陈华[1]2002年在《流动注射化学发光分析以及微透析采样技术在药物分析中的应用研究》文中研究表明本工作的主要内容是进行流动注射化学发光分析法以及微透析采样技术在药物分析中的应用研究。全文由两部分组成。 第一部分是药物的流动注射化学发光分析研究，共四章。第一章是综述，结合几种常用的化学发光反应体系，评述了1990年以来，特别是1998年后国内外药物化学发光分析方面的应用研究进展，并对8种常见类型的药物化学发光分析的应用研究情况作了简要的概括。 第二章研究了扑热息痛的流动注射化学发光分析方法。研究发现在碱性条件下，扑热息痛对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应具有强烈的抑制作用，据此建立了流动注射化学发光测定痕量扑热息痛的新方法。扑热息痛浓度在4.0×10~(-8)～1.0×10~(-6)g／mL范围内与发光强度呈良好的线性关系；检测限(3σ)为2.4×10~(-9)g／mL。相对标准偏差为2.3％(C=8.0×10~(-7)g／mL，n=11)。方法用于片剂中扑热息痛含量测定，结果与标准方法测得值一致。同时研究了四种苯酚对位取代物对鲁米诺-铁氰化钾发光体系的影响，并探讨了鲁米诺-铁氰化钾-扑热息痛化学发光反应的可能的机理。 第叁章研究了甲硝唑的流动注射化学发光分析方法。铁氰化钾与碱性鲁米诺溶液混合产生化学发光，甲硝唑对该体系有显着的增强作用(亚铁氰化钾存在时)。基于此，建立了流动注射化学发光测定甲硝唑的新方法。甲硝唑浓度在2.0×10~(-6)～04.0×10~(-4)mol／L范围内与发光强度呈良好的线性关系；检测限(3σ)为1.5×10~(-7)mol／L。对1.0×10~(-5)g／mL的甲硝唑进行11次平行测定得方法的相对标准偏差(RSD)为3.6％。方法用于制剂中甲硝唑含量测定，结果与标准方法测得值一致。对甲硝唑片剂和注射液进行加标回收实验，得方法的回收率分别为101.6％，99.9％。 第四章研究了甲巯咪唑的流动注射化学发光分析方法。研究发现，在酸性条件下，高锰酸钾氧化甲巯咪唑产生弱的化学发光，甲醛的加入可增敏此化学发光反应，由此建立了一种测定甲巯咪唑的流动注射化学发光分析方法。甲巯咪唑浓度在2.0×10~(-8)～8.0×10~(-6)g／mL范围内与发光强度呈良好的线性关系。方法的检测限(3σ)为1.8×10~(-9)g／mL，相对标准偏差为2.7％(C=1.0×10~(-7)g／mL，n=11)，加标回收率为98.5％。该法用于药片中甲巯咪唑含量的测定，结果令人满意。 摘 要 第二部分是研究微透析－流动注射－光学检测联用系统用于药物分析及临床上重要的主化物质的活体在线分析，主要包括五章。第一章简要叙述了微透析采样的原理，优点和不足，微透析实验及仪器，根据微透析采样的特点分析了选择分析方法时应当考虑的问题，讨论了几种主要的微透析探针校正方法，最后简单地总结了 1990年以来微透析技术的研究进展。 第二章是微透析－流动注射－化学发光联用系统在药物与蛋白相互作用研究中的应用，测定了甲硝哗与人血清白蛋白（HSA）的相互作用参数。详细研究了灌流速度和环境温度对探针透析率的影响，结果表明，探针透析率随灌流速率的增大而降低，随温度的升高而升高。本实验选择灌流速率为spL／min，环境温度为37C，在此条件下，微透析探针对甲硝哇的透析率为25二％。利用Scatchard方程及KIOtZ方程得到了甲硝哩与HSA的键合参数，两种方法获得的甲硝哗与HSA的结合常数（K）和结合位点数（n）一致，分另为 1．50 XIO‘（mol／L）－l和 l．89，键合分数为20石％，与文献值相吻合，说明简单、快速的微透析－流动注射－化学发光联用系统适用于药物与蛋白相互作用的研究。 第叁章是关于微透析－流动注射－荧光联用系统在活体在线分析中的应用，对家兔血液中的扩散钙离子进行了在线监测。实验中将微透析探针植入兔子静脉血管中采样，并首次将普通的荧光检测技术应用于活体在线分析。采用了Cd“（／”体系测定钙离子，方法灵敏度高、选择性好，血清中存在的物质在其正常含量范围内不干扰钙离于的测定，检测限（3）为0刀…g／mL。本实验在监测过程中，采用流动注射分析系统在进行样品检测的同时，在线校正检测系统的灵敏度变化的方法，以提高分析系统的可靠性。活体实验中使用的灌流液为Rin驴r试剂。详细研究了各因素对体系荧光强度的影响，以及灌流速度和环境温度对探针体外透析率的影响。实验中采用零通量法对微透析探针进行体外和体内校正，用此法对叁个己知浓度即 30，40和 50pg／mL的钙离于标准溶液在37℃下进行体外校正，得到的浓度分别为 32＊土1．5、42＊土2＊干 49．5土0．gpg／mL（平均值上 RSD，n—3），透析率分别为 34刀上 1．3％，31石土 2二％，33．2士 3石％（n二3），并用单尾方差分析对体外透析率数据进行统计检验，所有计算的尸值均小于临界值0．5，说明在不同浓度下测得的透析率之间无明显差异，表明透析率与浓度无关。将零通量法用于活体校正时得到的扩散钙离子浓度为32．5士3．Zpg／mL（平均值士RSD，n—3），活体透析率为刀．5士3二％（n—3），可以看出，活体透析率与体外透析率几乎相等。以上实验结果表明，本文提出的方
