、VEGF、AKT及MAPK表达的影响。结果 不同浓度TanⅡA抑制A549细胞中HIF-1α蛋白的表达，但是不影响HIF-1α mRNA水平；不同浓度TanⅡA抑制A549细胞中VEGF mRNA及蛋白水平的表达；不同浓度TanⅡA抑制A549细胞中AKT和MAPK 的激活，AKT抑制剂LY294002或MAPK抑制剂PD98059抑制A549细胞中HIF-1α蛋白的表达。结论 TanⅡA通过下调AKT和MAPK信号通路抑制A549细胞中HIF-1α及VEGF的表达。
关键词：TanⅡA；肺腺癌细胞A549；HIF-1α；VEGF
Tanshinone IIA Inhibits Hypoxia-Inducible Factor1α and VEGF Expression in Human lung adenocarcinoma Cells A549
Sun zijian1，Dang shaokang2*，Wang yanxia3*
1 The First Cadet Brigade，Air Force Medical University（4th Military Medical University），Shannxi，Xi’an，710032
2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Tangdu Hospital，Air Force Medical University（4th Military Medical University），Shannxi，Xi’an，710038
3.Department of Pathology，Air Force Medical University（4th Military Medical University），Shannxi，Xi’an，710032，China
* co-Corresponding author
Corresponding author：Wang Yanxia，E-mail：wyxcga@163.com
Dang shaokang，E-mail：994740545@qq.com
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌最为常见。虽然随着诊断和治疗技术的不断的发展，肺癌总体生存率仍然有待于提高。目前，肺癌的化疗治疗仍然不能令人满意，还需要更有效的治疗。替代药物为治疗许多恶性肿瘤提供了可能的治疗剂。肿瘤生长依赖于其特殊微环境，生长依赖于血管生成[1，2]。HIF-1α 是介导细胞对缺氧微环境进行适应转导调控因子，在多种癌组织中过表达，参与肿瘤生长、浸润和转移。HIF-1α通过结合缺氧反应元件转位到细胞核，反式激活下游基因血管内皮生长因子（VEGF）[3]。癌细胞产生的循环VEGF增加、扩散与淋巴结转移有相关性[4]，在肿瘤血管生成过程中起重要作用，并与预后不良直接相关[5]。因此，针对HIF-1α/VEGF系统的抗血管生成治疗将是治疗癌症的合理策略。TanⅡA为丹参根部乙醚或乙醇提出物，是丹参中最丰富的成分[6]，已知具有抗氧化和抗炎特性并治疗心血管疾病[7]。此外，最近的研究表明，TanⅡA具有诱导各种人类癌细胞的凋亡、抗增殖及抑制侵袭作用[8-13]。TanⅡA可以通过多种机制诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡 [14，15]。尽管有这些发现，TanⅡA发挥抗癌作用的分子机制在很大程度上仍然是未知的。
在这项研究中，我们证明了TanⅡA对人肺癌细胞中HIF-1α和VEGF的表达有明显的抑制作用，TanⅡA不影响HIF-1α mRNA水平，但是通过下调Akt和MAPK信号通路干扰HIF-1α蛋白质合成。此研究为TanⅡA抗癌作用的分子机制提供了关键线索。
材料和方法。
1.细胞 人肺腺癌细胞A549受赠于空军军医大学肿瘤重点实验室.
