马钢, 任明姬[1]2012年在《骨性关节炎软骨细胞凋亡的研究》文中研究表明骨性关节炎是一种以软骨下骨改变和软骨退化为特征的关节退行性疾病。研究证实软骨细胞凋亡在骨性关节炎发生发展中起到关键作用。因此,研究骨关节炎软骨细胞凋亡机制及研发或筛选抗软骨细胞凋亡的药物必将给骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。
赵宝祥[2]2016年在《基于IL-1β/MAPKs通路探讨威灵仙总皂苷对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响》文中研究表明目的:建立兔膝骨关节炎(OA)动物模型及软骨细胞体外培养体系,观察威灵仙总皂苷(TSC)对软骨细胞凋亡的影响,探讨TSC通过IL-1β/MAPKs信号通路干预兔膝OA软骨细胞凋亡的机制。方法:1、TSC对兔膝OA IL-1β/MAPKs信号通路及软骨细胞凋亡影响的在体实验健康雄性新西兰大白兔48只,随机分为两组:空白组及模型组,每组分别有兔8只、40只,模型组采取石膏管型固定(左后肢膝关节伸直位)造模,造模成功后,模型组兔随机分为5组:模型对照组,TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组及塞来昔布组,每组8只。空白组及模型对照组,每日抽取10毫升生理盐水灌胃,TSC低、中、高剂量组分别按25mg/Kg/d、50mg/Kg/d.100mg/Kg/d灌胃,塞来昔布组每日灌胃剂量为10mg/Kg。6周后处死动物,取膝关节软骨多聚甲醛固定、石蜡包埋,HE染色观察软骨组织的形态结构,ELISA法检测软骨组织内IL-1β的浓度。RT-PCR法检测软骨组织内Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表达。Western-blot法检测软骨组织p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达。2、TSC对IL-1β作用下软骨细胞凋亡及MAPKs信号通路影响的离体实验(1)健康4周龄新西兰大白兔20只,取膝关节软骨组织,建立兔膝软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞,显微镜下观察软骨细胞的形态。(2)取第3代软骨细胞,随机分为正常组,IL-1β组、IL-1β+TSC组1(TSC浓度为25μg/m L)、IL-1β+TSC组2(TSC浓度为50μg/m L)、IL-1β+TSC组3(TSC浓度为100μg/m L)、IL-1β+TSC组4(TSC浓度为200μg/m L)、IL-1β+TSC组5(TSC浓度为400μg/m L),各组IL-1β浓度均为10ng/m L,分别干预24h、48h,72h、96h后,MTT法检测软骨细胞的活性,筛选TSC对IL-1β作用下的软骨细胞最佳干预浓度和时间。(3)选取第3代软骨细胞,随机分为空白组、IL-1β组(10ng/m L)、IL-1β+TSC组(IL-1β浓度为10ng/m L、TSC浓度为MTT法确定的最佳干预浓度),依确定的最佳干预时间干预后,收集软骨细胞,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡。RT-PCR法检测软骨细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表达。Western-blot法检测各组软骨细胞p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达情况。结果:1、TSC对兔膝OAIL-1β/MAPKs信号通路及软骨细胞凋亡影响的在体实验(1)模型组动物X片示,关节间隙不对称,关节间隙狭窄,关节面不光整,关节周围骨质硬化,有骨赘形成,造模成功。干预6周后,HE染色结果表明不同浓度的TSC和塞来昔布均可以明显促进膝OA软骨组织的修复,TSC高剂量组效果最佳;各组软骨组织内IL-1β的水平,模型对照组明显高于空白组IL-1β水平(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组及TSC高剂量组明显低于模型对照组(P<0.05),随着TSC浓度增加,IL-1β的水平逐渐降低,TSC高剂量组IL-1β水平明显低于塞来昔布组(P<0.05)。(2)干预6周后,各组软骨组织内Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9m RNA表达:Bcl-2 m RNA,模型对照组明显低于空白组(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组及TSC高剂量组明显高于模型对照组(P<0.05),TSC中剂量组明显高于TSC低剂量组(P<0.05),TSC高剂量组明显高于TSC中剂量组(P<0.05),塞来昔布组明显低于TSC高剂量组(P<0.05);Bax m