张云静[2]2010年在《液相色谱—化学发光联用技术在中药酚类活性成分药动学中的应用研究》文中认为化学发光法(chemiluminescence, CL)是根据化学发光反应产生的辐射光的发光强度来确定反应中相应物质含量的分析方法,化学发光法与高效液相色谱联用(HPLC-CL)技术将高效分离手段与高灵敏的检测技术相结合,因其具高选择性、有灵敏度高、线性范围宽等优点而倍受青睐,已在临床、环境、食品和药物分析等领域得到了广泛应用。酚类活性成分具有广泛的生物学活性,我国传统中药(复方制剂)很多以酚类化合物作为主要成分,近年来酚类活性成分日益受到关注,而目前的研究主要集中于酚类化合物的药理作用方面,药动学方面的研究相对较少。本研究针对中药酚类活性成分药动学研究中生物样品干扰组分多、药物含量低、浓度变化范围大等分析技术难题,利用HPLC-CL的高选择性、高灵敏度和宽线性范围等优点,建立了中药酚类活性成分山奈酚以及丹参中六种水溶性酚类化合物的体内分析新方法,并结合微透析采样技术,克服了常规采样法的耗时、干扰生命过程等问题,实现游离酚类化合物浓度的动态监测。具体研究工作如下:第一部分液相色谱–化学发光法测定大鼠血浆中山奈酚浓度及其药动学研究本研究基于在硫酸酸性介质中,山奈酚对硫酸铈-罗丹明6G的化学发光的增强作用,建立了高效液相色谱化学发光联用(HPLC?CL)检测大鼠血浆中山奈酚的新方法,采用C18柱,以甲醇-0.4 %磷酸溶液(47:53, v/v)为流动相,流速为1.5 mL·min-1进行等度洗脱。以异鼠李素为内标,血浆样品酸化后经甲醇沉淀蛋白后直接进样。山奈酚血药浓度的线性范围为2.0×10-9?2.0×10-6 g·mL-1 (r = 0.9991),检测限为1.0×10-9 g·mL-1。日内和日间RSD均小于5.0 %,回收率大于80.0 %。该法灵敏度高,线性范围宽,样品前处理简单,成功地应用于SD大鼠灌胃2500 mg·kg-1 BW和1250 mg·kg-1 BW山奈酚的药动学研究,获得了主要药动学参数:2500 mg·kg-1 BW剂量组:Tmax = (1.21±0.46) h,Cmax = (232.90±5.14) ng·mL-1,AUC0-∞= (1728.41±57.31) ng·h·mL-1,MRT0-∞= (13.38±3.87) h,T1/2 = (9.27±1.84) h。1250 mg·kg-1 BW剂量组:Tmax = (1.08±0.43) h,Cmax = (165.67±1.99) ng·mL-1,AUC0-∞= (729.01±29.44) ng·h·mL-1,MRT0-∞= (4.77±2.06) h,T1/2 = (3.30±1.50) h。第二部分微透析-液相色谱-化学发光法测定大鼠血和脑组织中丹参酚类化合物浓度及其药动学研究实验一液相色谱-化学发光法测定丹参及其制剂中六种丹参水溶性成分的含量本研究基于丹参酚类化合物对HAuCl4–luminol–H2O2化学发光体系的增强作用,建立了液相色谱–化学发光联用测定六种丹参酚类化合物(丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和丹酚酸A)的新方法。用Shim pack ODS色谱柱(250×4.6 mm I.D. 5μm),以0.1%磷酸水溶液(v/v)和0.1%磷酸甲醇溶液(v/v)为流动相进行梯度洗脱,与化学发光在线检测联用,在26 min内实现了六种丹参水溶性成分的高选择性和高灵敏分析。六种丹参水溶性成分的检测限在0.03?6.72 ng·mL-1的范围内,精密度(RSD)均小于2.5 %,测定样品的回收率在95.3 %到103.9 %的范围内。本法选择性好、灵敏度高,重复性好,被成功的用于测定复方丹参片、丹参滴注液、注射用丹参(冻干)和丹参药材中水溶性成分的含量测定。实验二丹参滴注液给药后SD大鼠血和脑微透析液中丹参酚类化合物浓度的测定及其药动学研究本研究基于丹参酚类化合物对HAuCl4–luminol–H2O2化学发光体系的增强作用,结合微透析采样技术建立了丹参中六种水溶性酚类化合物(丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸A和丹酚酸B)在大鼠血管和脑透析液中的含量测定方法。采用0.1%磷酸水溶液(v/v)和0.1%磷酸甲醇溶液(v/v)为流动相的HPLC梯度洗脱法,与HAuCl4–luminol–H2O2化学发光检测联用,在26 min内实现了六种丹参酚类化合物的高选择性和超灵敏分析,在林格液(灌流液)中的检测限范围为0.07?12.8 ng·mL-1,回收率的范围为92.04%?101.4%日内和日间精密度为RSD小于6.5%。采用微透析体内连续采样技术,该法被成功应用于丹参滴注液(丹参素3.5 mg·kg-1 BW,静脉注射给药)在大鼠血和脑中的药代动力学研究。本实验结合微透析采样技术考察了丹参滴注液给药后SD大鼠血和脑组织的药动学。血管探针和脑探针分别插入颈静脉和脑皮质以林格液为灌流液,分别以2.0和0.8μL·min-1的流速灌流。探针植入后平衡2 h,收集空白后,大鼠尾静脉注射丹参滴注液(丹参素3.5 mg·kg-1 BW),收集微透析样品,血液和脑组织透析液收集时间间隔分别为15和40 min,分别收集9个和4个样品。结果实现了游离丹参素浓度的动态监测,获得了丹参素在血和脑中的药代动力学参数:t1/2,AUC0-∞,和MRT0-∞。血管探针和脑探针对丹参素的体内回收率分别为(34.89±0.06)%和(27.48±1.20)%(n = 5)。给药后大鼠血液和脑微透析液中均测得丹参素,而未测得原儿茶醛和丹酚酸B。丹参素透过血脑屏障的系数(AUCbrain/AUCblood)高达0.25±0.07,提示丹参素为一个潜在的脑部保护剂。丹参滴注液静脉给药后丹参素在大鼠脑部的药动学为国内外首次报道。实验叁丹参提取物灌胃后SD大鼠血和脑微透析液中丹参酚类化合物浓度的测定及其药动学研究本研究基于丹参酚类化合物对HAuCl4–luminol–H2O2化学发光体系的增强作用,结合微透析采样技术建立了丹参中3种水溶性酚类化合物(丹参素、原儿茶酸和原儿茶醛)在大鼠血管和脑透析液中的含量测定方法。