1. 沈阳化工研究院有限公司安评中心，辽宁沈阳 110141
2.沈阳化工研究院有限公司医药研究室，辽宁沈阳 110021
摘要: 目的 通过低黏附培养板培养法建立人膀胱癌T24细胞三维培养模型，为膀胱癌治疗药物早期开发提供灵敏度高的体外筛选模型。方法 采用1000个/孔-8000个/孔的密度将T24细胞接种至低黏附培养板中培养5天，或5000个/孔接种量培养12天，观察细胞球形态并考察不同细胞接种数量和不同培养时间对细胞球体积的影响。采用Western blot比较二维培养及三维培养的T24细胞中缺氧诱导因子-1α（Hif-1α）的表达变化。采用不同浓度的顺铂及丝裂霉素处理细胞，比较二维及三维培养的T24细胞对药物敏感性差异。结果 采用低黏附培养法T24细胞能形成形状较为规则的三维细胞球，且细胞球体积随着细胞接密度及培养时间的增加而增大；三维培养的T24细胞中Hif-1α的表达高于二维培养的T24细胞，且随着三维培养时间的增加而增加。三维培养方式下，丝裂霉素及顺铂的IC50值分为1.39 μg/mL及18.29μg/mL，远高于二维培养条件下的0.10 μg/mL及2.42 μg/mL。结论 采用低黏附培养板培养法建立的T24细胞三维培养模型具有操作简便、快速，预测准确率高的优点，是理想的膀胱癌治疗药物早期开发体外活性筛选模型。
关键词 低黏附培养法；三维培养；膀胱癌；T24细胞；
Abstract: Objective To establish a three-dimensional culture model of human bladder cancer cells （T24）by low adhesion culture plate culturing method, and provide a high sensitivity screening model for the early stage activity screening of bladder cancer therapy drugs. Methods T24 cells of 1000/well~8000/well were seeded into low adhesion culture plate, and cultured for 5 days or 5000/well cultured for 12 days, then the volume of cell spheroids were measured. At the same time, the expression level of hypoxia induced facter-1α (Hif-1α) and the drug sensitivity of cisplatin and mitomycin were compared between two-dimensional and three-dimensional cultured T24 cells.
Results The cell spheroids were formed perfectly by low adhesion culture plate culturing method, and the spheroids volume were increased with the increasing of cell seeding density or culturing time. In three dimensional cultured T24 cells, the Hif-1α expression level was higher; and the IC50 values were 1.39 μg/mL and 18.29μg/mL, which were much higher than those of 0.10 ug/mL and 2.42 ug/mL in two-dimensional culture. Conclusion The three-dimensional culture model of T24 cells, based on low adhesion culture plate culturing method, is rapid and simple to operate, and accurate to predict the drug activity. Which is an ideal screening model for early stages development of anti-bladder cancer drugs.