RNA表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05),TSC低、中剂量组与模型对照组比较没有显著性差异(P>0.05),TSC高剂量组及塞来昔布组明显低于模型对照组(P<0.05),TSC高剂量组与塞来昔布组比较无显著性差异(P>0.05);Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组、塞来昔布组均明显低于模型对照组(P<0.05);Caspase-3 m RNA表达,TSC低剂量组、TSC中剂量组、塞来昔布量组之间无明显差异(P>0.05),但TSC高剂量组明显低于TSC低、中剂量组及塞来昔布组;caspase-9 m RNA表达,TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组之间有明显差异(P<0.05),TSC高剂量组与塞来昔布组比较无明显差异(P>0.05)。(3)干预6周后,各组软骨组织内p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达:p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05);TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组及塞来昔布组明显低于模型对照组,其中尤以TSC高剂量组最低(P<0.05);随着TSC浓度的不断增加,p-ERK-1、p-ERK-2蛋白表达均逐渐减低,而且各组之间均有明显不同(P<0.05);p-P38蛋白表达,TSC中剂量组和TSC低剂量组无明显差异(P>0.05),TSC高剂量组显低于TSC中剂量组(P<0.05)。2、TSC对IL-1β作用下软骨细胞凋亡及MAPKs信号通路影响的离体实验(1)第一代、第二代、第三代软骨细胞生长良好,原代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后,软骨细胞呈异染性。(2)MTT法筛选TSC对IL-1β作用下兔第3代软骨细胞干预的最佳浓度为200μg/m L,最佳干预时间为72小时。(3)各组软骨细胞凋亡率:IL-1β组明显高于空白组软骨细胞凋亡率(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)。(4)各组第三代软骨细胞干预72小时后Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达:Bcl-2 m RNA表达,IL-1β组明显低于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显高于IL-1β组(P<0.05);Bax、Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达,IL-1β组明显高于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)。(5)各组第3代软骨细胞干预72小时后p-ERK-1、p-ERK-2、p-P38蛋白表达:IL-1β组明显均高于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)结论:1、体内外研究表明,上游IL-1β/MAPKs信号通路的高度活化,下游Caspase-3、Caspase-9的高表达,促凋亡因子Bax的高表达、抗凋亡因子Bcl-2的低表达,是OA的发生发展、软骨细胞凋亡的可能机制之一。2、体内外研究表明,TSC可以延缓软骨组织退变,抑制软骨细胞凋亡,并对其上游IL-1β/MAPKs通路,下游Caspase-3、Caspase-9表达及凋亡调控因子Bcl-2、bax的表达进行有效调控,这可能是TSC防治OA、抑制软骨细胞凋亡的机制之一,TSC的调控效果与TSC浓度有一定的关系。3、体内研究表明,高剂量TSC在抑制IL-1β/MAPKs信号通路的激活、上调Bcl-2的表达及下调Caspase-3的表达方面优于塞来昔布,而在下调Bax及Caspase-9表达方面与塞来昔布相当。
俞喆[3]2014年在《加减右归饮对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡及其调控基因Bax、Bcl-2表达的影响》文中研究表明目的：建立兔膝骨性关节炎模型，观察加减右归饮对该模型软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax相关基因表达的影响，进而探讨中药制剂加减右归饮治疗膝骨性关节炎的机制。方法：选择48只日本大耳兔随机分为4组，A组为正常对照组，B组为模型对照组，C组为治疗对照组（塞来昔布），D组为加减右归饮组，每组12只。B、C、D组经医用高分子材料固定兔左后膝于伸直位4周，建立膝骨性关节炎动物模型，确定造模成功后第一天起开始给药。A组喂标准饲料；B组喂标准饲料；C组喂含塞来昔布饲料（按75mg/只/d混于标准饲料中）；D组喂含加减右归饮饲料（含加减右归饮超细粉末120g/只/d混于标准饲料中）。于造模后六周耳缘静脉空气栓塞法处死全部实验兔子，取下左后膝骨关节软骨（为了减少人为导致的差异，所有标本都取自股骨髁的关节软骨），对其进行大体观察、光镜电镜分析、软骨细胞凋亡及调控基因Bax、Bcl-2表达的检测。