用Shim pack ODS色谱柱,甲醇-0.1%磷酸溶液(8: 92)为流动相进行等度洗脱,与化学发光检测器联用,在35 min内实现叁种酚类化合物的高选择性和超灵敏分析。血管和脑探针的植入灌流速度同实验二,大鼠灌胃丹参药材提取物(丹参素40 mg·kg-1 BW,原儿茶醛149 mg·kg-1 BW)后,收集微透析样品,血液和脑组织透析液收集时间间隔分别为15和30 min,收集血和脑微透析样品,共收集4 h。丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在灌流液中的线性范围分别为2.29?179.0,3.46?345.6和4.80?800.0 ng·mL-1,检测限分别为0.29,0.5184和0.80 ng·mL-1,日间和日内RSD小于5.5%。大鼠灌胃丹参提取物后,血和脑微透析液中检测到丹参素和原儿茶酸,而未检测到原儿茶醛。采用3p87软件,用统计矩求算丹参素和原儿茶酸的药动学参数。二者透过血脑屏障的系数(AUCbrain/AUCblood)分别为0.25±0.04和0.09±0.02。表明丹参提取物灌胃大鼠后,丹参素易透过血脑屏障,原儿茶酸可能为大鼠口服丹参药材提取物后原儿茶醛的氧化代谢产物。
周娅莉[3]2017年在《基于在线微透析采样与流动注射化学发光分析的抗体亲和力测定新方法》文中指出随着生物学和医学的不断发展,单克隆抗体技术在免疫治疗、免疫分析、免疫纯化等领域得到广泛应用。在单克隆抗体的制备和筛选中,最重要的工作之一是对不同细胞株分泌的抗体的亲和力这一关键指标进行评价。因此,研究快速、简单、准确的抗体亲和力测定新方法对于单克隆抗体的应用具有非常重要的指导意义。微透析(microdialysis,MD)是一种微量采样技术,具有可原位、活体采样和在线、实时检测等特点。其工作原理是外部介质中的小分子物质在浓度梯度差的作用下,被动扩散通过透析膜到达探针腔中,而蛋白质和细胞等大分子物质则被阻挡在外,从而实现对小分子物质的采样。流动注射化学发光(flow injectionchemiluminescence,FI-CL)法是将微量、高速和自动化的进样技术与高灵敏度的化学发光检测技术结合而提出的一种痕量分析方法。其原理是待测物浓度与化学发光强度在一定范围内呈线性定量关系,利用仪器对反应体系化学发光强度的测定,来确定待测物含量。本文将MD应用于小分子半抗原采样,结合高灵敏度的FI-CL分析,以β-激动剂这一不宜直接标记的小分子半抗原为例,在均相条件下研究这些小分子半抗原与抗体间的亲和力,建立了MD-FI-CL的在线联用方法,用于测定抗体亲和力,为小分子半抗原的抗体性能评价提供了一个新型的分析方法平台:(1)在线微透析采样结合化学发光法测定特布他林单克隆抗体亲和力本研究利用在线MD采样方法,结合高灵敏度的FI-CL分析法,在均相体系中研究特布他林与其单克隆抗体之间的亲和力,提出了用于测定单克隆抗体亲和力的免标记型新方法。MD探针可以将结合型特布他林及游离型抗体阻挡在半透膜外,从而实现对小分子半抗原(特布他林)的取样,随后将含有游离型半抗原的透析液注入FI-CL系统。碱性条件下,特布他林对鲁米诺-铁氰化钾系统的化学发光有较强的增敏作用,因此,通过测定化学发光信号,可以实现透析液中特布他林的检测。并通过MD探针的回收率校正,计算出免疫反应体系中游离半抗原的浓度,最后通过Scatchard和Klotz公式,计算得到特布他林单克隆抗体的亲和力。两种计算方法所得结果均为4.9×106 M-1,说明特布他林单克隆抗体是中等亲和力的抗体,该结果与硫氰酸盐洗脱法所得结果一致。该方法操作简便、成本低、分析时间短,为单克隆抗体亲和力的测定提供了新的途径。(2)在线微透析采样结合化学发光法测定莱克多巴胺单克隆抗体亲和力本研究基于在线MD和FI-CL的联用技术构建了一种测定抗体亲和力的免标记型新方法,用于直接测定莱克多巴胺与其单克隆抗体间的亲和力常数。MD探针可以将结合型莱克多巴胺及游离型抗体阻挡在半透膜外,从而实现对免疫反应体系中游离型莱克多巴胺的取样,随后将含有游离型半抗原的透析液注入FI-CL系统。碱性条件下,莱克多巴胺对鲁米诺-高锰酸钾系统的化学发光有较强的增敏作用,因此,通过测定化学发光信号,可以实现对透析液中莱克多巴胺的检测。并通过MD探针的回收率校正,计算出免疫反应体系中游离半抗原的浓度,最后通过Scatchard和Klotz分析,计算得到莱克多巴胺单克隆抗体的亲和力。两种分析方法所得结果均为1.0×106 M-1,说明莱克多巴胺单克隆抗体是中等亲和力的抗体,该结果与硫氰酸盐洗脱法所得结果一致。因此,我们认为该方法用于抗体亲和力的测定是简单、可行的,可以广泛地应用于免疫化学领域。
黄英[4]2005年在《基于荧光检测的在线药物蛋白反应研究》文中认为当药物进入生物体内后,通常要经历吸收、分布、代谢的过程。大部分的药物经代谢反应后会产生一种或者多种新的化合物——代谢物。药物分子及其代谢物分子也能不同程度的与生物大分子如受体、组织、血浆蛋白相结合。在转运和转化的过程中,药物会与组织蛋白(包括受体)及体液蛋白相结合。因此除了未结合的药物及其代谢分子,在组织和体液中还含有与蛋白相结合的药物及其代谢物分子。药物通过血液循环分布于各个组织和器官,血浆中游离的药物可以自由的通过毛细血管壁进入到靶器官而产生药效,而结合型的药物由于分子量较大很难跨膜转运到达作用部位。因此研究药物血浆蛋白的结合在药效学和药代动力学研究中都是非常重要的,只有游离的部分才是药物的起效形式。一些重要的药代动力学性质如肝脏代谢率、肾清除率、生物膜渗析率以及稳态分布量都取决于药物的游离部分。显然药物与蛋白相互作用的研究及相关参数的确定具有非常重要的理论和现实意义。 本论文主要介绍了基于荧光检测的在线药物蛋白反应研究,全文由两部分组成。第一部分是综述,这部分评述了近十年来国内外荧光分析法在药物分析中的应用情况。 第二部分是研究报告,包括两章。第一章是基于荧光检测的在线药物蛋白反应研究,由叁小节组成。第一节简要评述了药物蛋白反应的研究进展。 第二节采用在线微透析-流动注射-荧光联用技术,详细研究了甲磺酸酚妥拉明与牛血清白蛋白的相互作用。酚妥拉明可将Cerium(Ⅳ)还原为Cerium(Ⅲ),在硫酸介质中呈现Cerium(Ⅲ)的特征荧光光谱,基于此,建立了一种间接测定酚妥拉明的荧光分析法,并将其与在线微透析取样技术联用,成功应用于药物-蛋白相互作用研究当中。该法简单、快速、易于操作。
