苏冬梅[1]2001年在《人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究》文中提出本研究的内容主要是建立高密度、高表达培养TPO重组细胞的工艺。进行了包括构建重组细胞株、确立重组细胞培养方法、建立TPO体外活性测定方法、纯化和鉴定表达产物等一系列实验。 首先将带有二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的TPO表达质粒pTcho以电穿孔法转入二氢叶酸还原酶缺陷的CHO（DHFR）细胞，通过条件培养基选择及氨甲碟呤加压筛选，获得能够高效、稳定地表达rhTPO的细胞株，命名为STPO-1。经细胞稳定性等多项指标的鉴定，证实该细胞可以作为生产细胞株。 为了实现高表达细胞培养，通过实验选择了合适的培养基、pH值和表达刺激物质等，确定了STPO-1细胞在瓶中的培养及表达方法。使细胞在瓶培养时的TPO表达量达到2000U/ml（相当于7mg/ml）。为了进一步实现重组细胞的高密度培养，利用生物反应器进行了大规模连续培养，摸索出了STPO-1细胞在生物反应器中培养时合适的pH值、溶解氧值、转数、通气流量、葡萄糖浓度和流加速度等，确定了STPO-1细胞在生物反应器中的生长及表达条件，在体积为5L的生物反应器中，利用无蛋白培养基培养，细胞密度达6×10~6个/ml，TPO表达量达12000U/ml（相当于40mg/ml），细胞密度和表达量均达到了瓶培养的6倍，表达时间达24天，收获量达100L，收获液经纯化后可得TPO蛋白650mg，并且在表达期间细胞代谢和表达量比较稳定。 为验证表达产物的结构，进一步对表达产物进行纯化，获得了均一的rhTPO组分。经鉴定，产品的纯度大于99％，分子量为70-120KD，N端17个氨基酸序列依次为Ser-Pro-Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg，等电点小于5，免疫印迹为单一条带。 通过实验获得了能高效、稳定地表达重组TPO的细胞株，并建立起一套完整有效的细胞培养及产物纯化技术。对大规模产业化生产和广泛的临床应用打下了坚实的基础。 在研制过程中，确定了TPO在体外定量测定的方法，该方法简便、灵敏沈阳药科大学硕士论文 人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究度高、重复性好，可做为常规方法推广使用。
张江霞, 肖正红[2]2016年在《重组人血小板生成素联合重组人白细胞介素11治疗恶性肿瘤放化疗后血小板减小症的安全性及有效性》文中提出目的探讨重组人血小板生成素联合重组人白细胞介素11治疗恶性肿瘤放化疗后血小板减小症的安全性及有效性。方法选取2011年12月至2014年12月南阳南石医院恶性肿瘤放化疗后血小板减小症患者132例,采用随机数字表法分为A组、B组、C组,各44例。A组采用重组人白细胞介素11治疗,加入到灭菌0.9%Na Cl注射液1 m L,皮下注射1.5 mg/次;B组采用重组人血小板生成素治疗,皮下注射15 000 U/次,每日1次;C组采用重组人血小板生成素联合重组人白细胞介素11治疗,重组人血小板生成素用法同B组,重组人白细胞介素11用法同A组。比较叁组患者治疗前后血常规指标、凝血指标、肝肾指标,分析叁组患者血小板计数恢复时间、治疗时间、血制品输注情况、临床疗效、药物不良反应。结果治疗后,叁组患者白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、凝血酶原时间、部分活化凝血活酶时间、纤维蛋白原、凝血酶时间、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、总胆红素、白蛋白、肌酐较治疗前均无明显改变(P>0.05)。治疗后C组血小板计数显着高于A组和B组[(118.9±13.4)×109/L比(89.1±10.3)×109/L,(101.2±16.2)×109/L],B组显着高于A组(P<0.05)。C组血小板计数>100×109/L恢复时间短于A组和B组[(13.95±1.41)d比(20.38±1.62)d,(17.60±1.54)d],B组短于A组(P<0.05)。C组ICU住院时间、持续用药时间短于A组和B组[(11.53±1.27)d比(15.02±0.94)d,(13.68±1.59)d;(7.16±0.53)d比(10.34±1.05)d,(8.92±0.87)d],B组短于A组(P<0.05);血浆、浓缩红细胞、血小板少于A组和B组[(136±41)m L比(294±76)m L,(223±54)m L;(1.12±0.47)U比(2.76±0.51)U,(1.98±0.32)U;(0.83±0.21)U比(2.14±0.67)U,(1.46±0.40)U],B组少于A组(P<0.05)。C组治疗总有效率高于A组和B组(100.0%比75.0%,90.9%),B组高于A组(P<0.05)。A、B、C组药物不良反应发生率差异无统计学意义[13.64%(6/44)比11.36%(5/44)比15.91%(7/44),P>0.05]。结论重组人血小板生成素、重组人白细胞介素11均是治疗恶性肿瘤放化疗后血小板减小症的有效药物,联合用药的效果更佳,安全性较高。