2.试剂
TanⅡA购自国家药物和生物制品控制研究所。重组人胰岛素（Ins）、胰岛素样生长因1（IGF-1）、HIF-1α、磷酸化和总AKT的抗体、磷酸化和总MAPK及β-肌动蛋白单克隆抗体均购于Sigma公司。AKT抑制剂LY294002、MAPK抑制剂PD98059、Western Blotting、QT –PCR及ELISA相关试剂盒购于北京中衫生物技术有限公司。
3.TanⅡA处理细胞
A549在完全培养基中以1，5，10，15，20，30，40和50μg/ml的浓度处理6h。在时间依赖性研究中，细胞用20μg/ml TanⅡA处理0~48h，在细胞接受生长因子刺激的实验中，细胞在无血清和无胰岛素的培养基中饥饿过夜，然后用TanⅡA预处理30min，然后与生长因子孵育6h。
4.Western Blotting
细胞用PBS洗涤、离心，RIPA裂解缓冲液制备全细胞提取物，用12% SDS-PAGE分离等量蛋白质（50μg），将蛋白质电泳转移到硝化纤维素膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h。随后，在4℃过夜加入鼠来源HIF-1α（1：1000m），β-肌动蛋白（1：4000）、AKT（1：2000）及MAPK（1：2000）单克隆抗体。重复洗涤后，加入兔抗鼠二抗（1：2000）孵育2小时。之后加入增强型发光液，置于成像系统中使用ImageJ软件检测分析。
5.Quantitative Real-Time PCR
按照试剂盒说明提取总RNA并进行实时PCR，HIF-1α的引物为（正向）5‘-CCCTGGATGCTTTGTTTATGG-3’和（反向）5‘-ACTGCGGCTGGTTACTGC-3，VEGF5’-CTGCCATCCAATCGAGACCC-3‘（正向）和5’-ATGGTGATGGGGTG-GTGGCG-3‘（反向），而肌动蛋白为（正向）5’-GGCGGCACC。ACCATGTACCCT-3‘和（反向）5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3‘。
6酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA试剂盒测定培养液中细胞分泌的VEGF蛋白水平。收集用不同浓度TanⅡA处理后细胞培养基和不同浓度TanⅡA与IGF-1孵育12h的培养基，根据ELISA说明书测定VEGF蛋白浓度。
7.统计分析
均以平均值±SE表示。采用单因素方差分析（Fisher‘s PLSD test）进行统计分析。如果P<0.05，统计学上的被认为是显著的差异。
结果
1.TanⅡA抑制人肺腺癌细胞A549HIF-1α表达
给予A549细胞不同浓度TanⅡA处理6h后，HIF-1α蛋白水平呈剂量依赖性降低，在15μg/ml TanⅡA处理的A549细胞中其蛋白水平显著降低（图1A）。在20μg/ml TanⅡA条件处理下，HIF-1α蛋白水平在6小时显著下降，24小时和48小时几乎检测不到HIF-1α蛋白的表达（图1B），表明TanⅡA以时间依赖的方式抑制了HIF-1α的表达。
2.TanⅡA抑制生长因子诱导的HIF-1α表达
我们接下来研究TanⅡA是否可以抑制血清或生长因子诱导的HIF-1α表达。
将A549细胞在无血清和无胰岛素培养基中培养18h，然后与不同剂量的TanⅡA一起暴露于血清中6h，我们发现血清明显诱导A549细胞中HIF-1α的表达，并且TanⅡA以剂量依赖的方式抑制血清诱导的HIF-1α表达（图2A）。用200 nm胰岛素或200 ng/ml IGF-1处理A549细胞，胰岛素或 IGF-1均显著增加A549细胞中HIF-1α的表达（图2B，2C），而TanⅡA预处理均以剂量依赖性方式有效地抑制HIF-1α诱导（图2B，2C）。这些结果表明，胰岛素或 IGF-1特异性生长因子能够上调A549细胞中HIF-1α的表达，而TanⅡA显著抑制生长因子诱导的A549细胞中HIF-1α表达。
3.TanⅡA抑制A549细胞VEGF表达
为了检测TanⅡA是否抑制A549细胞中VEGF的表达，用Real-time PCR检测VEGF mRNA水平。结果显示，A549细胞在正常培养条件下高水平表达VEGF mRNA（图3A），用TanⅡA以剂量依赖的方式抑制A549细胞VEGF mRNA的表达（图3A）；IGF-1处理显著增加VEGF mRNA表达，并且TanⅡA以剂量依赖的方式抑制IGF-1诱导的VEGF mRNA表达（图3B）；为了确定TanⅡA下调VEGF mRNA水平是否随后导致VEGF蛋白表达下降，我们通过ELISA测定了VEGF蛋白水平，用TanⅡA处理A549细胞以剂量依赖的方式抑制VEGF蛋白水平（图3C），TanⅡA以剂量依赖的方式抑制IGF-1诱导的A549细胞中VEGF蛋白表达（图3D）。