结果：实验结果表明C组、D组均在抑制软骨细胞凋亡的趋势上起了一定程度的作用，在抑制促进细胞凋亡基因Bax的表达和促进细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达方面均优于B组，D组和C组之间有着显著的差异。结论：（1）加减右归饮对维持兔膝软骨的形态完整有一定的作用，从而能够有效地抑制骨性关节炎的加重；（2）加减右归饮可以明显降低兔膝骨性关节炎关节软骨细胞的凋亡率，进而起到保护关节软骨细胞，延缓疾病发生发展的作用；（3）加减右归饮在兔膝骨性关节炎的软骨细胞凋亡过程中干预了某些基因途径：①可能促进对跨膜bax有抑制作用的基因的表达，以达到抑制bax表达的目的，从而抑制软骨细胞的凋亡；②通过促进bcl-2相关抗凋亡基因的表达，可能协同增加bcl-2的表达，从另一个途径抑制软骨细胞的凋亡。研究中发现这与塞来昔布干预软骨细胞凋亡的基因途径有着明显的差异。
胡鹏飞[4]2017年在《芍药苷在骨性关节炎中的作用及其机制研究》文中研究表明骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以软骨细胞凋亡、软骨基质破坏、软骨下骨骨化、骨赘形成及滑膜炎症反应为特征的综合性慢性疾病,好发于中老年人,给我国的医疗及经济带来巨大负担。骨关节炎的具体发病机制尚未完全阐明,目前认为软骨基质合成和降解的平衡失调,导致软骨基质破坏是关节退化的主要原因。早期的治疗主要包括口服非甾体类消炎药及关节腔注射透明质酸及激素,但这些手段只能缓解疼痛,病情易反复,并容易带来消化系统及心血管系统的副作用。芍药苷(Paeoniflorin,PF)是从中药白芍总苷中提取的单萜类糖苷化合物,来源于芍药科植物芍药根、牡丹根、紫牡丹根。由于其中药单体成分明确,近年来国内外大量学者对其药理药效作用进行了广泛的研究,发现其具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、抗自由基氧化损伤、解热解痉等作用。在胶原诱导的关节炎模型中,PF能下调炎性因子如白介素1、6、17及肿瘤坏死因子的表达,并上调抗炎因子TGF-β的水平,从而对RA起到治疗作用。在脊柱退变模型的实验中,研究者发现口饲一定剂量的芍药苷能降低大鼠髓核细胞中Bax的含量,同时下调相关凋亡因子的表达,从而抑制髓核细胞的凋亡,对脊柱退行性改变起到保护作用。目前基于芍药苷与软骨细胞的研究探索比较少,我们想通过本研究,明确芍药苷在骨性关节炎病理过程中,是否可以抑制软骨细胞凋亡及软骨基质破坏,从而发挥关节保护作用。本研究主要分三部分:一、首先通过体外培养大鼠软骨细胞,加入不同浓度的PF干预后,用白介素-1β进行刺激,检测软骨细胞中MMPs、TIMP-1基因及蛋白表达的差异,并进一步通过分析检测NF-κB通路的相关蛋白表达水平来明确PF作用机制。我们的研究表明一定浓度的PF能抑制IL-1β介导的MMPs分泌,并上调TIMP-1的表达,从而拮抗IL-1β介导的软骨降解,并且该作用通过部分抑制NF-κB通路得以实现。二、在体外培养的软骨细胞中,观察PF对IL-1β介导的软骨细胞凋亡的影响。通过PF干预后,检测软骨细胞凋亡率、凋亡相关调节基因表达。我们发现PF能上调Bcl-2家族表达并抑制Bax表达,抑制Caspase-3活性,从而拮抗IL-1β介导的软骨细胞凋亡。三、观察在ACLT动物模型中,关节腔注射PF对关节软骨的作用。结果发现一定浓度的PF可减轻关节软骨损伤。我们的研究结果表明,PF很可能通过发挥抗炎及抗凋亡作用从而对关节软骨起到保护作用。第一部分PF对大鼠软骨细胞中MMPs/TIMP-1表达的影响目的:观察PF对IL-1β介导软骨细胞MMPs/TIMP-1表达的影响及其分子机制。方法:取4周龄SD大鼠膝关节软骨组织,用酶消化法行体外培养,传代至3代稳定后,MTT法检测不同浓度PF对软骨细胞活性影响,选取合适浓度范围的PF用于后续实验。加入不同浓度的PF预处理3小时,之后再加入IL-1β 1Ong/ml培养24小时,用实时定量PCR法检测MMP-1,MMP-3,MMP-13及TIMP-1的基因表达,western blot检测MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP-1、核转录因子p65亚基和转录抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B,IκB-α)的蛋白表达。结果:PF能抑制IL-1β介导的MMPs基因及蛋白表达,并上调软骨细胞中的TIMP-1水平。同时PF能抑制IL-1β介导的IκB-α降解和NF-κB磷酸化。结论:PF可通过抑制NF-κB信号通路拮抗IL-1β介导的MMPs基因及蛋白表达,并上调TIMP-1水平。第二部分PF对IL-1β介导的大鼠软骨细胞凋亡的影响目的:观察PF对IL-1β介导的大鼠软骨细胞凋亡的影响及其分子机制探讨。方法:体外培养SD大鼠软骨细胞,待细胞活性稳定后,用不同浓度PF预处理3小时,之后加入IL-1β1Ong/ml培养24小时,通过乳酸脱氢酶活性检测及流式细胞检测明确PF对软骨细胞凋亡的作用,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性,实时定量PCR法检测Bcl-2及Bax基因表达,Western blot检测Bcl-2,Bax,总Akt和磷酸化Akt的蛋白表达。