计丹妍[3]2012年在《重组人血小板生成素联合利妥昔单抗治疗免疫性血小板减少症》文中提出研究背景原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是一种以循环血小板数减少及出血风险增加为特征的获得性自身免疫性疾病。目前公认本病患者血小板减少的原因是血小板自身抗体/CTL导致血小板破坏增多和巨核细胞成熟障碍。重组人血小板生成素(rhTPO)是由中国仓鼠卵巢细胞表达的全长糖基化血小板生成素,能调控巨核细胞分化、成熟的全过程,促进巨核细胞形成和释放血小板。rhTPO起效快,但停药后血小板计数易反弹。利妥昔单抗(rituximab)是一个主要针对B细胞表面CD20分子的人鼠嵌合型单克隆抗体,可清除CD20+B淋巴细胞,减少抗体产生,使血小板破坏减少。利妥昔单抗有效维持时间较长,但起效慢,早期出血风险大。可见rhTPO和利妥昔单抗作用机制互补,作用时间窗互补,是联合应用治疗ITP的新选择。目的主要观察重组人血小板生成素(rhTPO)联合小剂量利妥昔单抗用于治疗激素无效/复发的原发免疫性血小板减少(ITP)的疗效及安全性。方法40例激素无效/复发的原发免疫性血小板减少症(ITP)患者均给予重组人血小板生成素(rhTPO)联合小剂量利妥昔单抗的给药方案：rhTPO300U/kg qd×14, SC,于第1-14天连续应用,其后可降低给药频率使得血小板计数维持在≥50×109/L即可,具体采取的给药频率由研究者根据血小板计数情况决定,可采取隔日一次、2次/周、1次/周、或者其他给药频率,第29天停药。利妥昔单抗100mg qw×4, ivdrip,分别于第1,8,15,22天应用。受试者住院治疗观察至少22天。如病情许可此后可在门诊随访观察至首剂rhTPO及利妥昔单抗治疗后3个月。治疗结束后每月随访一次,至首剂rhTPO及利妥昔单抗治疗后3个月,有条件的可继续跟踪随访。从首剂治疗开始12周无效(NR)者退出本试验。结果40例患者23例完全反应(CR：血小板计数芝100×109/L且没有出血),32例有效(R：血小板计数>30×109/L并且至少比基础血小板计数增加两倍,且没有出血),8例无效(NR：血小板计数<30x109/L或者血小板计数增加不到基础值的两倍或者有出血),对其中16例有效患者进行随访至第90天,其中5例复发(获得CR或者R后,血小板计数再次低于30×109/L或者有出血)。中位起效时间为7天,中位疗效持续时间12周。经标准剂量rhTPO联合小剂量利妥昔单抗治疗前后患者血压、脉搏、呼吸、心电图、白细胞、血红蛋白、肝肾功能及凝血功能指标无统计学差异。治疗相关不良反应轻微,经对症支持治疗后均缓解。结论rhTPO联合小剂量利妥昔单抗治疗激素无效或复发ITP有效率高(80%),起效快(中位起效时间为7d),不良反应可以耐受,为激素无效或复发ITP的治疗提供了新选择。
王崧[4]2013年在《新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究》文中研究说明随着社会的发展，由多种原因引起的血小板减症越来越常见。血小板由骨髓中的巨核细胞产生，通过对巨核细胞增殖分化进行调控，可有效促进血小板生成。因此，具有升血小板作用的造血生长因子类基因工程产品倍受推崇。然而，目前临床上用于救治血小板减少症的该类药物种类稀少，且存在着可能产生中和性抗体、副反应突出、价格昂贵等多种缺点，临床上迫切需要能够高效升血小板的新型药物。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)，又称巨核细胞生长发育因子(megakaryocytegrowth and development factor, MGDF)，是调节巨核细胞生成和血小板产生最重要的细胞因子。通过与其受体(c-Mpl)结合，TPO能够激活巨核细胞中一系列的信号通路，发挥其促进巨核细胞增殖分化的功能。据此，人们尝试利用基因工程方法制备出重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长发育因子(pegylated recombinant human megakaryocyte growth and developmentfactor, PEG-rhMGDF)两种第一代促血小板生长因子类药物。但是，PEG-rhMGDF在临床试验中产生了能够与内源性TPO交叉反应的中和性抗体，美国FDA因此全面禁止了重组人TPO类基因工程产品的临床实验。TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)是通过噬菌体表面展示技术鉴定出的一种由14个氨基酸组成，与c-Mpl具有高亲和力，但与TPO序列完全不同源的短肽。实验表明，TMP不仅能够在体外有效促进巨核细胞增殖，且在动物体内未发现其能够诱导产生中和性TPO抗体。