李义平[1]2004年在《传染性法氏囊病病毒对CEF细胞某些基因表达的影响和传染性喉气管炎病毒的重组》文中认为本论文包括叁个部分：1)传染性法氏囊病病毒(IBDV)对鸡成纤维细胞(CEF)某些基因表达的影响和病毒在法氏囊与粪便中的定量研究；2)传染性喉气管炎病毒(ILTV)的重组；3)新城疫病毒(NDV)的分型研究。 第一部分： 本实验用IBDV感染鸡成纤维细胞(CEF)，采用定量实时RT-PCR选检出一个在IBDV感染过程中稳定表达的基因，并以此作为内参基因，用于测定CEF细胞中其它基因表达变化以及病毒在感染鸡的法氏囊和粪便中的定量研究。 用IBDV感染CEF细胞，在7天的感染时间中选择了十二个基因进行检测，这些基因编码：β-actin，28S rRNA，18S rRNA，GAPDH，β-2-microglobulin，TBP，PRKG1，IL-13Ra，DDX1，UBC，Ovotransferrin和G6PDH。实验结果表明，β-actin，28S rRNA，18S rRNA和GAPDH基因在感染期间是稳定表达的，β-actin基因是中丰度表达基因，而且在定量和非定量分析(定量和非定量RNA用于反转录)中没有统计学意义上的不同。因此，β-actin基因是研究感染IBDV的CEF细胞中基因表达和病毒载量的最佳内参基因。同时讨论了这些基因在实验感染过程中的具体变化。 用β-actin作为实时定量RT-PCR的内参基因，以SYBR green染料方法定量研究IBDV感染的CEF细胞中某些基因的表达。在7天的感染时间中，STAT 3，MIP-3α，IL-8，IFN 1-2启动子，2，5-寡腺苷合成酶A，MHC类型1，MHC类型2，IRF-1和TVB受体基因表达上调高于10倍；凋亡抑制子1，IFNAR1，ALVRl，α-2，3-硅基转移酶，IL-6的基因表达上调低于10倍；NFκB p65，BLRcp38，IFNAR2基因的表达恒定；TRAIL样基因的表达下调。所有上调的基因都表现为感染病毒滴度依赖型，用高滴度病毒感染的CEF细胞组中，基因表达上调的时间明显早于用低滴度病毒感染的细胞组。结合实验结果，还对这些基因在宿主抗病毒反应中的可能作用与宿主对病毒感染的反应路径进行了讨论，细胞对IBDV感染的反应是IFN路径。 应用SYBR green的定量实时RT-PCR方法检测感染IBDV的鸡的法氏囊和粪便中的病毒载量(相对于β-actin)。实验鸡分别感染IBDV疫苗株D78，vvIBDV丹麦株和经典株F52／70。除了D78以外，vvIBDV和F52／70都可在感染后第1天的法氏囊和第2天的粪便中被检测出。vvIBDV和F52／70在感染后第2，3天的法氏囊中有较高的量(相对于第1天)，在第3天的粪便中有较高的量。D78在接种第4天和第8天的法氏囊中有较高的量，但只在一只鸡的粪便中被检测出。本实验所建立的应用SYBR green的定量方法在定量法氏囊中的IBDV是实用的。 实验建立了Taqman检测系统，并用于定量研究疫苗株D78和vvIBDV，D78和F52／70在感染鸡法氏囊中的相对量的关系。实验设计了一对IBDV引物和叁个分别针对IBDV叁种类型(疫苗株，经典株和vvIBDV)的探针，同时设计β-actin基因特异性引物和探针。叁个IBDV探针可分别区分叁种不同类型的IBDV，可在一个PCR反应管中同时实现对相应毒株的检测和定量分析。在用D78免疫两天后用vvIBDV攻毒的鸡中。D78与vvIBDV成反向关系，D78量多的法氏囊中，中国农业大学博_l:学位论文vvlBOV的量就少，而078量少的法氏囊中，。IBOV量就多。在用078免疫21天后再用。IBDV或F52/70攻毒的鸡的法氏囊中，不能检测出wlBDV和F52nO，只在一些鸡中检测出D78。此方法可应用于IBDV的分型，也可以对同一组织中不同类型的IBDv进行定量研究。实验结果对IBDV的致病性和IBDV与宿主相互作用研究提供了重要的参考信息。第二部分: 实验克隆了中国ILTv EZ株的带侧翼序列的TK基因，得到质粒pCRT-FTK，并进行序列分析。然后用Acc川和、恤n91I删除TK基因内部677 bp的序列。在此删除位点分别插入CMV-GFp一polyA不11 SV40一GFp一polyA表达盒分别得到质粒pFTK一SG和pFTK一SG。将新城疫融合基因(F)分别插入到质粒pFTK一CG和pFTK一sG中的GFP的上游，与GFP构成融合表达框，得到质粒pFTK一FG和pFTK一sFG。另外，构建TK缺失的不带外源基因的重组质粒pFTKO.用质粒pFTK一Cq pFTK一sq pFTK一FG和PFTK一sFG与ILTv基因组DNA共转染LMH细胞和鸡原代肝细胞，用荧光显微镜检测带荧光的ILTV重组子。病毒重组子在鸡原代肝细胞中传第二代时，还可见到荧光，说明带GFP和F一GFP的重组ILTV在转染时己经产生。发现CMV启动子比SV40启动子有更强的启动效率。重组子的纯化与性质测定有待进一步鉴定。第叁部分: 应用RT一PCR结合探针杂交的方法对新城疫病毒(NDV)进行分型。先用感染NDV的鸡胚尿囊液建立实验方法，再用感染鸡的组织进行该方法的应用效能检测。VC22是毒力株特异探针，NC22是非毒力株特异探针。用地高辛(DIG)标记探针3’端，在尼龙膜上与NDV RT‘PCR产物进行斑点杂交。两个探针能很好的区分来自感染鸡胚尿囊液的NDV，并可区分感染组织中的NDV强弱毒。对各毒株的杂交检侧结果与脑内致病指数(I CPI)判定的强弱毒结果相一致，整个检测过程可在1天内完成。实验对两个探针的特异性和Nc22的灵敏度进行测试，Nc22能检测到将1价，EIO州ml的La sota毒株稀释到1了稀释度或800fg的病毒RNA。本系统在临床样品的检测上有一定的应用价值.