李保新[5]2002年在《化学发光分析新方法、新技术的研究》文中进行了进一步梳理自从1877年首次发现化学发光现象以来，人们对化学发光现象的认识和研究，已经历了一个极其漫长的发展过程。化学发光是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下，由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光分析，由于可以进行发射光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰，因而具有很高的灵敏度(检出限可达10~(-12)～10~(-21)mol)，很宽的线性范围(3～6个数量级)，同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化，在二十世纪的最后十年发展非常迅速。化学发光分析法在无机物、有机痕量和超痕量分析领域内都得到了广泛应用。特别是近年来，化学发光分析法在多类复杂有机物质，如氨基酸、蛋白质、维生素、核酸、DNA、激素、生物碱及各类药物及毒物的检测，多种生物活性物质的分析，多种抗体和抗原的免疫分析，基因芯片、蛋白质芯片、受体芯片、酶芯片、微流控芯片研究中得到了广泛地应用，而且呈现出上升趋势。为生命科学、环境科学、材料科学的研究提供了许多新的、高灵敏度的、有效的分析手段，推动了这方面科学理论和高新技术的发展；同时，其他相关学科的研究成果也为化学发光分析法提供了许多新的技术和手段，出现了许多新的化学发光法，如纳米发光、发光成像、发光活体分析，大大促进了化学发光的发展及应用。目前，在化学发光分析研究中主要有两大方向：化学发光新体系的研究和新技术在经典化学发光体系中的应用研究。本论文的研究工作也就集中在两个方面。 本论文在全面总结和论述化学发光分析的原理、化学发光反应机理及分析应用、电化学发光分析法、化学发光免疫分析法、偶合化学发光分析法、化学发光分析法与液相色谱及毛细管电泳联用技术、化学发光传感器等方面国内外研究现状的基础上，提出并系统研究了几类新型的化学发光分析法，设计出了一系列新的高灵敏度、高选择性且稳定响应的流通式化学发光传感器，并把一 两南帅他人学博1：学位论义 化学发光分析新方江、新技术的叭穴些新的技术引入化学发光分析中，从而把化学发光分析法应用范田扩大到药理学研究中。其主要内容包括以下几个方面：一、电生试剂化学发光分析法的研究 充分利用电化学和流动注射分析技术，提出了电生不稳定试剂化学发光分析法的新思想。设计出一种新型的流通式电解池，并充分利用流动注射分析法的特点，采用恒电流电解技术，分别在阳极氧化低价稳定的＊、Br、Co’＼Mn’＼Ag＼Cu’”，从而在线定量地产生相应的、具有氧化性的不稳定试剂CIO。BrO、早Co’＼Mn’＼Ag’＼Cu’－，并使这些不稳定试剂在线与试液中的待测物质发生反应，产生化学发光。基于此原理，己成功地建立了测定异烟姘、哇宁、庆大霉．素、毗派酸、卡托普利、金霉素、铂离于、亚硫酸根等化学发光新方法。 在这类化学发光新方法中，不稳定氧化剂是山电化学反应在线产生的，从而消除了山其不稳定性所带来的不利影响，而且其浓度可用改变电解电流大小来加以调控。我们还发现在设计的电解池和反应池中进行化学发光反应时，电生试剂呈现出初生态的特点，具有很高的反应活性，能获得较强的化学发光强度。这是用其它方法制备的相同试剂所不具有的；另外，山于电生试剂的成分单一，试剂纯净，避兔了化学法制备试剂所引进杂质的干扰。另一方面，在这类化学发光新方法中，我们设计出了一种新型的流通式电化学发光池，其中把电解地与化学发光池彼此分离，设计在流路的不同位置。这样设计可以使电化学反应和化学发光反应在不同的区域发生，能够确保它们均在各自最佳条件下进行的，两者之间也不可能产生干扰；样品可以不进入电解池，不会对电极产生污染；化学发光信号在发光池中检测，不存在电极对光学信号所带末的十扰。 这类化学发光新方法的提出，大大地改善了原有0 化学发光体系和 BrO化学发光体系的分析性能，并使这些非常规氧化剂 CO’＼ Mfl’＼ Ag’＼ CLI’“首 凸次应用于化学发光分析中。这对研究化学发光反应提供了一种新思路，并拓宽了化学发光类型及应用范围。毛二、新型流通式化学发光生物传感器的研究 本论文改变传统光学传感器静态晌应模式，把流动注射分析技术引入传感器的设计中，克服以往定静态响应模式的缺点，建立动态响应模式，设计出流通式化学发光传感器，并且在传感器分于识别系统作了研究，完成了一系列性能优良流通式光学传感器。 一2一 的南帅他人学博卜学位论文 化学发光分析新方浊、新技术的研大 1、首次提出流通式化学发光组织传感器。组织传感器国内外都己经厂展了 研究工作。但是，目前在这类生物传感器中，换能器几乎全部是电流型的电化 学换能器。这类传感器中，一般通过物理的方法，把极其少量的生物材料固定 在电极上。山于生物材料的固定量极少，故其生物催化活性不会?