然而，TMP分子量太小，难以通过基因工程方法制备，且在循环中极易降解，限制了其应用。多项体内研究发现，人生长激素(human growth hormone, hGH)对造血干/巨核祖细胞增殖分化及促进血小板生成具有重要调控作用。hGH主要通过与其受体(growthhormone receptor, GHR)结合发挥其生物学活性，该受体与c-Mpl同为I类细胞因子受体，能够激活相似的增殖分化信号通路。因此，我们设想将TMP与hGH进行融合，一方面利用与生长激素进行融合，提高分子量，使得TMP能够通过基因工程方法进行制备，同时延长其体内半衰期。另一方面，通过融合发挥TMP与hGH在促进巨核细胞生成及血小板产生方面的协同作用。基于已有的研究基础，在国家“863”计划和新药创制科技重大专项课题的资助下，我们首先尝试通过巴斯德毕赤酵母表达系统对一个TMP分子与hGH的融合蛋白rTMP-GH进行了发酵表达及纯化制备。之后，为了提高融合蛋白的生物学活性，又设计了一种由两个串联的TMP分子(TMP二联体)与hGH组成的融合蛋白，并利用pMAL-p2x原核表达载体在大肠杆菌中进行可溶性表达与制备。在确认dTMP-GH具有显着促进巨核细胞生成活性的基础上，为了简化制备工艺、提高产量，进一步探索了在大肠杆菌中以温控诱导和包涵体表达方式生产制备dTMP-GH融合蛋白，通过工艺优化最终实现了该重组融合蛋白的高密度发酵表达及放大生产，获得了纯度大于98%，且具有高效促巨核细胞增殖分化活性的dTMP-GH融合蛋白基因工程产品。同时，从信号通路激活的角度对dTMP-GH融合蛋白促巨核细胞增殖分化的作用机制进行了探讨。所取得的主要研究结果与结论如下：1.通过基因重组成功构建了pPIC9K-rTMP-GH真核重组表达质粒，筛选出高G418抗性的His+/Mut+多克隆表达菌株，实现了rTMP-GH在巴斯德比赤酵母GS115中的高密度发酵表达。经超滤、阴离子柱及分子筛纯化，获得了纯度大于95%的rTMP-GH重组融合蛋白。经体外实验证实rTMP-GH具有一定的促进巨核细胞增殖活性。2.通过合理化设计酶切位点，成功构建了pMAL-dTMP-GH重组表达质粒。电转化大肠杆菌后，阳性克隆经IPTG诱导，获得可溶性融合蛋白MBP-dTMP-GH。通过亲和层析、Xa酶切、疏水株及分子筛再纯化，最终得到纯度达98.5%，且N端不含任何多余氨基酸的重组融合蛋白dTMP-GH。体外细胞实验证实，dTMP-GH能够以剂量依赖方式促进巨核祖细胞株M07e的增殖，其活性显着优于等摩尔剂量的rTMP-GH融合蛋白。3.利用温控原核表达载体pBV220，通过包涵体形式实现了dTMP-GH融合蛋白在大肠杆菌中的高密度发酵表达，表达水平约为500mg/L。建立了包括包涵体变性、复性、阳离子柱层析、阴离子柱层析及分子筛层析的纯化方案，获得了纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白，得率为20%。其生物学活性与采用大肠杆菌分泌性表达方式制备的dTMP-GH无显着性差异。4.体外实验证实，dTMP-GH促进早期巨核细胞增殖的活性较等摩尔剂量dTMP强，GH拮抗剂培维索孟预处理能够显着削弱dTMP-GH的促巨核细胞增殖活性，提示融合蛋白中的hGH具有增强dTMP促巨核细胞增殖分化的作用，而且这种增强作用可能通过巨核细胞表面的GHR介导发挥。5. Western blot分析结果表明， dTMP作用15min即可显着上调M07e细胞中STAT5和ERK1/2的磷酸化水平，1h左右磷酸化水平恢复正常，而rhGH却无明显促STAT5磷酸化作用，但在其作用1h后可出现ERK1/2的显着磷酸化，并可持续3h以上时间。提示rhGH可能通过缓慢而持续激活ERK1/2信号通路来增强dTMP诱导的巨核细胞增殖与分化。6.激光共聚焦及Western blot检测分析发现，rhGH处理能够显着上调成熟巨核细胞株Meg-01中肌动蛋白的表达，并能促进肌丝拉伸和细胞伪足伸出，提示rhGH具有促进巨核细胞分化成熟的作用。进一步研究发现，rhGH作用15min即可显着上调Meg-01中Akt的磷酸化水平，而dTMP对Akt无明显激活作用，提示rhGH可能通过激活Akt信号通路促进了巨核细胞的分化成熟。7. dTMP-GH融合蛋白可同时发挥dTMP与rhGH的生物学活性。在M07e中，dTMP-GH作用可同时上调STAT5和ERK1/2的磷酸化水平，且ERK1/2磷酸化可持续3h以上。给予GH拮抗剂培维索孟能够抑制dTMP-GH对ERK1/2信号通路的持续激活作用。在Meg-01中，dTMP-GH作用可显着上调Akt的磷酸化水平，且该作用能够被培维索孟显着抑制。8.对人脐血CD34+来源的原代巨核细胞的实验证明，dTMP-GH能够显着上调培养至7d原代巨核细胞STAT5和ERK1/2磷酸化水平，且ERK1/2磷酸化可持续至3h以上。并且dTMP-GH作用可显着激活培养至11d原代巨核细胞中的Akt信号通路。总之，本研究通过探索不同的表达体系、优化表达条件和纯化工艺，从而成功实现了一种TMP二联体与hGH的重组融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与制备，最终获得纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白。体外实验证实，dTMP-GH具有显着促进巨核细胞增殖分化活性，其中dTMP主要发挥促进巨核细胞早期增殖分化的作用，GH除了可以增强dTMP的促巨核细胞增殖活性外，还具有促进巨核细胞分化成熟的作用。因而，通过融合不仅间接增大了dTMP的分子量，使其可以通过基因工程方法进行制备，而且所形成融合蛋白还具有突出促巨核细胞增殖、分化和成熟的活性，显示出很好的开发应用前景。