胡文玮[2]2008年在《表达禽流感病毒HA、NA基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建》文中提出鸡痘病毒（Fowlpox virus，FPV）是重要的动物病毒表达载体，在疾病的控制中起到了重要的作用，以鸡痘病毒为载体已经研制出许多种重组病毒疫苗，其中有的已经商业化。构建表达多个病原体基因的重组鸡痘载体疫苗对于面临多种疾病威胁的养禽业来说尤其具有重要的意义。禽流感(Avian influenza，AI)、传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）和鸡痘（Fowlpox）是均能引起感染禽呼吸道疾病，给养禽业造成了严重的经济损失。目前传统方法制备的疫苗对防制这些疾病起到了有效的作用。但常规疫苗的使用存在一些难以克服的缺陷，如影响疫情监测、生产成本高等，需要能够区分野毒感染的、生产成本高的新型疫苗来替代常规疫苗。本试验分别将H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）的HA和NA基因、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）的gB基因插入到鸡痘病毒转移载体早晚期启动子LP2EP2之下，构建同时含有HA、NA和gB基因以及报告基因LacZ（晚期启动子P11控制之下）鸡痘病毒转移载体。利用脂质体转染技术将转移载体导入到事先感染鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞中，经过6轮蓝斑纯化获得了包含了AIV的HA和NA基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒，称为rFPV-HA/NA/gB。PCR检测证明，rFPV-HA/NA/gB基因组中含有完整的AIV的HA、NA基因和ILTV的gB基因；间接免疫荧光试验和Western-blot试验证明，AIV的HA、NA蛋白和ILTV的gB蛋白在rFPV-HA/NA/gB感染的CEF细胞中均能获得表达。
杨明凡[3]2008年在《表达鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与鸡IL-2基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力研究》文中研究表明鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病,本病给养鸡业造成较大的经济损失。目前主要应用致弱的喉气管炎病毒作为弱毒疫苗,但是由于鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗株也能引起潜伏感染,并在鸡群与鸡群之间传播过程中毒力会返强,从而成为新的感染源,因此,研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。本文将ILTV河南长葛株的gD基因与鸡IL-2基因重组禽痘病毒转移载体,得到一株重组病毒。试验研究主要从以下几个方面展开:1.ILTV河南长葛株分离鉴定及其gB、gC和gD基因的克隆与序列分析鸡胚尿囊膜接种和琼脂扩散试验对分离病毒进行鉴定,结果表明所分离病毒为ILTV,从而获得一株ILTV河南长葛株。并分别克隆其gB、gC和gD基因,测定其核苷酸序列,将其核苷酸与GenBank公布的ILTV相应序列进行分析和同源性比较,结果长葛分离株ILTV的gB、gC和gD基因3个序列分别与GenBank登录的ILTV gB、gC和gD基因序列存在很高的同源性,其同源性在99.7%～99.9%之间,说明ILTV的gB、gC和gD基因序列相对保守。2.ILTV长葛株gB、gC和gD基因真核表达载体的构建及其免疫效果研究将ILTV长葛株gB、gC和gD基因插入pcDNA3.1中,构建了真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC和pcDNA-gD。间接免疫荧光检测结果表明,叁种重组质粒均能够在PK-15细胞中表达。以SPF鸡为试验动物,肌内注射构建的pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和pcDNA3.1空载体进行免疫接种。微量血清中和试验检测结果显示,构建的真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和活疫苗均能够诱导机体产生较高的抗体水平;MTT法检测表明构建的真核表达载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD及活疫苗对照均能够诱导淋巴细胞增殖,同时也能够诱导强的CTL细胞的增殖。