4.TanⅡA不影响HIF-1α mRNA水平
为确定TanⅡA对HIF-1α蛋白水平的抑制是否由mRNA水平下降引起的，实时定量PCR检测了HIF-1α mRNA水平。结果显示IGF-1在A549细胞中没有诱导HIF-1α mRNA表达。TanⅡA处理对A549细胞中HIF-1α mRNA水平没有任何影响（图4）。这些数据表明，TanⅡA抑制HIF-1α蛋白表达不是通过抑制其mRNA水平，TanⅡA可能通过作用于HIF-1α mRNA表达的转录后机制。
5.TanⅡA抑制AKT和MAPK激活
为了进一步探讨TanⅡA抑制HIF-1α蛋白表达的机制，我们研究了TanⅡA抑制A549细胞中HIF-1α蛋白表达的信号转导途径。一些研究表明，胰岛素和IGF-1通过AKT和MAPK信号通路在一些细胞中诱导HIF-1α蛋白表达。在这项研究中，我们发现血清和特定的生长因子（胰岛素和IGF-1）诱导A549细胞中高水平的HIF-1α蛋白表达（图2）。因此，我们研究了TanⅡA处理是否影响IGF-1诱导的AKT和MAPK信号通路的激活。Western blotting分析显示IGF-1明显增加了A549细胞中AKT和MAPK的磷酸化，但TanⅡA预处理可以显著阻断IGF-1诱导的AKT和MAPK的激活（图5A和5B）。同时，用AKT抑制剂LY294002或MAPK抑制剂PD98059处理细胞，可降低IGF-1诱导的HIF-1α蛋白水平（图5C）。这些数据表明，TanⅡA抑制Akt和MAPK的激活在其下调HIF-1α蛋白表达中起作用。
讨论
血管生成对于肿瘤的生长和侵袭非常重要，是由复杂的相互作用因子介导[16]。HIF1-α介导的VEGF表达在肿瘤血管生成和转移中起关键作用[17]。在这项研究中，我们首次证明了TanⅡA显著抑制HIF1-α和VEGF在人肺腺癌细胞A549中的表达。TanⅡA可能通过影响AKT和MAPK信号转导途径干扰HIF1-α的蛋白质翻译。提示TanⅡA可能通过影响HIF-1α和VEGF介导的肿瘤血管生成而抑制人肺腺癌的进展。此研究为TanⅡA的抗癌作用提供了一种新的机制。
血清或特定生长因子已被证明在常氧条件下上调HIF-1α在各种人类肿瘤中的表达，包括肺癌[18]。许多研究已经检测了IGFs在肿瘤中的表达，发现在肿瘤组织中的表达水平高于相邻组织中的表达水平，这提示了IGFs在人类恶性肿瘤的发展和进展中的作用[19]。在本研究中，在常氧条件下，TanⅡA在有或无生长因子如血清、胰岛素和IGF-1的情况下是以剂量和时间相关的方式降低A549细胞中的HIF-1α蛋白的表达。VEGF是HIF-1α的靶基因之一，在肿瘤血管生成中起重要作用[17]，并且在许多人类肿瘤中被诱导，HIF-1α在转录水平调节VEGF的表达[20]。先前的研究表明，IGF-1也显著上调HIF1-α靶基因在人腺癌细胞中的表达，并参与多种癌细胞的肿瘤血管生成[21]。我们发现TanⅡA以剂量相关的方式显着抑制VEGF的mRNA和蛋白水平。然后我们研究了TanⅡA抑制HIF-1α表达的机制。一些研究表明，包括IGF-1在内的生长因子不诱导HIF-1α mRNA的表达，但增加HIF-1α蛋白的合成[18]。同样，我们也没有观察到IGF-1在A549中诱导HIF-1α mRNA表达。TanⅡA处理对A549细胞中HIF-1α mRNA水平没有影响。表明TanⅡA可能通过转录后机制抑制HIF-1α蛋白的表达，例如通过影响HIF-1α蛋白的合成和/或降解。为了进一步研究TanⅡA抑制HIF-1α表达的分子机制，观察 TanⅡA是否影响HIF-1α蛋白合成。最近有报道，IGF-1通过AKT和MAPK信号转导途径诱导多种癌细胞[22]中HIF-1α和VEGF的表达。在这项研究中，我们发现IGF-1通过激活A549中的AKT和MAPK激酶来诱导HIF-1α的表达，而TanⅡA处理抑制了AKT和MAPK的激活。
总之，本研究表明TanⅡA抑制A549中HIF-1α和VEGF的表达。HIF-1α和VEGF触发的肿瘤血管生成是肿瘤进展的重要过程，因为它滋养肿瘤细胞生长并促进转移。因此，TanⅡA可能通过显著抑制HIF-1α和VEGF的表达而抑制肺癌的进展。此外，TanⅡA通过抑制AKT和MAPK信号转导途径的激活来抑制HIF-1α的合成，从而降低VEGF的表达，从而发挥抗癌作用，这些观察结果为TanⅡA应用于癌症治疗提供了一定的科学依据。
参考文献
[1]Wang X M-NS，Lee KH.New developments in the chemistry and biology of the bioactive constituents of Tanshen.Med Res Rev 2007；27（1）：133-148.