申明强[5]2014年在《一种新型升血小板基因工程产品制备工艺优化及质量标准研究》文中进行了进一步梳理血小板减少症在临床治疗中较为常见，严重的血小板水平低下直接威胁着人体生命安全。血小板减少性紫癜、肿瘤放/化疗、再生障碍性贫血及骨髓移植等许多因素都能引起血小板减少。目前，临床上应对血小板减少的主要治疗方法仍然是直接输注血小板；然而，血小板输注存在着输血反应、病原体感染等多种隐患。已知血小板由骨髓巨核细胞产生，因而通过对巨核细胞增殖分化进行调控可以达到促进血小板生成的目的。所以，能够促进巨核细胞增殖分化的造血生长因子类基因工程药物越来越受到人们的广泛关注。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)，也称为巨核细胞生长发育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF)，是调节巨核细胞增殖分化和血小板生成的重要细胞因子，可通过与受体(c-Mpl)的结合，激活巨核细胞中相应的信号通路，发挥其促巨核细胞增殖分化的作用。人们利用基因重组方法，研制出聚乙二醇化的重组人巨核细胞生长发育因子(pegylated recombinant human megakaryocyte growthand development factor, PEG-rhMGDF)和重组人血小板生成素(recombinant humanthrombopoietin, rhTPO)两种第一代促进血小板生成基因工程药物。但是，PEG-rhMGDF在美国进行二期临床试验时，发现其能诱导产生与内源性TPO起交叉反应的中和性抗体，反而使患者血小板水平进一步降低。因此，美国FDA随即全面禁止了重组人TPO基因工程药物的临床实验。之后，人们又用噬菌体表面展示技术筛选出一种由14个氨基酸组成的TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP)，它与TPO无同源序列，但与c-Mpl具有较高亲和力。研究表明，TMP尤其是其二联体（dTMP）不仅能促进巨核细胞增殖，并且不会诱导产生TPO中和性抗体。然而，由于TMP分子量只有1.5KD，通过基因工程制备难度较大，并且在体内循环中极易被降解。已有研究表明，人生长激素(human growth hormone, hGH)对骨髓造血干细胞的增殖和/或分化具有重要调控作用，并且发现在体内应用后可加速血小板水平恢复。hGH可通过与其受体(growth hormone receptor, GHR)结合发挥生物学活性，该受体与c-Mpl为同类细胞因子受体，可激活相似的信号通路。因此，本室将GH与dTMP进行融合，构建出重组融合蛋白分子dTMP-GH，以期发挥协同促进巨核细胞增殖及血小板生成作用。另一方面，融合蛋白dTMP-GH的分子量为26KD，较单纯TMP更容易进行基因工程制备，且可望延长其体内半衰期。前期工作中，我们已构建并筛选出特异性表达dTMP-GH的工程菌株，并进行了实验室水平的小规模制备。在此基础上，为放大生产，满足新药申报要求，本研究进一步对融合蛋白dTMP-GH在大肠杆菌中的高效表达和纯化制备工艺进行了优化，最终实现了该重组融合蛋白的中试放大生产，获得纯度大于98%的目标产品，并对该融合蛋白的质量标准及体内分布进行了初步研究。主要研究结果与结论如下：1.基于已有的dTMP-GH表达菌株，通过对培养基成分、培养温度和培养时间的优化，成功将从一个单克隆到获得目的蛋白菌体整个酵表达过程控制在30小时以内，含目的蛋白的湿菌产量达50g/L，目的蛋白表达量占总蛋白的25%，高压匀浆破菌后dTMP-GH包涵体含量达到50%以上。2.为提高效率和处理量，采用超滤法代替透析法对包涵体进行复性。通过对纯化条件的优化，目前单次纯化所得融合蛋白dTMP-GH的量达到克级，产品纯度大于>98%。3.对融合蛋白dTMP-GH的分子量、等电点、氨基酸序列、纯度等理化特性及其冻干制剂成品的水分、pH值、渗透压摩尔浓度、蛋白含量、纯度、质谱分子量、质量肽谱分析、宿主菌蛋白残留、外源性DNA残留、细菌内毒素含量、热原、生物学活性等进行了检测，各项指标均达到治疗用生物制品的申报标准要求。在此基础上，与中国食品药品检定研究院共同草拟了融合蛋白dTMP-GH的质量标准草案。4.用放射性碘标记融合蛋白dTMP-GH，制备得到标记率为71.5%、放射纯度为96.5%、比活度为0.22MBq/μl的125I-dTMP-GH。BALB/c小鼠经尾静脉注射放射性125I标记的dTMP-GH后，于30分钟时股骨放射性计数达到最高值，占到注射总量的10%，随时间推移经肝、肾代谢排出体外。证实融合蛋白dTMP-GH具有明显骨髓偏向性分布特点。通过本研究，成功建立了融合蛋白dTMP-GH快速高效的中试规模制备工艺及质量标准草案。单次发酵纯化可获得克级且纯度>98%的dTMP-GH，可制备出3000支冻干产品。抽样检测结果均符合dTMP-GH质量标准要求，为融合蛋白dTMP-GH的进一步开发和申报新药奠定了基础。