陈福南[6]2008年在《高效液相色谱—化学发光分析研究》文中指出化学发光(chemiluminescence,CL)是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下,由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光分析,由于可以进行发射光子计量,又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰,因而具有很高的灵敏度(检出限可达10~(-12)-10~(-21)mol),很宽的线性范围(3-6个数量级),同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化,在近叁十年发展非常迅速。然而,化学发光分析法的一个突出的缺点是选择性比较差,严重制约了它的应用。人们采用了多种方法来弥补化学发光分析的这个缺陷,一是与特异性分子识别反应联用,如酶反应,包括纯酶反应、动植物组织或细胞:抗原-抗体反应或受体-配体反应:核酸、适配体、DNA、RNA等特异性识别及分子印迹聚合物识别等。另一种方法是将化学发光分析同高效分离方法相结合,如高效液相色谱、毛细管电泳和凝胶电泳等。高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术,具有分离效率高、选择性好、分析速度快、操作自动化、应用范围广的特点,已经成为有机物质分析的支柱技术,在生物化学、临床医学、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用。对HPLC的研究主要集中在叁个方面:一是研究各种类型的色谱柱;二是研究与HPLC耦合的检测器:叁是研究如何拓宽HPLC的应用范围。检测器作为HPLC系统的重要组成部分,充当着“眼睛”的角色。人们已经研究和开发了多种检测器,如紫外-可见光检测器(UV-VIS)、光电二极管阵列检测器(PDA)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、蒸发激光散射检测器(ELSD)、光电导检测器(PCD)、磁旋光检测器(MDR)、放射性检测器(RD)、热离子化检测器(TlD)、化学发光检测器(CLD)和质谱(MS)检测器等。在众多的HPLC捡测器当中.化学发光检测器结构简单,背景低,灵敏度高,被越来越多地应用于各种复杂样品中Pg或龟级含量化合物的检测。与紫外检测器、荧光检测器等常用的检测器不同,化学发光检测器不是一种通用的检测器,某些共存物质即使不能通过色谱柱很好分离,也会因为其中一些物质不能发生化学发光,或者产生化学发光的条件不同而被区分开来,这就可以避免了在紫外检测等方法里不可避免的干扰。因此化学发光检测器与HPLC联用成为当今化学发光分析分析研究及应用非常活跃的热点之一。HPLC-CL联用技术从理论上结合了二者的优势,可以实现高灵敏度、高选择性的快速分离分析,实际应用中仍然存在两个主要问题:1)由于化学发光检测器需要在检测池中进行化学发光反应,反应试剂溶液的加入会出现稀释效应并导致色谱峰展宽,使HPLC分离度降低。2)色谱分离条件与化学发光反应条件不一致,因而不是所有的化学发光体系都适合用作色谱柱后检测器。围绕这两个问题,本研究设计了一种新的化学发光检测池,将分离柱后的毛细导管直接插入流动的和不断更新的化学发光试剂环形池中,由于所建立的化学发光反应是一种快速化学发光反应。从柱后流出的各分离组分能立即在检测池中产生化学发光反应并立刻被窗口检测到。这样设计的检测池无任何死体积和稀释效应存在,与传统的化学发光检测器比较,获得的色谱峰比较窄,从而提高了分离度。通过在完成反应池设计、柱后接口、优化色谱分离和化学发光检测器条件的基础上,提出了一系列灵敏度高、选择性好的HPLC-CL检测新方法,并将这些新的高效液相色谱-化学发光检测方法应用于生物样品如人体血液和尿液中某些痕量药物的检测。结合微透析技术还实现了活体、在线、实时药物代谢动力学研究。活体动态生化分析是近年来在分析化学领域迅速发展起来的新的研究领域,其中微透析技术占重要地位。微透析技术是一种新型的生物采样技术,在药物代谢动力学领域,尤其是在药物分布与代谢的研究方面发挥着日益重要的作用。传统的药代动力学研究都是采用脱线分析,不能完全真实反应组分在动物体内的分布和代谢情况。而微透析取样方法对组织损伤小,可以在基本上不破坏生物体内环境的前提下对细胞间液中小分子物质进行连续取样。当采用在线分析时,还可以使被透析出的物质在接近体内环境的条件下得到检测,可以实时的监测到体内多种化合物量随时间的变化。取样无需匀浆过程,可真实代表取样位点目标化合物的浓度,同时在体内不同部位插入微透析探针可研究目标化合物的体内分布,即具有空间分辨性。这是其它化学微环境在位监测方法无法比拟的,对于研究生命过程、进行疾病诊断以及开展约物研究具有重要意义。本论文还研究了HPLC-CL分折方法与微透析采样技术结合起来的活体动态生化分析,并应用于药物和生化物质的动力学代谢研究。现就HPLC-CL检测技术的研究进展(第一章)和具体研究工作(第二-四章)简述如下:第一章主要就HPLC-CL检测技术的基本原理、典型化学发光反应体系(包括鲁米诺及其衍生物、过氧化草酸酯、叁(2,2-联吡啶)钌(Ⅱ)、高锰酸钾化学发光体系等)、柱后化学发光检测器的构建及近10年来在生命科学、药学、临床医学、环境及食品等领域的应用和进展情况进行了评述。