Key words: Low adhesion culture plate culturing method; Three-dimensional culture; T24 cells
膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，世界范围内每年新诊断病例超过43万人，病死率超过16万人，位居肿瘤发生率的第六位[1-2]。在我国虽然膀胱癌的发病率低于欧洲国家，但也呈现出逐年上升趋势[3]。因此，膀胱癌治疗药物的开发已刻不容缓。
体外细胞水平的药物活性筛选因其简单、快速、成本低廉等优势在药物开发的早期过程中被广泛应用。目前体外药物活性筛选多应用传统的二维细胞培养模型，该模型中细胞以平铺的方式生长于培养器皿的表面，缺乏真实肿瘤组织的三维微环境[4]。因此，在抗肿瘤药物筛选过程中稍显不足，易造成假阳性结果。
相比于二维细胞培养方式，三维细胞培养通过体外建立三维细胞网络，使细胞呈立体的方式生长，再现了细胞与细胞，细胞与基质间的相互作用。因此，更贴近体内肿瘤细胞的生存环境及生长方式。三维细胞培养弥补了二维培养方式的不足，已成为药物活性筛选领域研究的热点[5-6]。
本研究旨在建立一种快速、方便的人膀胱癌T24细胞三维培养模型，并对二维及三维培养细胞对抗肿瘤药物的敏感性进行比较，为膀胱癌治疗药物早期筛选提供一种简便、快捷、高效、预测准确率高的模型。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人膀胱癌T24细胞购自中科院上海细胞库，接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃、含5%二氧化碳的培养箱中培养。试验中使用对数生长期的细胞。
1.2 主要试剂
RPMI-1640（货号21517002）购自美国coining公司，胎牛血清（货号NR06611）购自上海双洳生物科技有限公司，4-硝基苯基磷酸二钠（货号71768），购自Sigma，丝裂霉素（货号130438）、顺铂（货号88SM-8LH9），购自中国食品药品检定研究院。
1.3 主要仪器
离心机，购自上海安亭科学仪器厂；生物安全柜，购自海尔集团，CO2培养箱，购自美国纽埃尔；IX71型倒置显微镜，购自日本OLYMPUS；Synergy HT酶标仪，购自美国博腾。
低黏附U底96孔培养板（货号13017051）购自美国康宁公司；96孔培养板（货号0813A）、培养皿（货号704001），购自NEST。
2 实验方法
2.1 细胞三维培养
对数生长期的T24细胞消化离心后，培养基稀释制成1.0~8.0×104细胞悬液。将100 μL细胞悬液接种于低黏附U型底培养板中，培养板离心机1000 rap/min离心1 min，37℃，5% CO2环境下培养5天或12天。
2.2 细胞球体积计算
细胞培养结束后，显微镜下观察并拍摄细胞球照片，Image J测量细胞球的长径（Ra）与短径（Rb），计算细胞球体积。公式如下：
V=3.14×Ra×Rb2/6
2.3 药物处理细胞
二维培养：细胞以5000个/孔的密度接种于普通96孔板，二氧化碳培养箱常规培养24小时后，弃去上清，加入0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL的顺铂及丝裂霉素，2小时后弃去药液，添加新鲜培养基继续培养48小时。
三维培养：细胞以5000/孔的密度加入U型底培养板中，制作三维培养模型，培养3天后，加入0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL，2 hr后吸弃药液，添加新鲜培养基继续培养48小时。
2.4 APH法检测细胞活力
细胞培养结束后，弃上清，每孔加入200 μL的APH反应液（0.1 mol/L醋酸钠、0.1% TritonX 100、2 mg/mL 4-硝基苯基磷酸二钠），37℃反应3 hr。反应结束后每孔加入20 μL的反应终止液（1 mol/L NaOH），震荡混匀。二维培养直接于酶标仪405 nm处测定吸光度值（A），三维培养每孔吸取200 μL至96孔板中于酶标仪405 nm处测定A值，并计算生长抑制率。
公式如下：
生长抑制率%=（1-（A样本/A对照））*100%
2.5 蛋白质免疫印迹
培养结束后，收集二维及三维培养的T24细胞，加入细胞裂解液裂解细胞。裂解完成后BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行定量，同时在剩余的裂解液中加入5×上样缓冲液并对蛋白进行变性处理。每个泳道加入20 μg蛋白样品后开始电泳，积层胶时电压60 V，分离胶时电压120 V。电泳结束后进行转膜处理，100 mA转移2 hr。转移结束后参照Marker剪下所要检测的蛋白条带，5%脱脂牛奶中封闭处理2 hr。封闭完成后将条带转移至含有1：1000倍稀释的抗体溶液中4 ℃封闭过夜。一抗孵育结束后PBST洗涤条带三次，将条带转入辣根过氧化物酶标记的第二抗体溶液中，室温孵育2 hr。孵育结束后PBST洗涤3次，凝胶成像系统进行成像并保存图片。