王泽宋[6]2012年在《家蚕30K基因对CHO细胞抗凋亡和促进目的产物表达的作用及其机制》文中研究表明与微生物表达系统相比,哺乳动物细胞表达系统能够更好地完成对目的蛋白的翻译后修饰(如糖基化)而倍受青睐。目前由哺乳动物细胞表达的重组蛋白类药物已经占据现代生物医药市场的最主要部分。然而哺乳动物细胞也还有一些不足之处,例如,细胞在培养过程中易遭受凋亡,对目的产物的表达还不够高效,表达的糖基结构与天然结构相比还存在某些差异,特别是位于末端的唾液酸往往缺失或错配等,这在一定程度上影响了目的蛋白的生产效率以及产品的生物学活性。因此采用基因工程和代谢工程等手段对重组细胞株进行工程化改造,弥补其不足、改进其性能,成为未来工业化发展的紧迫任务。在韩国课题组的前期研究中,发现蚕蛹血淋巴(Silkworm hemolymph, SH)能够抑制昆虫细胞和人源细胞的凋亡,且进一步研究发现其抗凋亡成分是一组结构相关、分子量约为30 kDa的蛋白(30K蛋白),包括30Kc6、30Kcl2、30Kcl9、30Kc21和30Kc23五个同源蛋白,其中30Kc6、30Kcl2和30Kc19基因被成功克隆,并在中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO) DG44中表达,以检测其抗凋亡效果。结果发现只有30Kc6基因具有显着的抗凋亡活性。但另有研究发现30Kc19基因在改善重组蛋白表达和糖基化水平方面具有重要作用。然而迄今为止,有关30Kc6和30Kc19基因的作用机制尚未明了,未来能否将它们应用于重组细胞株的工程化改造以提升其性能尚不得而知。为此,本文以表达抗CD20嵌合单克隆抗体和典型糖蛋白重组人EPO的两株重组CHO细胞为对象,前者共表达30Kc6基因,后者共表达30Kcl9基因,分别研究30Kc6基因对提高重组CHO细胞抗凋亡能力以及30Kc19基因对促进重组CHO细胞产物表达和提高产物糖基化水平的作用及其机制,并就上述基因应用于重组细胞株工程化改造的可行性作出分析和评判,旨在为未来应用于重组蛋白药物工业化生产的细胞株优化改造提供实验依据和科学指导。本文首先将30Kc6基因转染至表达抗CD20嵌合单克隆抗体的CHO细胞,分别建立叁株基因稳定表达的阳性细胞克隆和叁株仅仅转染空载质粒的阴性对照细胞克隆,并采用6孔培养板的贴壁培养进行实验。研究发现30Kc6基因的表达一方面显着抑制了CHO细胞的凋亡,另一方面也使抗体的比生产速率提高了1.3倍,最终获得的抗体浓度达到对照的3.4倍。进一步研究发现,30Kc6基因的表达抑制了促凋亡蛋白Bax从胞浆向线粒体的转移,并减少细胞色素C从线粒体膜间隙向胞浆的释放,抑制凋亡执行者Caspase-3的活化,从而抑制细胞凋亡的发生。同时,30Kc6基因的表达能够明显维持线粒体膜电位并促进ATP生成,提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,使真核起始因子4E绑定蛋白1(4E binding protein 1,4EBP1)和核糖体蛋白S6激酶1(S6 kinase 1, S6K1)得以进一步磷酸化,促进翻译的起始和延伸,从而强化目的蛋白的表达,提高其比生产速率。另外,实验发现在转录水平上30Kc6基因表达细胞的抗体重链和轻链mRNA相对数量只比阴性对照细胞提高了8.3%和8.7%,说明30Kc6基因对目的产物表达的转录过程没有产生明显影响,其作用主要在于维持线粒体膜电位并促进ATP生成,提高mTOR的活性,从而强化目的产物表达的翻译过程。高渗透压环境下的细胞凋亡一直以来是动物细胞高密度流加培养过程开发和优化面临的难题之一,为了进一步考察共表达30Kc6基因能否抑制高渗透压诱导的细胞凋亡,本文将上述贴壁培养的阳性和阴性细胞克隆进一步适应到无血清悬浮培养,并采用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测。实验数据显示,当渗透压由正常条件的310升高到410mOsm/kg时,细胞活性均有所下降,其中渗透压提高的第2天30Kc6基因表达细胞的凋亡率上升了4.74个百分点,而阴性对照细胞凋亡率的上升则达15.45个百分点,说明30Kc6基因的表达能够显着抑制高渗透压诱导的细胞凋亡。另外,实验发现在高渗透压条件下30Kc6基因的表达依然显着提高了细胞的抗体比生产速率,同时因其对高渗透压诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用,所以最终使培养过程的抗体产量获得大幅度提高。