[2]Semenza GL.Hypoxia，clonal selection，and the role of HIF-1 in tumor progression.Critical reviews in biochemistry and molecular biology.2000；35（2）：71-103.
[3]Cao CJ，Su Y，Sun J，Wang GY，Jia XQ，Chen HS，et al.Anti-tumor Effect of Ginkgo biloba Exocarp Extracts on B16 Melanoma Bearing Mice Involving P I3K/Akt/HIF-1alpha/VEGF Signaling Pathways.Iranian journal of pharmaceutical research：IJPR.2019；18（2）：803-811.
[4]Jabari M，Allahbakhshian Farsani M，Salari S，Hamidpour M，Amiri V，Mohammadi MH.Hypoxia-Inducible Factor1-Alpha（HIF1alpha）and Vascular Endothelial Growth Factor-A（VEGF-A）Expression in De Novo AML Patients.Asian Pacific journal of cancer prevention：APJCP.2019；20（3）：705-710.
[5]Almendros I，Martinez-Garcia MA，Campos-Rodriguez F，Riveiro-Falkenbach E，Rodriguez-Peralto JL，Nagore E，et al.Intermittent Hypoxia Is Associated With High Hypoxia Inducible Factor-1alpha but Not High Vascular Endothelial Growth Factor Cell Expression in Tumors of Cutaneous Melanoma Patients.Frontiers in neurology.2018；9：272.
[6]Bi YF，Wang ZJ，Guan RF，Ye YT，Chen YY，Zhang YB，et al.Design，synthesis and vasodilative activity of tanshinone IIA derivatives.Bioorganic & medicinal chemistry letters.2012；22（15）：5141-5143.
[7]Guo ZL，Li Y，Liu XW，Wu MY，Guo Q，Yao XC，et al.Sodium Tanshinone IIA Silate Alleviates High Glucose Induced Barrier Impairment of Human Retinal Pigment Epithelium through the Reduction of NF-kappaB Activation via the AMPK/p300 Pathway.Current eye research.2019：1-7.
[8]Li K，Liu W，Zhao Q，Wu C，Fan C，Lai H，et al.Combination of tanshinone IIA and doxorubicin possesses synergism and attenuation effects on doxorubicin in the treatment of breast cancer.Phytotherapy research：PTR.2019；33（6）：1658-1669.
[9]Chiu CM，Huang SY，Chang SF，Liao KF，Chiu SC.Synergistic antitumor effects of tanshinone IIA and sorafenib or its derivative SC-1 in hepatocellular carcinoma cells.OncoTargets and therapy.2018；11：1777-1785.
[10]Guo Y，Li Y，Xiang B，Huang XO，Ma HB，Wang FF，et al.Nutlin-3 plus tanshinone IIA exhibits synergetic anti-leukemia effect with imatinib by reactivating p53 and inhibiting the AKT/mTOR pathway in Ph+ ALL.The Biochemical journal.2017；474（24）：4153-4170.