结果:PF能通过上调Akt磷酸化,拮抗IL-1β介导的LDH释放及抑制软骨细胞的凋亡,并上调Bcl-2表达,抑制Bax表达及Caspase-3活性。结论:PF能抑制IL-1β介导的LDH释放,透过流式细胞技术PF能拮抗IL-1β介导的软骨细胞凋亡。进一步的分析表明PF能通过上调Bcl-2基因及蛋白表达,并下调Bax水平,同时降低Caspase-3的活性来发挥凋亡作用。该作用与Akt通路密切相关。第三部分PF对兔OA模型的保护作用目的:通过建立动物模型进一步观察验证PF对骨关节炎的保护作用。方法:32只新西兰兔均分为正常组、空白组、低剂量PF组及高剂量PF组。后三组共24只行单侧前交叉韧带离断法制作OA模型。建模4周后,分别予0.3mlDMSO、0.3ml低剂量PF(25μM 及0.3ml高剂量PF(50μM)注射,每周一次,持续5周。末次注射后1周取膝关节组织,进行实时定量PCR及组织学制片。结果:PF显著抑制关节软骨退变时MMP-1,MMP-3和MMP-13的基因表达,并上调软骨细胞中的TIMP-1水平。组织学评分及番红染色提示PF能够抑制关节软骨中蛋白聚糖丢失。结论:动物模型实验中PF能下调降解因子的表达,对关节软骨起保护作用。
熊勇[5]2010年在《艾灸对膝骨性关节炎的防治作用及其机理的实验研究》文中研究指明目的艾灸作为中医的外治法之一,具有操作简便,无痛苦、疗效明显的优点,在临床上治疗膝关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)有较好的疗效,是极具特色的中医治未病疗法之一。但是艾灸治疗膝0A的作用机理仍不十分明确,尤其是对0A的预防作用研究尚未见报道。因此,本课题在现代科学的方法论指导下,利用现代医学先进的实验技术方法,采用膝关节改良伸直位固定法建立兔膝0A模型,运用艾灸对正在进行造模的兔施以温和灸治,在造模8周后,对软骨标本行组织形态学观察,检测关节液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子·-α(TNF-α)的含量,测定软骨细胞凋亡率,观察软骨细胞Bc1-2、Bax和P53蛋白表达,检测关节软骨中Bc 1-2和Fas的mRNA表达,从组织、细胞、分子等不同层面,探讨艾灸对兔膝0A的防治作用和机理,为临床艾灸防治0A提供实验依据。方法40只日本大耳白兔,随机分成4组，每组10只：艾灸组(A组)、几丁糖组(B组)、模型组(C组)和正常组(D组)。A、B、C组均用改良伸直位固定法建立膝0A模型,A、B组在造模后立即进行干预,‘A组选取关元、足三里、血海、内外膝眼、阳陵泉等腧穴,用艾条温和灸治，每天1次,每次每穴10min；B组用医用几丁糖(20mg/ml)予以膝关节注射,0.2ml/次,每周1次；C组不做治疗,D组正常饲养，不做任何处理。造模8周后,各组分别从影像学、肉眼、光镜下、透射电镜(TEM)下观察兔膝关节组织形态学情况,并用Mankin评分比较各组膝关节软骨的组织形态学改变；用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组关节液中IL-1β和TNF-α的含量；TdT介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测各组软骨细胞凋亡指数(AI)；免疫组织化学法(I HC)观察Bc 1-2、Bax、P53蛋白表达情况；荧光实时定量PCR法(Real-Time PCR)检测各组关节软骨中Bc1-2和Fas的mRNA表达情况。结果1.X片观察：A、B组关节间隙正常,未见骨赘生成,C组可见膝关节间隙狭窄,局部有骨赘形成；大体肉眼观察：A、B组关节软骨表面光滑,无软骨缺损,C组关节囊明显增厚,关节软骨呈灰黄色,局部出现溃疡；光镜观察：A组软骨表面光滑,深层细胞排列规律,番红0染色轻度减弱,潮线完整,C组软骨产生裂隙,深达辐射区,深层细胞数目异常,番红0染色中、重度减弱,潮线模糊；Mankin评分：A、B组评分均明显较C组低(P<0.01),A组评分稍低于B组(P>0.05)；电镜观察：A组软骨细胞超微结构接近D组,C组软骨细胞轮廓不清楚,胞膜坏死崩解,胞浆内细胞器消失,细胞裂解为致密颗粒样物质,细胞固缩、变形,甚至出现核分裂,染色质浓聚。2.A、B组IL-1β和TNF-α含量均明显低于C组(P<0.01)；A组IL-1β含量和TNF-α含量比B组稍低(P>0.05)。3.A、B组凋亡阳性细胞较少,散在分布于关节软骨浅表区,C组凋亡阳性细胞较多,出现在关节软骨中深层。A、B组凋亡指数明显低于C组(P<0.01)；A组凋亡指数较B组低(P<0.05)。4.Bc 1-2表达阳性细胞率：A、B组高于C组(P<0.05),A组稍高于B组(P>0.05)；Bax表达阳性细胞率：A、B组明显低于C组(P<0.05),A组低于B组(P<0.05)；Bc1-2/Bax：A组高于B、C、D组(P<0.05)。P53表达阳性细胞率：A、B组明显低于C组(P<0.01),A组比B组稍低(P>0.05)。