对于30Kc19基因的作用及其机制的研究,本文采用重组CHO细胞共表达30Kc19基因和在培养基中添加30Kc19蛋白两种方法进行。首先将30Kc19基因转染至表达典型糖蛋白EPO的重组CHO细胞,建立叁株基因稳定表达的阳性细胞克隆和一株仅仅转染空载质粒、与原始重组细胞生长相似的阴性对照细胞克隆,并在12孔细胞培养板中进行贴壁培养。实验发现,在共表达30Kc19基因的重组CHO细胞培养上清中EPO产量增加了102.6%,比生产速率提高了146%。利用双向电泳免疫印迹法对EPO的唾液酸含量进行检测,发现共表达30Kc19基因的CHO细胞所合成的EPO亚基等电点与对照细胞表达的EPO相比明显从大约6.5向4.8处移动,说明EPO唾液酸含量也有显着提高。研究结果证实,30Kc19基因的表达一方面较好地维持了线粒体的膜电位,并促进ATP生成,通过强化翻译过程使EPO的比生产速率得以提高,另一方面它还改善了唾液酸转移酶的活性,从而提高EPO的唾液酸含量。为了进一步考察30Kc19基因的作用,实验将上述共表达30Kc19基因的阳性细胞克隆和阴性对照细胞克隆适应到无血清悬浮培养,结果表明共表达30Kc19基因的CHO细胞在悬浮培养过程中获得的EPO产量达到阴性对照细胞的2.5倍。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)对EPO蛋白N糖苷键连接糖基(N糖基)的糖基结构、唾液酸和岩藻糖含量进行定量分析,发现30Kc19基因表达细胞合成了具有2个、3个、4个和5个触角分支的N糖基,比例分别为35.12%、18.12%、33.14%和13.62%,而阴性对照细胞合成的主要是具有2个触角分支的N糖基,比例为70.00%。而且,30Kc19基因表达细胞所合成的N糖基中有52.89%添加了唾液酸,76.83%添加了岩藻糖,而阴性对照细胞合成的N糖基中没有检测到唾液酸,只有61.45%添加了岩藻糖。由此可见,30Kc19基因的表达使CHO细胞合成的EPO糖基结构更加复杂,且唾液酸和岩藻糖含量也更高。最后,本文利用大肠杆菌表达的30Kc19蛋白,将其纯化后添加到无血清培养基中,以考察添加的30Kc19蛋白对CHO表达的EPO产量及其唾液酸含量的作用。结果显示,无血清培养基中添加的0.2 mg/ml重组30Kc19蛋白,使EPO产量提高了41.6%,同时其亚基等电点也从大约6.2向4.6处移动,说明EPO蛋白的唾液酸含量也有明显增加。上述结果表明,不论是重组CHO细胞共表达30Kc19基因还是在其悬浮培养的无血清培养基中添加重组30Kc19蛋白,都能够提高EPO的产量及其唾液酸含量,但相比之下,通过基因工程改造的基因共表达方式更为有效。通过本文的大量实验研究,不仅认识了30Kc6基因对提高CHO细胞抗凋亡能力的作用,以及30Kc19基因对提高CHO细胞的目的产物表达能力及其糖基化水平的重要贡献,而且对它们的具体作用机制也给予了更加深入的剖析和揭示。同时,本文结果也证明,在重组CHO细胞中共表达30Kc6和30Kc19等来源于家蚕的30K基因,可望成为未来提高重组细胞株抗凋亡能力、促进目的产物表达并提高其糖基化品质等重组细胞株工程化改造的一种具有潜在应用价值的新途径。
徐雅靖, 李晓林, 赵谢兰, 陈焱, 付斌[7]2013年在《重组人血小板生成素与重组人白介素-11促进白血病患者异基因造血干细胞移植后血小板恢复的疗效比较》文中指出目的比较重组人血小板生成素(rhTPO)与重组人白介素-11(rhIL-11)对促进白血病患者异基因造血干细胞移植术后血小板恢复的临床疗效及安全性。方法将114例行异基因造血干细胞移植的白血病患者分为IL-11组、TPO组和空白组,分别为36例、56例和22例,IL-11组及TPO组从移植后第6天开始分别给予rhIL-11 1.5 mg/d及rhTPO 15 000 u/d皮下注射,至血小板上升至100×109/L停药,如使用14 d未达正常亦停用。空白组患者不应用任何升血小板药物,血小板自然恢复。监测血常规并观察记录患者用药后的不良反应及30 d内血小板悬液输注量。结果IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥20×109/L的中位时间分别为+13(8～20)d、+12(6～25)d和+19.5(12～32)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.003,0.001),但IL-11组和TPO组两组没有统计学差别(P=0.640);IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥50×109/L的中位时间分别为+16.5(10～39)d、+15(11～48)d和+29(15～49)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.002,0.001),IL-11组和TPO组两组亦没有统计学差别(P=0.357);IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥100×109/L的中位时间分别为+25(13～69)d、+18(14～48)d和+43(19～64)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.001,0.004),TPO组较IL-11组缩短7 d,两组差异有统计学意义(P=0.033)。