对这一检测技术在实际应用中存在的问题进行了分析,对其发展方向进行了展望。第二章就luminol-K_3Fe(CN)_3化学发光检测方法与高效液相色谱分离技术的结合及其在儿茶酚胺类药物分析中应用进行了研究,主要包括:1、微透析采样,高效液相色谱分离和鲁米诺-铁氰化钾化学发光活体在线检测血液中左旋多巴:基于左旋多巴可以增强鲁米诺-铁氰化钾化学发光信号的现象,结合高效液相色谱,建立了新的HPLC-CL左旋多巴分析方法。而微透析技术是一种新的采样技术,它具有活体、原位采样,实时、在线检测等突出特点。本研究设计了微透析探针系统,又将这个新的采样技术与HPLC-CL联用,实现了家兔血液中的左旋多巴活体在线检测。灌流液以5μl/min的速度灌流,将血液中的分析物透析出来,经HPLC分离后用CL检测。该方法获得的响应信号在1×10~(-8)-1×10~(-6)g/mL(r~2=0.9995)浓度范围内呈良好的线性关系,检出限为3×10~(-9)g/mL(3σ)。获得的药时曲线表明左旋多巴的血药浓度在服药90分钟时达到最高值,与药典上分析结果一致。2、HPLC-鲁米诺-铁氰化钾化学发光检测同时测定人血清中的肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺:肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系都有增敏作用,可以分别用本化学发光体系进行检测。但是它们叁者在同一个系统中,则会产生相互干扰。本研究设计反应池、优化色谱分离条件,建立了这叁种物质同时测定的HPLC-CL新方法。以0.01mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液-甲醇(92/8,v/v)为流动相在C_(18)反相色谱柱上实现分离,柱后用CL进行检测。在优化好的各项条件下,肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺的线性范围分别是1×10~(-8)-5×10~(-6),5.0×10~(-9)-1.0×10~(-6)和5.0×10~(-9)-1.0×10~(-6)g/mL。检出限分别为4.0×10~(-9),1.0×10~(-9)和8.0×10~(-10)g/mL。该方法已成功用于血清样品中叁种物质的分析,加标回收率在97-106.7%之间。第叁章研究了高锰酸钾-甲醛化学发光体系在高效液相色谱柱后检测技术的应用,包括:3、高锰酸钾-甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测血清中的肌苷本文采用高效液相色谱与化学发光检测联用法,用酸性高锰酸钾和甲醛作为发光剂,流动注射化学发光来测定肌苷,用55:45的甲醇:水作为流动相,肌苷的质量浓度在0.4-12μgmL~(-1),范围内与化学发光强度呈良好的线性关系。其检出限为0.15μg mL~(-1),测定的相对标准偏差为2.9%,(c=1.0×10~(-6)g/mL,n=9)。该方法已成功地用于测定人体血清中的肌苷。4、高锰酸钾-甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测血清中的维生素B_6本文基于酸性介质中甲醛会增敏高锰酸钾化学发光体系,建立了一个新的高锰酸钾-甲醛-维生素B_6化学发光体系,并将其与高分离效率的HPLC耦合,克服了化学发光选择性差的缺陷,在优化好的条件下,维生素B_6对该体系的化学发光响应线性范围为0.3-10μg mL~(-1),检出限为0.1μg mL~(-1),测定的相对标准偏差为3.7%,(c=1.0×10~(-6)g/mL,n=7)。该方法已成功地用于同时测定人血清中的维生素B_6。5、高锰酸钾-甲醛化学发光法高效液相色谱柱后检测尿样中的异丙嗪高锰酸钾实际常用的化学发光试剂,经研究发现在酸性介质中可以氧化盐酸异丙嗪产生化学发光。而甲醛可以增敏高锰酸钾-异丙嗪化学发光。基于这样的原理,建立了HPLC-CL检测盐酸异丙嗪的新方法。在实验优化的最佳条件下盐酸异丙嗪的质量浓度在1-100μg mL~(-1)范围内与化学发光强度呈良好的线性关系,其线性方程为△I=16.9234+26.3620c(r~2=0.9993),对1μg mL~(-1)的盐酸异丙嗪平行测定11次,其相对标准偏差为2.7%。根据IUPAC建议计算得本方法的检出限为3×10~(-7) g mL~(-1)。第四章研究了联吡啶钌-Ce(Ⅳ)化学发光体系在高效液相色谱柱后检测技术,包括:6、联吡啶钌-Ce(Ⅳ)化学发光体系检测血清和尿样中的呋噻米Ce(Ⅳ)为氧化剂时,一方面与呋噻米发生氧化还原反应生成活性中间体,另一方面又将Ru(bipy)_3~(2+)氧化成Ru(bipy)_3~(3+)。后者与呋噻米活性中间体发生反应产生激发态Ru(bipy)_3~(2+*),然后释放出光能回到基态,并且产生的化学发光强度与呋噻米浓度在一定范围内呈线性关系。本文基于这样的反应体系,建立了Ce(Ⅳ)-Ru(bry)_3~(2+)-呋噻米化学发光分析方法,并将这个高灵敏的CL分析方法与高分离效率的HPLC耦合起来,在设计反应池的基础上,形成一个新的灵敏、快速的呋噻米分析方法,检出限为3.0×10~(-8)g/mL,线性范围在1-50×10~(-7)g/mL,并成功用于血清样品中呋噻米的测定。