5.Bcl-2 mRNA的相对表达量：A、B、C组分别为D组的1.38±0.96倍、1.27±1.15倍、1.08±0.89倍,A、B组和C组Bc卜2的mRNA表达差别均有非常显著意义(P<0.01),A组和B组差别无显著意义(P>0.05)；Fas mRNA的相对表达量,A、B、C组分别为D组的0.27±0.07倍、0.31±1.13倍、2.32±1.35倍,A、B组和C组Fa s的mRNA表达差别均有非常显著意义(P<0.01),A组和B组差别无显著意义(P>0.05)。结论1.用改良伸直位固定法造模8周,可成功建立兔膝0A模型。2.艾灸关元、血海、内外膝眼、足三里和阳陵泉等腧穴,能防治兔膝0A。3.艾灸可降低关节液中IL-1β和TNF-α含量,上调Bcl-2 mRNA表达,下调Fas mRNA表达,促进Bc 1-2蛋白表达,抑制Bax和P53蛋白表达,防止软骨基质降解和抑制软骨细胞过度凋亡,从而达到防治兔膝0A的效果。4.几丁糖可保护关节软骨防治兔膝0A。
任莎莎, 李雪萍[6]2014年在《物理治疗对骨性关节炎软骨细胞凋亡影响的研究进展》文中研究表明骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种主要累及负重关节(髋、膝关节),以关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性、退行性关节疾病。其病因和发病机制尚未完全明确,病理表现主要为软骨细胞和基质出现变形,伴有生化、分子水平、生物力学等改变,最终导致关节软骨的软化、纤维化、溃疡形成和缺失,软骨下骨硬化、骨赘及软骨下囊肿形成,造成关节的不可逆性损害。临床表现主要为关节红肿疼痛、无
袁海鹰[7]2007年在《鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞金属蛋白酶mRNA表达的影响》文中研究说明目的探索鹿茸多肽治疗骨性关节炎有效作用机制。方法取新西兰大白兔8只，随机分成两组，每组4只，实验组建立Hulth骨性关节炎模型，对照组仅行双侧膝关节切开术。8周后，处死动物，选用兔膝关节骨性关节炎软骨为试验标本，以正常新西兰大白兔膝关节软骨为正常对照组，通过进行相应的理化处理，分离并培养骨性关节炎软骨细胞及正常软骨细胞。以鹿茸多肽为试验药，法滋隆为阳性对照药。分别进行软骨细胞细胞生长曲线的测定，MTT法检测鹿茸多肽对软骨细胞增殖的影响、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨细胞分泌到细胞外基质中的金属蛋白酶含量及琼脂糖电泳检测通过逆转录多聚酶链反应法获取鹿茸多肽作用前后软骨细胞核酸中金属蛋白酶表达情况。结果骨性关节炎软骨细胞细胞周期较正常软骨细胞细胞周期短；鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞具有促进增殖作用；骨性节炎软骨细胞直接分泌到胞外的金属蛋白酶含量变化不明显；骨性关节炎软骨细胞核酸中金属蛋白酶出现高表达。结论骨性关节炎软骨细胞在骨性关节炎发病过程中，软骨细胞正常分化及增殖发生改变；骨性关节炎软骨基质降解过程可能是金属蛋白酶与其它因子协同作用的结果；鹿茸多肽可促进骨性关节炎软骨细胞增殖，并可抑制骨性关节炎软骨细胞中金属蛋白酶的过度表达，可能对治疗骨性关节炎有较好的作用。
高航飞[8]2011年在《在骨性关节炎发病中AQP-1表达量的变化与软骨细胞凋亡的相关性研究》文中研究说明目的水通道蛋白(aquaporins,AQP)表达量的变化可能与细胞凋亡相关。但在骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的发病过程中,AQP-1的表达变化是否与软骨细胞凋亡相关并无相关报道,本实验通过观察软骨组织中水通道蛋白-1 (aquaporins-1, AQP-1)和凋亡关键蛋白酶——半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)基因的表达及Caspase-3蛋白酶活性的变化,探讨AQP-1的表达与软骨细胞凋亡的相关性,为进一步研究骨性关节炎的发病机制提供实验依据。方法取8周龄清洁级雄性SD大鼠72只,体重286～320 g,平均300 g;随机分为手术组、假手术组和对照组,每组24只。手术组采用切断前交叉韧带及内侧副韧带、部分切除内侧半月板的方法制备大鼠双膝OA模型;假手术组仅暴露膝关节腔用碘伏生理盐水冲洗后即行缝合;对照组不作任何处理。造模后观察大鼠一般情况,分别于1、2、4、8周时处死大鼠取其膝关节标本行大体、组织学观察;采用实时荧光定量PCR检测AQP-1和Caspase-3 mRNA的表达情况;使用酶标仪检测Caspase-3蛋白酶活性。并对AQP-1 mRNA与Caspase-3 mRNA的表达及蛋白酶活性变化行Pearson相关性分析和回归分析。结果术后共6只大鼠死亡,均给予补充;其余大鼠均存活至实验完成。各时间点对照组及假手术组膝关节软骨外观及结构均正常;随时间延长手术组软骨表面粗糙且有裂隙,可见大量赘生物,软骨表层纤维化,细胞排列紊乱。