+30 d内IL-11组、TPO组及空白组输注血小板悬液的中位数量分别为2(0～6)个治疗量、2(0～4)个治疗量和4(1～4)个治疗量,IL-11组和TPO组的血小板悬液输注量均少于空白组(P值分别为0.005,0.003),但该两组之间差异无统计学意义(P=0.499)。TPO组的不良反应发生率3.6%明显低于IL-11组的77.8%(P<0.001)。结论 rhTPO及rhIL-11均能够促进白血病患者异基因造血干细胞移植术后血小板计数的恢复,有效减少血小板悬液的输注量,降低移植出血相关风险;rhTPO较rhIL-11能缩短血小板升至正常的时间,从而提高患者对移植并发症的耐受性;rhTPO较rhIL-11的不良反应更少,具有良好的安全性,值得临床进一步推广应用。
刘蕾[8]2017年在《血小板生成素水平在急性炎症状态的变化及意义探讨》文中指出研究背景与研究目的血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)是由位于染色体3q26.3-3q27上的单拷贝基因编码的糖蛋白,编码基因由7个外显子和6个内含子组成。TPO主要由肝细胞产生,肾脏、骨髓基质细胞、内皮细胞等也可少量表达,是血小板生成最重要的调控因子,其调节巨核细胞增殖分化及促使血小板生成的作用是通过与其特异性受体c-Mpl相互作用产生。然而,c-Mpl除存在于造血细胞上,心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等表达c-Mpl也被陆续证明。并且血小板上c-Mpl具有吸附、内化、破坏TPO的功能,结合血清中TPO水平通常与血小板、巨核细胞数量负相关,Kuter等提出外周血血小板数量对TPO的循环水平有负反馈作用。在血小板增多的人群中,血小板对TPO破坏增多,导致血浆TPO水平减少,减少血小板生成;而对于血小板减少的人群,血小板对TPO破坏明显减少,使血浆中TPO水平升高,促进血小板数量增多。然而,目前有越来越多研究提出,除受到血小板数量的调节外,TPO在血清中水平还受到其他机制的调控。其中炎症状态被认为是重要的一项调节机制。在既往对于脑梗死、川崎病、脓毒血症、手术后状态等一系列炎症性疾病与TPO水平相关的研究中显示,TPO水平与炎症状态及部分炎症因子具有相关性,其变化并可能受到炎症状态影响。但既往研究对象多为单一病种,炎症水平状态不一致,且病例数较少,难以说明在不同炎症性疾病状态下TPO均受炎症作用影响。因此,本研究将从多种急性炎症性疾病入手,评估不同炎症水平状态下血清中TPO水平的变化,并探讨其临床意义。研究内容与研究方法本研究通过病例对照研究,对急性炎症状态患者与健康体检者间TPO血清水平及血细胞计数进行比较,确定病例组(急性炎症状态患者)的TPO血清水平是否高于对照组(健康体检者),不同炎症水平下TPO血清水平是否有变化,并观察相应状态下血细胞计数的变化。1.研究对象:根据研究对象选择标准于2016年3～9月经南方医科大学南方医院、佛山市第一人民医院、深圳市罗湖区人民医院急诊科收治的急性心肌梗死、急性脑梗死、急性创伤、细菌性肺炎四种疾病共65例急性炎症状态患者作为病例组。其中男性42例,女性23例,患者年龄(47.98±12.33)岁。急性心肌梗死组患者15例,根据梗死部位有广泛前壁7例,下侧壁2例,下壁3例,心内膜下3例;急性脑梗死患者15例,根据Adama分类法有大面积梗死4例,小面积梗死6例,腔隙性梗死5例;急性创伤组患者25例,包括全身多处锐器伤9例,中等面积深Ⅱ度烫烧伤7例,肋骨、上肢骨多处断裂伤5例,严重颅脑挫裂伤4例;急性肺炎组患者10例。另选择同期体检健康者42例作为对照组,年龄(48.55±18.21)岁,其中男性27例,女性15例。2.方法:收集病例组与对照组的外周血标本测定TPO血清水平及血常规。1)外周血TPO血清水平测定:采用定量夹心酶联免疫吸附试验方法,并且所有操作由专人完成。2)血常规测定:由所在医院检验科进行。3.统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计学分析,计量资料结果以X±SD表示。应用独立样本t检验对炎症疾病组与对照组TPO水平及血常规等临床资料进行比较;将炎症疾病组根据疾病种类不同分为四个亚组,采用多个独立样本Kruskal-Wallis H检验比较炎症疾病各亚组、对照组间TPO水平及血常规间的差异,并进一步应用Nemenyi法检验进行多个独立样本间的两两比较。所有P值均为双向,并定义P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.t检验结果:与对照组比较,总炎症疾病组TPO血清水平明显升高(P<0.001),且白细胞计数差异显着(P<0.001);而红细胞计数、血红蛋白及血小板计数差异无统计学意义(P>0.05);2.