[11]Li N，Yang L，Zhang B，Chen S.Tanshinone IIA effects on ovarian cancer cell line.The Journal of pharmacy and pharmacology.2018；70（10）：1369-1377.
[12]Li Q，Hu K，Tang S，Xu LF，Luo YC.Anti-tumor activity of tanshinone IIA in combined with cyclophosphamide against Lewis mice with lung cancer.Asian Pacific journal of tropical medicine.2016；9（11）：1084-1088.
[13]Su CC，Chen GW，Kang JC，Chan MH.Growth inhibition and apoptosis induction by tanshinone IIA in human colon adenocarcinoma cells.Planta medica.2008；74（11）：1357-1362.
[14]Su CC，Lin YH.Tanshinone IIA inhibits human breast cancer cells through increased Bax to Bcl-xL ratios.International journal of molecular medicine.2008；22（3）：357-361.
[15]Cheng CY，Su CC.Tanshinone IIA may inhibit the growth of small cell lung cancer H146 cells by up-regulating the Bax/Bcl-2 ratio and decreasing mitochondrial membrane potential.Molecular medicine reports.2010；3（4）：645-650.
[16]Tung YT，Huang PW，Chou YC，Lai CW，Wang HP，Ho HC，et al.Lung tumorigenesis induced by human vascular endothelial growth factor（hVEGF）-A165 overexpression in transgenic mice and amelioration of tumor formation by miR-16.Oncotarget.2015；6（12）：10222-10238.
[17]Iwasaki K，Yabushita H，Ueno T，Wakatsuki A.Role of hypoxia-inducible factor-1alpha，carbonic anhydrase-IX，glucose transporter-1 and vascular endothelial growth factor associated with lymph node metastasis and recurrence in patients with locally advanced cervical cancer.Oncology letters.2015；10（4）：1970-1978.
[18]Huang J，Chen ZH，Ren CM，Wang DX，Yuan SX，Wu QX，et al.Antiproliferation effect of evodiamine in human colon cancer cells is associated with IGF-1/HIF-1alpha downregulation.Oncology reports.2015；34（6）：3203-3211.
[19]Ireland L，Santos A，Campbell F，Figueiredo C，Hammond D，Ellies LG，et al.Blockade of insulin-like growth factors increases efficacy of paclitaxel in metastatic breast cancer.Oncogene.2018；37（15）：2022-2036.
[20]He Y，Munday JS，Perrott M，Wang G，Liu X.Association of Age with the Expression of Hypoxia-Inducible Factors HIF-1alpha，HIF-2alpha，HIF-3alpha and VEGF in Lung and Heart of Tibetan Sheep.Animals：an open access journal from MDPI.2019；9（9）.
[21]De Francesco EM，Sims AH，Maggiolini M，Sotgia F，Lisanti MP，Clarke RB.GPER mediates the angiocrine actions induced by IGF1 through the HIF-1alpha/VEGF pathway in the breast tumor microenvironment.Breast cancer research：BCR.2017；19（1）：129.
[22]Fu S，Yin L，Lin X，Lu J，Wang X.Effects of Cyclic Mechanical Stretch on the Proliferation of L6 Myoblasts and Its Mechanisms：PI3K/Akt and MAPK Signal Pathways Regulated by IGF-1 Receptor.International journal of molecular sciences.2018；19（6）.
图5 TanⅡA对A549细胞MAPK和AKT活化的影响
（A）不同剂量TanⅡA预处理30min，与200 ng/ml IGF-1孵育6h后
A549细胞MAPK的表达（B）不同剂量TanⅡA预处理30min，与200 ng/ml IGF-1孵育6h后AKT的表达（C）MAPK和AKT抑制剂对IGF-1诱导的HIF-1α表达的影响。
注基金项目：国家青年科学自然基金 8100046
论文作者:孙子健1 党少康2（通讯作者） 王艳霞3（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2019年11期
论文发表时间:2019/11/13
标签：细胞论文; 抑制论文; 蛋白论文; 诱导论文; 水平论文; 肿瘤论文; 剂量论文; 《航空军医》2019年11期论文;