2.5 数据处理
实验结果以 表示，所有统计图均由GraphPad Prism 6制作，利用GraphPad Prism 6求取半数抑制浓度（IC50值）。
2 结果
2.1 细胞球形态及体积结果
采用低黏附培养板培养法，培养5天后T24细胞能形成规则的细胞球，在1000 ~8000个/孔的接种范围内，细胞球直径随接种密度的增加而增大（图1）。通过测量细胞球长短径，计算细胞球体积，以细胞球体积对原始细胞接种数量作图可见，随着细胞接种数量的增加，细胞球体积逐渐增大，且呈现出一定的线性关系（图2）。
将T24细胞以5000个/孔的密度接种至低黏附培养板中，离心操作后可见单个细胞聚集在培养板底部。第三天时便可看到立体的三维细胞球已经形成，且细胞球直径可随着培养时间的增加而增大，细胞球可持续培养超过12天（图3）。以细胞球体积对培养时间作图可以发现，随着培养时间的延长，细胞球体积逐渐增大，第十天时细胞球体积最大，之后逐渐减小（图4）。
2.2 蛋白表达差异比较
由于局部缺氧，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α，Hif-1α）在实体瘤中往往存在着过表达现象，这对肿瘤细胞的增殖、转移、侵入、凋亡、糖代谢及药物敏感性都有至关重要的作用[7]。对二维培养及三维培养三天及五天的T24细胞中Hif-1α的表达情况进行Western blot分析发现，三维培养方式可以增加细胞内Hif-1α的表达，且具有时间依赖性关系（图5）。
2.3 药物敏感性差异比较
通过抗肿瘤药物顺铂及丝裂霉素处理二维及三维培养的T24细胞后，绘制药物浓度对细胞生长抑制率曲线。结果发现两种培养方式下药物对细胞的生长抑制率曲线形态相似，但有效药物浓度相差较大（图6A、图6B），三维培养方式下药物有效浓度明显高于二维培养。经计算三维培养方式下，丝裂霉素的IC50值为1.39 μg/mL，是二维培养方式（IC50 0.10 μg/mL）的13.9倍；顺铂的IC50值为18.29 μg/mL，是二维培养方式（IC 50 2.42 μg/mL）的7.6倍）（表1）。提示三维培养方式下T24细胞对抗肿瘤药物的敏感性降低。
3 讨论
三维培养方式中，细胞间的接触更为紧密，很好的再现体内肿瘤细胞生存环境及生长方式。因此，三维细胞培养较传统的二维培养方式具有更高的应用价值[8]。本研究利用低黏附培养板培养法建立了T24细胞的三维培养方法，具有快速，简便、高效的优点。该方法所形成的细胞球形态规则，细胞接种数量在1000个/孔至8000个/孔，培养5天时间，细胞球体积与初始细胞接种数量间具有较好的线性关系，细胞球体积随着细胞接种数量增加而增大。
目前临床上对于早期的膀胱癌患者，主要采取保膀胱手术，外加膀胱灌注化疗药物的方式进行治疗。膀胱灌注化疗的目的是杀死手术后残存的肿瘤组织，灌注药物不存在吸收和分布的过程，与肿瘤组织直接接触，在三维培养的肿瘤细胞球环境中加入受试物可以较好的模拟临床情况。此外，灌注化疗过程往往需要进行多次，而传统的二维培养方式很难进行重复给药操作，药物处理后继续培养72 hr已是极限。本研究中建立的T24细胞三维培养方式可进行长期培养，在0-10天内随着培养时间的延长细胞球体积逐渐增大。该模型很好的模拟了体内肿瘤细胞生长方式的同时，也满足了重复给药操作的需要。
在传统的二维培养方式中细胞呈平铺式生长，每个细胞都能跟培养基充分接触。在体内环境中，由于肿瘤细胞的快速生长，导致肿瘤组织外部存在着新生的血管为肿瘤细胞提供营养，而肿瘤组织内部由于缺少新生血管的存在，往往会造成内部的肿瘤细胞存在微缺氧及营养的情况，这种情况往往会诱导Hif-α的高表达[9]。Hif-1α可调节多种基因转录，使肿瘤细胞耐受低氧低营养环境的同时也降低了肿瘤细胞对药物的敏感性，进而使癌症患者在治疗过程中产生耐受反应，降低治疗效果[7]。在本研究中发现三维培养的T24细胞同样存在Hif-1α高表达的现象，说明该模型很好的再现了体内肿瘤细胞的生长方式。
在体外药物敏感性差异比较中，模拟了临床膀胱灌注给药作用时间通常为2hr的处理方式，二维及三维培养的T24细胞对顺铂及丝裂霉素的敏感性差异极大，IC50值相差接近10倍。推测其原因一方面是由于二维培养的细胞与药物溶液具有更大的接触面积，而另一方面的主要原因是三维培养的肿瘤细胞像体内的肿瘤组织一样，从外到内主要分为增殖层、静止层及坏死层[10]。增殖层对药物较为敏感，而内部肿瘤细胞由于基因表达差异，造成Hif-1α等肿瘤耐药相关调节基因的高表达，进而引起三维培养的T24细胞对抗肿瘤药物不敏感。因此，推测进行体外膀胱灌注化疗药物筛选时采用三培养模型可能更符合临床特点。