多重比较结果:1)TPO血清水平均数从对照组、脑梗组、心梗组、创伤组到肺炎组依次增加,其在各组间多重比较(P<0.001)。其中,与对照组比较,心梗组(P=0.002)、脑梗组(P<0.001)、创伤组(P<0.001)及肺炎组(P<0.001)的TPO血清水平差异显着;肺炎组与心梗组(P=0.048)和脑梗组(P=0.016)间、创伤组与脑梗组间(P=0.030)存在统计学差异,其余两组间比较差异不显着。2)而白细胞数均数从对照组、心梗组、脑梗组、创伤组到肺炎组依次增加,5组间差异具有统计学差异(P<0.001)。其中,与肺炎组比较,脑梗组(P=0.003)、心梗组(P=0.003)及对照组(P<0.001)的白细胞数具有统计学差异;同时,与创伤组相比,心梗组(P=0.013)、脑梗组(P=0.015)及对照组(P<0.001)也具有显着差异;而在肺炎组和创伤组间及脑梗组、心梗组和对照组间均差异不显着。3)血小板数(P=0.447)、红细胞数(P=0.121)及血红蛋白浓度(P=0.524)在各组间均无显着差异。研究结论研究结果显示:在急性炎症状态的下,TPO血清水平的升高与血小板数无明显相关,但与炎症水平具有相关性,其升高程度可作为机体炎症水平的指标,并且TPO可能作为一种急性期反应蛋白对机体产生保护性作用。
马军, 秦叔逵, 候明, 邵宗鸿[9]2018年在《重组人白介素-11治疗血小板减少症临床应用中国专家共识(2018年版)》文中认为重组人白介素-11(rh IL-11)是促血小板生成药物,主要通过促进造血干细胞和巨核祖细胞的增殖,诱导巨核细胞成熟,促进高倍性巨核细胞生成,从而增加血小板的生成。多项临床研究充分表明,rh IL-11能够减少严重血小板减少症的发生率,降低患者血小板输注需求,具有较高的客观有效性,并且明显改善患者的生存质量,不良反应发生率低,耐受性良好。为了更好地指导临床上合理、有效地应用rh IL-11防治血小板减少症,中国临床肿瘤学会等组织了相关领域的多学科专家学者,根据rh IL-11上市后多年国际、国内用药情况,参考其他血小板生成药物的使用经验,共同讨论,多次修改,最终形成了本共识,以供临床医师作为重要参考。
丁可, 韩菲菲, 徐庆, 张瑞, 商健彪[10]2018年在《重组血小板生成素对吉西他滨相关血小板减少症的预防作用》文中研究指明目的探究重组血小板生成素对吉西他滨化疗引起的血小板减少症的预防作用。方法选取我院2015年5月至2017年5月收治的吉西他滨化疗引起的血小板减少症患者共61例,按照随机数表法分为对照组(n=31)与观察组(n=30),分别接受重组人白细胞介素-11与重组血小板生成素预防性注射,比较两组患者血小板减少症治疗效果、血小板水平、不良反应发生率。结果观察组治疗总有效率为93.3%,明显高于对照组治疗总有效率71.0%,P<0.05。两组患者治疗前血小板水平无明显差异,P>0.05。治疗后7d、15d、21d,观察组血小板水平均明显高于对照组,P<0.05。两组患者不良反应发生率无明显差异,P>0.05。结论重组血小板生成素对吉西他滨化疗引起的血小板减少症有较好的治疗效果,可有效提高血小板计数,未增加不良反应发生率,值得临床推广运用。
参考文献：
[1]. 人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究[D]. 苏冬梅. 沈阳药科大学. 2001
[2]. 重组人血小板生成素联合重组人白细胞介素11治疗恶性肿瘤放化疗后血小板减小症的安全性及有效性[J]. 张江霞, 肖正红. 医学综述. 2016
[3]. 重组人血小板生成素联合利妥昔单抗治疗免疫性血小板减少症[D]. 计丹妍. 山东大学. 2012
[4]. 新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究[D]. 王崧. 第叁军医大学. 2013
[5]. 一种新型升血小板基因工程产品制备工艺优化及质量标准研究[D]. 申明强. 第叁军医大学. 2014
[6]. 家蚕30K基因对CHO细胞抗凋亡和促进目的产物表达的作用及其机制[D]. 王泽宋. 华东理工大学. 2012
[7]. 重组人血小板生成素与重组人白介素-11促进白血病患者异基因造血干细胞移植后血小板恢复的疗效比较[J]. 徐雅靖, 李晓林, 赵谢兰, 陈焱, 付斌. 血栓与止血学. 2013
[8]. 血小板生成素水平在急性炎症状态的变化及意义探讨[D]. 刘蕾. 南方医科大学. 2017
[9]. 重组人白介素-11治疗血小板减少症临床应用中国专家共识(2018年版)[J]. 马军, 秦叔逵, 候明, 邵宗鸿. 临床肿瘤学杂志. 2018
[10]. 重组血小板生成素对吉西他滨相关血小板减少症的预防作用[J]. 丁可, 韩菲菲, 徐庆, 张瑞, 商健彪. 海峡药学. 2018
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