参照Mankin评分标准,造模1周时各组评分比较,差异均无统计学意义(P > 0.05);2、4、8周时各组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。造模后1周,手术组AQP-1、Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3蛋白酶活性与假手术组及对照组比较,差异均无统计学意义(P >0.05);而2、4、8周时手术组以上指标均明显高于对照组和假手术组(P <0.05),且随时间延长呈增高趋势。AQP-1mRNA和Caspase-3 mRNA的表达成正相关(r=0.817,P<0.001),回归方程为y=0.4267x~2+0.0515 x(P<0.001);AQP-1 mRNA的表达和Caspase-3蛋白酶活性变化亦成正相关(r=0.945,P<0.001),回归方程为y=15.423x+4.3928 (P<0.001)。结论AQP-1的表达上调可能与软骨细胞的调亡相关,在OA发病过程中AQP-1的表达变化可能参与了OA的发生发展。
李恩[9]2016年在《加减右归饮对实验兔膝骨性关节炎软骨损伤及Fas、FasL、P53等凋亡基因表达的影响》文中研究说明目的:建立一种与人类膝骨关节炎相似的兔膝骨性关节炎模型,并在确定造模成功的基础上,对骨性关节炎模型进行药物干预,观察中药加减右归饮对实验兔膝骨性关节炎模型软骨损伤及Fas、Fas L、P53等凋亡基因表达的影响,进而为加减右归饮的临床应用提供理论支持。方法:实验动物及分组:选用普通日本大耳兔48只随机分成4组,每组12只:正常组、模型组、塞来昔布组、加减右归饮组。造模方法:分别将模型组、塞来昔布组和加减右归饮组实验兔左后膝于伸直位用医用高分子石膏固定4周,建立实验兔膝骨性关节炎动物模型。确定造模成功后第一天即行药物干预,各组实验兔按250g/只/日的饲料量饲养,以确保塞来昔布组和加减右归饮组实验兔每日的给药量。对各组实验兔分别行药物干预6周,其中正常组和模型组不给药,喂标准饲料;塞来昔布组所喂含饲料中按75mg:250g的药食比添加西药塞来昔布;加减右归饮组组所喂饲料按120g:250g的药食比混加减右归饮超细粉末。持续给药六周后以耳缘静脉空气栓塞法将各组实验兔全部处死,并以外科手术方式快速取下各组实验兔左后膝关节面软骨(为降低标本的差异性,所有软骨标本统一取自实验兔左膝关节股骨髁),对各组标本行肉眼大体观察、光镜分析和电镜分析,并以基因表达谱芯片技术对各组标本凋亡相关基因Fas、Fas L和P53的表达量进行检测分析。结果:经过药物干预后,无论在大体观察、光镜分析和电镜分析的结果,还是基因表达谱芯片检测结果,都显示加减右归饮组和塞来昔布组软骨标本均同模型组具有显著差异,但在对加减右归饮组和塞来昔布组进行形态学对比时,二者未表现出明显差异,基因表达谱芯片检测结果提示在中药加减右归饮和西药塞来昔布在抑制软骨细胞凋亡的路径上具有差异性。结论:(1)通过模型组标本与正常组的大体观察评分、光镜观察结果Mankin’s评分的对比,说明关节制动的造模方法成功的复制了兔膝骨关节炎模型;(2)大体观察、光镜观察和电镜观察相结合的方法,既可对各组软骨标本的凋亡进行定性,又通过评分结果的对比对其损伤程度进行了定量观察,弥补了各种观察方法对标本进行单项观察时的不足;(3)通过加减右归饮组同模型组的分别对比,无论是标本的大体观察评分对比,还是光镜观察结果Mankin’s评分对比,或是标本的电镜观察结果对比,均提示加减右归饮对兔膝骨关节炎的软骨退变具有良好的治疗作用;(4)对比加减右归饮组和塞来昔布组的大体观察评分、光镜观察结果Mankin’s评分及电镜观察结果,未发现显著差异,提示中药加减右归饮在治疗骨性关节炎时可以达到和塞来昔布相同的治疗效果;(5)本研究显示Fas、Fas L和P53等凋亡因子同膝关节骨性关节炎的病变水平密切相关,且在本组数据中呈正相关,相关凋亡因子的表达或同OA的发病机制有关,提示通过应用药物抑制相关凋亡因子的表达或对OA的防治有重要作用;(6)西药塞来昔布与中药加减右归饮均对软骨细胞相关促凋亡因子的表达表现出抑制作用,提示这两种药物在OA的治疗过程中具有重要作用,可在此基础上开展进一步的临床或基础研究,以期深入研究其调控机制。(7)在本组数据中,中药加减右归饮和西药塞来昔布在抑制软骨细胞凋亡的路径上具有差异性,或可对其进行深入研究以进一步揭示中药加减右归饮对骨性关节炎的干预机制。
褚建国[10]2017年在《雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠继发性骨关节炎的作用及机制研究》文中认为第一部分内侧半月板切除术导致豚鼠继发性骨关节炎模型的观察目的:探讨豚鼠内侧半月板切除(medial menisectomy,MNX)后关节炎的发生特点、软骨组织病理变化,来评价骨性关节模型的建立是否成功,为后期实验提供正确的使用模型。方法:1 3月龄雄性DH豚鼠24只,随机将动物分为2组(n=12):Sham组和MNX组,分别行假手术和内侧半月板切除术。2所有动物术后饲养12周处死,利用OARSI关节评分系统对关节退变情况进行评估,利用免疫组化技术对软骨组织中OA相关因子表达水平进行分析,利用Micro-CT技术对胫骨平台侧的软骨下骨进行扫描记录,分析内侧半月板切除术对软骨下骨的作用。