表明构建的载体pcDNA-gB、pcDNA-gC、pcDNA-gD和弱毒疫苗均能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。3.ILTV长葛株gD基因的表达及间接ELISA检测方法的初步建立将ILTV gD基因插入到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET28-gD。将pET28-gD转化到宿主表达菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达目的蛋白大小为55ku,Western-blotting表明表达产物具有良好的免疫原性。表达的蛋白产物经纯化后作为ELISA包被抗原,初步建立了间接ELISA诊断方法,并确定了抗原最佳包被浓度为24.5μg·mL;最佳血清稀释度为1∶320,初步确定ELISA判定标准为OD_(450)≥0.25判为阳性,小于0.25为阴性。试验证明建立的间接ELISA具有很强的特异性和较高的敏感性且与多种病毒抗原无交叉反应。用初步建立的ELISA和微量血清中和试验检测临床送检的84份血清样品。结果两种方法的阳性符合率为96.5%(28/29),阴性符合率为98.2%(55/56),表明建立的方法可用于临床上ILT的检测。4.表达ILTV长葛株gD基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验将ILTV长葛株gD基因同源重组到禽痘病毒基因组中,得到能高效表达ILTV gD基因的重组禽痘病毒(rFPV-ILTV-gD)。将rFPV-ILTV-gD和ILT弱毒疫苗同时免疫试验鸡,同时设非免疫对照鸡群。血清中和抗体检测结果表明:疫苗组与重组病毒组差异不显着(p＞0.05),而重组病毒组和疫苗组与空白对照组差异均显着(p＜0.05)。免疫42d攻毒试验表明,重组病毒组和疫苗组对ILTV强毒攻击的保护率均为96.67%,而空白对照组为6.67%。说明该重组病毒作为弱毒疫苗能够抵抗ILTV强毒的攻击,对免疫鸡群有较好的保护作用。5.ILTV河南长葛株gD基因与鸡IL-2串联重组禽痘病毒的构建及免疫效力试验将ILTV长葛株的gD基因与鸡IL-2串联到禽痘病毒表达载体中,转染后获得一株重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD,该重组病毒能够高效表达ILTV gD基因。将重组病毒rFPV-ILTV-gD、rFPV-IL2-ILTV-gD和ILT弱毒疫苗免疫试验动物;同时设空白对照。免疫后ELISA检测结果表明疫苗组与重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组、重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD与重组病毒rFPV-ILTV-gD抗体效价相比差异不显着(p＞0.05),而重组病毒组rFPV-IL2-ILTV-gD、重组病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗组与空白对照组抗体效价相比,差异均显着(p＜0.05)。免疫28d攻毒后每组鸡的发病情况表明重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组、重组病毒rFPV-ILTV-gD和疫苗组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96%、92%和96%,而空白对照组为8%。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD与商品弱毒疫苗的免疫效力相当,能够较好的保护免疫鸡群。
郭彩云[4]2012年在《鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87）国家参考品的研制》文中研究说明鸡传染性法氏囊病(Infectious of bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious of bursal disease virus, IBDV)引起的一种急性、高度传染性疾病。该病毒对雏鸡的淋巴组织尤其是法氏囊有很强的嗜性,通过攻击法氏囊内的B淋巴细胞而导致免疫抑制。因此该疾病的爆发会导致鸡群免疫失败和二次感染,对禽类养殖业危害极大,是家禽传染性疾病中危害最严重的疫病之一。在我国对该病的主要防治措施就是对鸡群进行疫苗免疫,而疫苗质量的好坏直接关乎免疫预防的成败。中等毒力活疫苗(B87株)一直作为国内生产使用最为广泛的鸡传染性法氏囊疫苗,但各厂家的疫苗质量参差不齐,疫苗质量不稳定,效力不均一,导致免疫效果也不一致。因此,急需相应的标准物质来使疫苗效力标准化,控制疫苗的质量,为鸡传染性法氏囊病的防控提供支持。