7、联吡啶钌-Ce(Ⅳ)化学发光体系检测片剂和血清中的己烯雌酚本文研究发现酸性介质中Ce(Ⅳ)可以同时氧化DES和Ru(bipy)_3~(2+),两个氧化还原反应生成的中间产物再相互作用生成激发态Ru(bipy)_3~(2+*),激发态Ru(bipy)_3~(2+*)通过释放光能回到基态,由此产生化学发光,且化学发光强度与DES浓度在一定范围内呈线性关系。基于此,本文建立了新的测定DES的CL方法,并设计了反应池,使之与HPLC耦合后,尽量减少柱后峰展宽,保持化学发光方法的灵敏度,同时优化了各项分析分离条件和化学发光反应条件,利用HPLC的高分辨效率,成功实现了血清等复杂生物样品中DES的分析,在8×10~(-8)-1×10~(-5)g/mL范围内成良好的线性关系,方法检出限为3.0×10~(-8)g/mL。对8×10~(-7)g/mL的己烯雌酚连续进行7次平行测定的相对标准偏差为3.6%。8、联吡啶钌-Ce(Ⅳ)化学发光体系检测血清和尿样中的甲磺酸酚妥拉明本文研究发现,酸性介质中,酚妥拉明被Ce(Ⅳ)氧化生成活性中间体。有Ru(bipy)_3~(2+)存在时,Ru(bipy)_3~(2+)同时也被Ce(Ⅳ)氧化成+3价Ru(bipy)_3~(2+)。酚妥拉明活性中间体接着与Ru(bipy)_3~(3+)产生反应生成激发态Ru(bipy)_3~(2+*),激发态Ru(bipy)_3~(2+*)通过释放光能回到基态,由此产生化学发光,且化学发光强度与酚妥拉明浓度在一定范围内呈线性关系。基于此,在完成反应池设计基础上,首次提出用HPLC-CL联用技术测定生物样品中的酚妥拉明,对4×10~(-7)g/mL的酚妥拉明连续进行11次平行测定的相对标准偏差为3.1%,方法检出限为3.0×10~(-8)g/mL。在1～20×10~(-7)g/mL范围内线性方程为△I=-55.95+46.40c(r~2=0.9985),效果令人满意。
罗教华[7]2005年在《毛细管电泳和化学发光法实时、在体检测药物及金属离子》文中认为近几年来,微透析技术在药物代谢动力学领域,尤其是在药物分布与代谢的研究方面开始发挥重要作用。微透析取样可以与许多检测技术联用,其中,微透析技术与高效液相色谱联用较多,但液相色谱存在需要的样品量多,分析时间长,得到的时间分辨率低,成本较高等缺点,使其应用受到一定的限制。毛细管电泳是一类新型液相分离分析技术,它具有分辨率高、分离速度快、所需样品量少、样品处理相对简便的优点,为与微透析技术联用提供了理想的条件。流动注射化学发光分析法具有很高的灵敏度,很宽的线性范围,分析速度快,同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化,有广泛的应用前景。目的:(1)将毛细管电泳与微透析采样技术联用,测定家兔血液中游离的药物浓度;(2)将流动注射化学发光法与微透析采样技术联用,测定家兔血液中游离的金属离子浓度。方法:(1)首先对毛细管电泳条件(包括缓冲液的种类、pH值和离子强度,进样方式和进样量,运行电压)进行优化,建立被测药物与内标物的最佳分离条件;测定毛细管电泳的精密度和回收率,建立标准曲线。然后对微透析系统(灌流液的种类,灌流速度)进行优化,测定透析率。最后,通过家兔耳缘静脉注射药物,用微透析探针采样,通过毛细管区带电泳分离测定透析液中的药物,实时、在体的测定药物在家兔血液中的代谢过程。(2)首先优化化学发光条件(包括化学发光体系的选择,鲁米诺溶液的pH和浓度、过氧化氢的浓度、EDTA的浓度、试液流速、阴离子交换柱长度),建立检测叁价铬的化学发光系统;测定精密度和回收率,建立标准曲线。然后对微透析系统(灌流液的种类,灌流速度)进行优化,测定透析率。最后,给家兔灌胃CrCl3·6H2O,用微透析探针采样,通过Luminol-H2O2-Cr(III)发光体系测定透析液中金属离子,实时、在体的测定游离叁价铬在家兔血液中的代谢过程。结果:(1)通过对毛细管区带电泳条件的优化,能够使被测药物与内标达到基线
陈丁龙[8]2005年在《毛细管电泳实时在体药物代谢动力学的研究》文中提出本文的主要研究工作包括两部分:第一部分是毛细管电泳与微透析联用实时研究药物在动物体内的代谢动力学;第二部分是化学发光新体系研究及与微透析联用研究药物与蛋白结合。各项研究工作如下: 第一部分:分为叁章。第一章是综述,结合几种常用的毛细管电泳分离模式,评述了1995年以来,特别是2000年后国内外药物代谢分析方面的应用研究进展。 第二章研究报告分为叁节。第一节简要介绍了药物的药代动力学与微透析技术的基本原理; 第二节将毛细管区带电泳(CZE)与微透析采样技术联用,研究了盐酸雷尼替丁在家兔血液中的代谢过程。首先研究了毛细管电泳的pH值、缓冲液浓度、分离电压、进样时间等电泳条件对盐酸雷尼替丁与法莫替丁分离的影响。结果采用pH 6.2磷酸缓冲液,分离电压为10kV,进样压力2758Pa,4s的条件,能够使盐酸雷尼替丁与法莫替丁达到基线分离,据此以法莫替丁为内标建立了一种测定盐酸雷尼替丁的方法,峰面积比与相应的盐酸雷尼替丁浓度在1.5×10~(-7)g·mL~(-1)～8.0×10~(-6)g·mL~(-1)范围内成线性关系(r=0.9981),检测限为9.0×10~(-8)g·mL~(-1)。药物代谢动力学参数由“NDST-21”计算软件求得,代谢符合一室开放模型,其半衰期为89.8 min; 第叁节用微透析-毛细管电泳测定了家兔血液中的西咪替丁。研究发现,采用如下条件:pH 2.5,100mM磷酸缓冲液,分离电压17kV,电动进样9 kV×9s,西咪替丁与雷尼替丁能达到基线分离,据此以雷尼替丁为内标建立了一种测定西咪替丁的方法。西咪替丁与雷尼替丁峰面积比与相应的西咪替丁浓度在8.0×10~(-9)g·mL~(-1)～4.0×10~(-7)g·mL~(-1)范围内成线性关系(r=0.9982),检测限5.0×10~(-9)g·mL~(-1)。药物代谢动力学参数由“NDST-21”计算软件求得,代谢符合一室开放模型。