结果:1两组动物体重随时间逐渐增长,各时间点两组间体重无显著差异;2 OARSI大体评分结果显示,MNX组评分高于Sham组(MNX组vs.Sham组,2.92±0.20 vs.0.83±0.52,P<0.05),差异具有统计学意义;3 MNX组动物术后关节退变严重,OARSI组织学评分显示MNX组总分及CS、PG、CL和OST子项评分均显著高于Sham组(P<0.05);4与Sham组相比,MNX动物的胫骨平台软骨负重区AGG表达水平显著下降(P<0.001),ADAMTS4(P<0.05)、Caspase3(P<0.001)和MMP13(P<0.05)的表达水平则显著增高。此外,AGG/ADAMTS4比值(P<0.05)和Col-II/MMP13比值(P<0.05)显著下降,而Col-II/AGG比值显著升高(P<0.05)。5 Micro-CT检测结果:MNX组可见关节边缘内侧缘性骨组织增生明显,胫骨上端下骨小梁显著减少。与Sham组相比,MNX组动物胫骨平台软骨下骨BMD显著降低(P<0.05),BV/TV、Tb.Th显著降低(P<0.05),Tb.Sp和SMI显著增加(P<0.05)。第二部分雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠关节炎的作用目的:Dunkin-Hartley(DH)豚鼠内侧半月板切除(MNX)导致继发性骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型后,早期应用雷奈酸锶(strontium ranelate,SR),探讨SR对MNX豚鼠关节炎的作用。方法:1 3月龄DH雄性豚鼠36只,随机分为三组,每组各12只:MNX+NS组、MNX+CLX组和MNX+SR组,每组再随机分成2个亚组(n=6),一亚组用于大体观察,另一亚组用于组织学观察,适应性饲养1周后对各组进行右膝关节内侧半月板切除术。2术后一周开始给药,MNX+SR组给予SR 625mg/kg/d灌胃,MNX+CLX组给予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS组给予等量生理盐水灌胃。3给药12周后,处死动物并解剖右膝关节。通过肉眼观察胫骨平台和股骨髁的颜色、平滑度、滑液性状和关节表面磨损情况。应用OARSI进行关节大体评分。制备标本切片,进行甲苯胺蓝染色,依据OARSI组织学评分系统对内侧胫骨平台损伤情况及骨赘情况进行评分。结果:1 DH豚鼠随着年龄的增长体重也逐渐增加。12周时MNX+NS组、CLX组和MNX+SR组体重无显著差异,说明SR给药对豚鼠的生长和发育没有显着影响,不影响体重。2软骨的OARSI大体评分:造模术后内侧胫骨平台关节软骨出现了明显的磨损,胫骨内侧平台软骨表面变得粗糙,在软骨的内侧边缘形成裂隙并有软骨增生。给予CLX或SR的豚鼠术侧OARSI大体评分均值较MNX+NS组略有降低,但均未见显著差异。3软骨组织学观察结果:各组软骨均发生严重退变,负重区软骨严重受损,表现为软骨缺失、甲苯胺蓝染色减弱、形成细胞集群、潮线连续中断、关节内侧边缘有骨赘形成。OARSI组织学评分结果显示:MNX+CLX组的总评分均显著低于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,10.78±1.91vs.17.36±1.92,P<0.05),而MNX+SR组总评分与MNX+NS组相比未见显著差异。软骨厚度测量结果显示,MNX+CLX组动物软骨厚度显著高于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,360.19±38.93μmvs.264.73±58.01μm,P<0.05),而MNX+SR组软骨厚度与MNX+NS组相比未见显著差异。此外,MNX+SR组骨赘高度显著高于MNX+NS组(MNX+SR组vs.MNX+NS组,198.18±48.31μmvs.106.86±57.11,P<0.05),MNX+CLX组骨赘高度略小于MNX+NS组,但未见统计学差异。4骨赘塌陷的观察:大体观察SR组中有5个样品有塌陷骨赘的表现,而MNX组仅有1个样本表现相同的外观,CLX组未见类似现象,这种变化在三组之间无显著差异。组织学观察SR组有2个样本发生塌陷,结合大体和组织学观察,SR组发生骨赘塌陷的标本为7个,而MNX组仅有1个,两组差异具有统计学意义。第三部分雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠关节炎的作用机制探讨目的:通过我们前部分的实验观察,SR并未能起到对关节炎的满意效果,发现其(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠软骨的退变,甚至SR的摄入导致关节炎骨赘的增生,甚至塌陷。因此,在本实验通过对SR治疗作用后的关节炎软骨及软骨下骨的进一步研究,来探讨产生这种现象的机制。方法:1 3月龄DH雄性豚鼠36只,随机分为三组,每组各12只:MNX+NS组、MNX+CLX组和MNX+SR组,每组再随机分成2个亚组(n=6),一亚组用于Micro-CT检测,另一亚组用于免疫组化检测,适应性饲养1周后对各组进行右膝关节内侧半月板切除术。