在本研究中,通过对鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品候选物的层层筛选,选定一批后分装冻干,再对其特性值进行协作标定,建立了一套鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品的制备筛选方法,并最终制备得该参考品成品1000支。本研究,建立了检测鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品效力的细胞间接免疫荧光方法,通过判定细胞的半数感染量(TCIDso)来确定参考品的效力,并与传统的鸡胚半数致死量(ELDso)进行相关性分析,相关系数r=0.823。本研究中还建立了检测IBDV的荧光定量RT-PCR方法,来测定疫苗中的病毒载量。本研究中采用鸡胚半数致死量(ELD50)方法组织单位对效力值进行协作标定,统计分析处理定值原始数据,将各协作单位分析测定的不确定度引入鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)国家参考品的定值结果中,得到更准确的、具有置信范围的定值结果。
徐敬龙[5]2005年在《共表达NDVF、IBDV VP0基因重组鸡痘病毒生物学特性研究》文中研究指明将本室构建和筛选的共表达NDV F、IBDV VP0 基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)经不同的理化因素处理,接种到鸡胚成纤维细胞(CEF)上,观察处理前后重组鸡痘病毒vFV282 对CEF 的毒力和感染滴度,获得该病毒的部分理化学特性。通过鸡胚绒毛尿囊膜传代、CEF 传代和鸡体传代,检测回收毒的毒力、感染滴度,通过PCR 方法检测F、VP0 基因。本试验通过测定不同免疫途径和方法(一次刺种;刺种首免;首免后28d 二免;肌肉注射)和不同时间采血测抗FPV、NDV、IBDV 的中和抗体效价和ConA 刺激脾淋巴细胞反应的净增值,来分析重组鸡痘病毒vFV282 体液免疫和细胞免疫的消长规律和水平。以上结果为研究重组鸡痘病毒vFV282 免疫水平与免疫攻毒效力的平行关系,为建立效力检验方法和标准,为研究免疫期等奠定了坚实的基础。
田振宇[6]2006年在《通用探针实时荧光PCR检测禽病毒病方法的研究》文中提出禽病毒性疾病是威胁养禽业最严重的一类传染病,由于病毒对抗生素的不敏感性,在临床治疗上很难达到有效目的,因此免疫预防便成为预防和治疗的这一类疾病有效手段,疫情监督也就成为此措施的必要环节。尽早的发现病毒,并对该病毒的流行状况作出预测是预防病毒病7684关键,但近年来由于病毒性疾病多表现为亚临床症状,常规检测方法很难快速对其作出确诊,故现代化生产需要建立一种快速、准确、高效的检测方法。实时荧光PCR技术是一种新型的核酸检测技术,它从病毒的基因组着手对病毒进行检测,在临床诊断中已经用于细菌、病毒及遗传性疾病的检测,具有极大的应用价值。本研究根据荧光PCR检测原理,利用通用探针建立了病毒性疾病实时荧光PCR检测方法。这一个研究方法不但摒弃了SYBR Green I类荧光染料假阳性率高的弊端,而且具有快速、准确、高效的特性。本研究共分为叁部分:第一部分:新城疫病毒的分离和鉴定为了研究我国近年来病毒性疾病的流行情况,拟对本实验所涉及病毒做出分离和鉴定,但是由于时间有限,故只做了新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分离和鉴定工作。本部分采用鸡胚尿囊腔培养,血凝( Hemagglutination ,HA)和血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI),间接荧光抗体试验(IFA), RT - PCR/PCR试验和基因芯片试验对NDV进行了分离和鉴定。从全国七个省市的9个鸡场53只疑似患有新城疫病的鸡中,分离到28株NDV野毒株,结果说明NDV在我国普遍存在,而且呈现蔓延的趋势;同时试验结果说明基因芯片方法要优于其他叁种检测方法,具有高度的特异性和灵敏度。第二部分:通用探针实时荧光PCR检测禽病毒病方法的建立本部分首先构建含有NDV特定片段的质粒,以提取的质粒为模板
参考文献：
[1]. 传染性法氏囊病病毒对CEF细胞某些基因表达的影响和传染性喉气管炎病毒的重组[D]. 李义平. 中国农业大学. 2004
[2]. 表达禽流感病毒HA、NA基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒的构建[D]. 胡文玮. 中国农业科学院. 2008
[3]. 表达鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与鸡IL-2基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力研究[D]. 杨明凡. 南京农业大学. 2008
[4]. 鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（B87）国家参考品的研制[D]. 郭彩云. 中国兽医药品监察所. 2012
[5]. 共表达NDVF、IBDV VP0基因重组鸡痘病毒生物学特性研究[D]. 徐敬龙. 吉林大学. 2005
[6]. 通用探针实时荧光PCR检测禽病毒病方法的研究[D]. 田振宇. 山东农业大学. 2006