综上所述，本研究采用低黏附培养板培养法建立的T24细胞三维培养模型体外再现体内肿瘤细胞的生长方式，具有操作简便、快速，预测准确率高的优点，是理想的膀胱癌治疗药物早期开发体外活性筛选模型。
参考文献
[1] Riethdorf S, Soave A, Rink M. The current status and clinical value of circulating tumor cells and circulating cell-free tumor DNA in bladder cancer [J]. Transl Androl Urol, 2017, 6(6):1090-1110.
[2] Dialla P O, Chu W O, Roignot P, et al. Impact of age-related socio-economic and clinical determinants of quality of life among long-term breast cancer survivors.[J]. Maturitas, 2015, 81(3):362-370.
[3] 钟惟德. 膀胱癌流行病学[M]. 人民卫生出版社, 2012.
[4] Sittampalam S, Eglen R, Ferguson S, et al. Three-Dimensional Cell Culture Assays: Are They More Predictive of In Vivo Efficacy than 2D Monolayer Cell-Based Assays? [J]. Assay & Drug Development Technologies, 2015, 13(5):254.
[5] Breslin S, O’Driscoll L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery [J]. Drug Discovery Today, 2013, 18(5-6):240-249.
[6] Ravi M. Applications of Three-Dimensional Cell Cultures in the Early Stages of Drug Discovery, Focusing on Gene Expressions, Drug Metabolism, and Susceptibility.[J]. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 2017, 27(1).
[7] Warfel N A, El-Deiry W S. HIF-1 Signaling in Drug Resistance to Chemotherapy[J]. Current Medicinal Chemistry, 2014, 21(26):3021.
[8] Breslin S, O'Driscoll L. The relevance of using 3D cell cμLtures, in addition to 2D monolayer cμLtures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance[J]. Oncotarget, 2016, 7(29):45745-45756.
[9] Snell CE, Turley H, McIntyre A, et al. Proline-hydroxylated hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) upregulation in human tumours.[J]. Plos One, 2014, 9(2):e88955.
[10] Sant S, Johnston P A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.[J]. Drug Discovery Today Technologies, 2017. Mar; 23: 27–36.
论文作者:林鹤1，刘兆泉1，刘瑛1，焦佳媛2，王婉秋2，任利翔1*
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第12期
论文发表时间:2019/2/26
标签：细胞论文; 药物论文; 肿瘤论文; 膀胱癌论文; 方式论文; 球体论文; 模型论文; 《世界复合医学》2018年第12期论文;