2术后一周开始MNX+SR组给予SR 625mg/kg/day灌胃,MNX+CLX组给予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS组给予等量生理盐水灌胃。3给药12周后处死动物,解剖右膝关节,Micro-CT扫描检测胫骨平台软骨下骨,测定骨矿物质密度(BMD)、骨微结构指数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁分离度(Th.Sp)和结构结构模型指数SMI),各向异性程度(DA)来分析给予CLX和SR对内侧半月板切除后软骨下骨的影响。制备标本切片后,进行免疫组化检测,一抗分别为为:AGG(1:200),ADAMTS-4(1:200),Caspase-3(1:200),Col-II(1:50),和MMP-13(1:200)。结果:1免疫组化结果:三组间AGG、Col-II、Caspase3和MMP13在内侧胫骨平台负重区的表达结果未见显著差异,而MNX+CLX组的ADAMTS4在术侧内侧胫骨平台负重区的表达水平显著低于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,5243.96±2507.38 vs.11153.19±1958.72,P<0.05)。此外,内侧胫骨平台负重区AGG/ADAMTS4表达水平的比值在MNX+CLX组显著高于MNX+NS组(MNX+CLX组vs.MNX+NS组,1.28±0.63 vs.0.45±0.14,P<0.05),而Col-II/MMP13和Col-II/AGG两项指标在三组间未见差异。2内侧胫骨平台软骨下骨形态分析:CLX对软骨下骨未造成显著影响,而SR则显著增强MNX豚鼠内侧胫骨平台负重区软骨下骨BMD,并且显著改善了BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI等形态学参数。结论:1通过切除DH豚鼠右侧膝关节内侧半月板诱发关节退变,主要表现为关节软骨丢失、骨赘形成,软骨基质中以及软骨细胞表达蛋白多糖显著减少,软骨组织中基质成分与基质降解酶类比例失调,软骨细胞表达凋亡相关因子caspase-3增多,与典型的骨关节炎表现类似。同时,DH豚鼠术侧膝关节内侧胫骨平台负重区软骨下骨有明显的骨量丢失,这一表现符合早期骨关节炎软骨下骨的表现。因此,DH豚鼠MNX模型是一种早期骨关节炎模型。2在SR的作用下DH豚鼠MNX模型术侧膝关节内侧胫骨平台负重区软骨下骨的骨密度显著提高,MNX导致的软骨下骨形态改变被显著抑制,但是未观察到SR对MNX导致的关节退变有延缓作用,而目前临床指南推荐用药——塞来昔布表现出对关节退变有一定程度延缓作用。3雷奈酸锶(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠软骨的退变,这种结果产生的原因可能是由于SR未能抑制ADAMT4及MMP3的活性、进而未能阻止细胞外基质AGG降解,并且SR未能抑制软骨细胞凋亡的发生以及软骨下骨显著硬化也是SR在本实验中未能对OA软骨起到保护作用的原因。SR的摄入导致骨赘增生,甚至塌陷,这可能与钙化骨赘吸收并促进其增殖的能力有关。未来当骨关节炎进行雷奈酸锶的研究时,这种不利影响应予以重视,因为这可能会掩盖它的治疗效果。
参考文献：
[1]. 骨性关节炎软骨细胞凋亡的研究[J]. 马钢, 任明姬. 中国组织化学与细胞化学杂志. 2012
[2]. 基于IL-1β/MAPKs通路探讨威灵仙总皂苷对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响[D]. 赵宝祥. 湖北中医药大学. 2016
[3]. 加减右归饮对兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡及其调控基因Bax、Bcl-2表达的影响[D]. 俞喆. 云南中医学院. 2014
[4]. 芍药苷在骨性关节炎中的作用及其机制研究[D]. 胡鹏飞. 浙江大学. 2017
[5]. 艾灸对膝骨性关节炎的防治作用及其机理的实验研究[D]. 熊勇. 湖北中医药大学. 2010
[6]. 物理治疗对骨性关节炎软骨细胞凋亡影响的研究进展[J]. 任莎莎, 李雪萍. 中国康复医学杂志. 2014
[7]. 鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞金属蛋白酶mRNA表达的影响[D]. 袁海鹰. 长春中医药大学. 2007
[8]. 在骨性关节炎发病中AQP-1表达量的变化与软骨细胞凋亡的相关性研究[D]. 高航飞. 南京医科大学. 2011
[9]. 加减右归饮对实验兔膝骨性关节炎软骨损伤及Fas、FasL、P53等凋亡基因表达的影响[D]. 李恩. 云南中医学院. 2016
[10]. 雷奈酸锶对内侧半月板切除术诱导豚鼠继发性骨关节炎的作用及机制研究[D]. 褚建国. 河北医科大学. 2017
标签：外科学论文; 细胞凋亡论文; 膝关节软骨磨损论文; 膝关节骨性关节炎论文; 关节软骨论文; 骨关节疾病论文; 膝关节论文;