钟招亨[9]2007年在《流动注射化学发光法在药物分析中的应用研究》文中研究表明化学发光分析是根据化学发光反应所产生的光辐射(化学发光)来确定含量的一种痕量分析方法。流动注射与化学发光的联用，使其具有灵敏度高、线性范围宽、设备简单、操作方便、分析速度快、易于实现自动化等优点，越来越多地应用于各个分析领域。将化学发光用于药物分析不仅具有理论意义，而且还有重要实用价值。本论文首先介绍了流动注射和化学发光的基本原理，综述了1996年以来，流动注射与化学发光联用技术在药物分析方面的应用。并在以下几方面进行了探讨。1．在硫酸溶液中，高锰酸钾可直接氧化莽草酸，产生强的化学发光，据此发现了莽草酸的化学发光新体系。并结合流动注射技术，首次建立了流动注射化学发光法测定莽草酸的方法。在优化条件下，化学发光信号值与莽草酸浓度在2.0×10~(-6)～1.0×10~(-3)mol／L范围内呈良好的线性关系(r=0.9999)，方法检出限为7.2×10~(-7)mol／L，其相对标准偏差为1.4％(1.0×10~(-4)mol／L，n=7)。该化学发光体系简单，稳定性较好，线性范围宽，已应用于八角茴香中莽草酸含量的测定，取得了满意的结果。2．在磷酸条件下，高碘酸钠氧化过氧化氢产生弱发光，青霉胺的加入能大大增强此弱发光，据此，建立了流动注射化学发光法测定青霉胺的新方法。该方法的线性范围为1.0×10~(-6)～8.0×10~(-4)mol／L，方法的检出限为5.6×10~(-7) mol／L，其相对标准偏差为1.9％(8.0×10~(-5)mol／L，n=7)。该法线性范围宽、简便、快速、准确，已应用于青霉胺片中青霉胺含量的测定，结果满意，并探讨了反应机理。3．实验发现，在硫酸介质中，硫酸高铈(IV)氧化芦丁能产生弱发光，而罗丹明6G(Rh6G)能大大增强此弱发光，由此建立了流动注射化学发光法测定芦丁的新方法。该方法的线性范围为1.0×10~(-7)～1.0×10~(-4)mol／L，方法的检出限为8.1×10~(-8)mol／L，其相对标准偏差为1.5％(1.0×10~(-5)mol／L，n=7)，回收率为99.0％～104.0％。该方法线性范围宽，简便、快速、准确，已成功地应用于芦丁片剂中芦丁含量的测定，取得了满意的结果。4．实验发现，在硫酸条件下硫酸高铈(IV)氧化丹皮酚能产生弱发光，在有机介质中，罗丹明6G(Rh6G)能大大增强此弱发光，据此，建立了流动注射化学发光法测定丹皮酚的新方法。该方法的线性范围为5.0×10~(-7)～1.0×10~(-4)mol／L，方法的检出限为9.7×10~(-8)mol／L，其相对标准偏差为1.8％(1.0×10~(-5)mol／L，n=7)。该法线性范围宽、简便、快速、准确，已成功应用于丹皮酚软膏中丹皮酚含量的测定，结果与紫外分光光度法测得值一致。
刘海燕[10]2006年在《流动注射—化学发光法在药物分析及农药残留分析中的应用研究》文中研究说明化学发光法被认为具有高灵敏度、线性范围宽、分析快速和仪器设备简单等优点，近年来在无机物、生物活性物质、有机痕量和超痕量分析领域都得到了广泛应用。由于化学发光过程无需光源，因此化学发光法的背景发射比荧光法低得多。任何能影响化学发光反应，引起发光强度、速度和波长发生改变的物质都能成为化学发光法的分析对象。本文在系统评述化学发光分析法的发展历史、基本原理、主要反应体系及其与流动注射、电化学、印迹分子、高效液相色谱、毛细管电泳等联用技术的原理及应用的基础上，介绍了我们在化学发光与流动注射联用技术应用方面的一些研究工作，并重点介绍了基于碱性鲁米诺、N-溴代丁二酰亚胺、酸性Ce(Ⅳ)-NaSO_3、KMnO_4-HCHO、KMnO_4-Rh 6G等五种化学发光体系，采用流动注射-化学发光分析方法，对几种药物及农药残留分析测定的研究，对可能的化学发光反应机理，采用试验数据及文献资料进行了初步探讨。本论文主要研究内容如下： 1．在碱性溶液中，盐酸多巴酚丁胺与鲁米诺反应能够产生微弱的化学发光，铁氰化钾／亚铁氰化钾对该发光反应具有明显的增强作用。基于此，建立了一种新的测定盐酸多巴酚丁胺的流动注射化学发光方法。考察了各种影响因素，确立了反应的最佳条件。在优化条件下，盐酸多巴酚丁胺在1.0×10~(-10)gmL~(-1)到1.0×10~(-7)gmL~(-1)范围内与相对化学发光强度有良好的线性关系，检测限为：2.6×10~(-11)gmL~(-1)(3σ)。对含量为1.0×10~(-8)gmL~(-1)的标准溶液平行测定11次，相对标准偏差为1.23％。该法已成功用于注射液中盐酸多巴酚丁胺含量测定，结果与药典方法测定值吻合。利用文献资料及实验结果，对化学发光反应机理做了初步探讨。 2．基于美洛昔康与N-溴代丁二酰亚胺在碱性介质中的反应，首次提出一种
参考文献：
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