一、构巢曲霉奎尼酸脱氢酶基因qutB在大肠杆菌中的克隆与表达（论文文献综述）
郭伟[1]（2020）在《代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究》文中研究说明天然产物是药物、食品添加剂的主要来源之一,作为高附加值原材料被广泛应用于食品、医药、化妆品行业。目前,植物提取法和化学合成法是在天然产物工业生产中常用的方法。传统的植物提取法效率低、分离工艺复杂,而且,植物的生长受土壤质量、气候以及其他外部因素限制。化学合成法难以实现从头合成、所需的反应条件苛刻、容易造成环境污染。不同于以上两种天然产物获得方法,通过生物合成法可利用微生物细胞工厂以廉价的碳源作为原料生物合成高附加值目标化合物,该法具有低成本、高效、环保及可持续等优势。近年来,生物合成法受到研究者们的广泛关注。在合成生物学理论的指导下,采用分子生物学技术,对微生物细胞进行系统的代谢工程改造,实现微生物细胞工厂高效生产天然产物是满足日益增长的天然产物市场需求的可行策略。迄今为止,实现以微生物作为细胞工厂生物合成芳香类化合物的生产方式在工业化生产中的应用依然面临挑战。酪醇是一种来源于橄榄的芳香类化合物,具有抗氧化、消炎等功效,同时,也是重要心血管药物红景天苷的直接前体。红景天苷被广泛应用于医药、食品、化妆品行业。但是,目前通过代谢工程改造酿酒酵母用于酪醇及红景天苷的生物合成,所获得的总产量小于2 g/L。为了实现酿酒酵母高效生物合成酪醇及红景天苷,在本研究中,我们开发了一系列理性的代谢工程改造策略,并且通过对酿酒酵母工业菌株进行系统的代谢工程改造,显着地提高了酪醇及红景天苷的产量。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成酪醇比较分析了两条外源的可将酪氨酸转化为酪醇的生物合成途径TDC-TYO途径和PcAAS途径对酿酒酵母生物合成酪醇的影响。研究结果表明,PcAAS途径比TDC-TYO途径更有助于酿酒酵母中酪醇的生物合成,导入PcAAS途径的酿酒酵母菌株的酪醇产量相对于对照菌株提高约1 17倍。由于酿酒酵母存在Crabtree效应,以葡萄糖为碳源培养时会产生大量的副产物乙醇。因此,为了降低乙醇分支途径的碳流量以提高目标化合物酪醇的产量。我们通过敲除酿酒酵母乙醇分支途径的主要丙酮酸脱羧酶基因PDC1,使酪醇产量提高了 18.53%。此外,为了增强莽草酸途径的终产物——分支酸向酪醇生物合成方向的碳流量,我们在pdc1位点分别异源表达了大肠杆菌来源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的双功酶基因EctyrA及其酪氨酸反馈抑制不敏感突变体EctyrAM53I/A354V,酪醇产量分别提高了 33.59%和35.18%。为了促进酪醇生物合成的工业化应用进程,实现以酿酒酵母工业菌株作为出发菌株构建高效生物合成酪醇及其衍生物的微生物细胞工厂。首先,为了方便代谢工程改造,我们对多株二倍体酿酒酵母工业菌株进行了单倍体分离实验,获得了 4株来源于不同菌株具有不同配型的单倍体工业菌株。基于菌株的酪醇生产水平,通过筛选获得了酪醇产量较高的单倍体酿酒酵母工业菌株HLF-Dα。与前期实验中使用的酿酒酵母实验菌株相比,酿酒酵母工业菌株的鲁棒性更好,其发酵性能更加稳定。通过将前期构建的代谢工程改造策略应用到了 HLF-Dα中,获得了高产酪醇酿酒酵母工业菌株DA-1,该菌株在72 h摇瓶培养后,酪醇产量达到742.02±22.45mg/L,与出发菌株HLF-Dα相比,提高约11倍。该菌株被作为进一步代谢工程改造酿酒酵母高效生产酪醇的平台菌株。随后,我们对酿酒酵母中酪醇生物合成的前体之一——赤藓糖-4-磷酸（Erythrose-4-phosphate,E4P）的生物合成途径进行了优化。首先,我们尝试通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1以增强酿酒酵母内源的E4P生物合成途径-磷酸戊糖途径（Pentosephosphatepathway,PP途径）。研究结果显示,过表达ZWF1后,酪醇产量和生物量均没有显着变化。我们推测,由于磷酸戊糖途径较为复杂,并且存在许多已知和未知的限速反应步骤,通过改造内源的E4P生物合成途径很难实现酪醇产量的提高。随后,我们寻找到一条外源的基于磷酸酮醇酶（Phosphoketolase,Xfpk）的E4P生物合成途径——Xfpk途径,通过对两条途径的热动力学参数进行比较分析,我们发现与PP途径相比,以葡萄糖作为碳源生物合成E4P时,通过Xfpk途径仅需4步,其最大反应驱动力约为PP途径的2倍,且不需要耗能及辅因子的参与,并且,其理论转化效率为PP途径的2倍。以上动力学分析结果表明,Xfpk途径是一条潜在的高效的E4P生物合成途径,可被应用于提高酿酒酵母酪醇及其他芳香类化合物的生物合成。通过将来源于青春双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Baxfpk在酿酒酵母的不同位点（PHA2、XKS1、GRE3）进行表达,我们发现,在PHA2位点表达Baxfpk优于XKS1和GRE3位点,更有助于酪醇产率的提高。此外,我们对不同来源的Xfpk酶进行了筛选,分别将来源于短双歧杆菌和牙齿双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Bbxfpk和Bdxfpk在PHA2位点进行了表达,发现Bbxfpk表达菌株的酪醇产率最高。该研究结果表明,Xfpk途径的导入是提高酿酒酵母酪醇的产量的有效策略,与BaXfpk和BdXfpk相比,BbXfpk的导入更有助于提高酿酒酵母酪醇生物合成。由于在Xfpk催化底物果糖-6-磷酸（Fructose 6-phosphate,F6P）生成E4P时,会生成1分子乙酰磷酸（Acetyl-phosphate,AcP）,AcP可被酿酒酵母内源的甘油磷酸酶GPP1p和GPP2p催化生成乙酸,从而造成发酵过程中乙酸的积累。过量的乙酸积累会对酿酒酵母的发酵产生抑制作用。磷酸转乙酰酶Pta可催化AcP可逆地转化为乙酰辅酶A,缓解乙酸积累对菌株发酵产生的抑制作用。因此,我们敲除了酿酒酵母中主要的甘油磷酸酶基因GPP1,并异源表达了来源于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）的磷酸转乙酰酶基因Ckpta。但是,研究结果表明,导入Ckpta后不仅无法缓解乙酸积累,而且不利于酪醇的生物合成。由于莽草酸途径的关键酶基因受到产物芳香类化合物的反馈抑制,限制了芳香类化合物产量的进一步提高。因此,我们构建了解除芳香类氨基酸反馈抑制的突变体AR04K229L和AR07G141S,并将其插入在酿酒酵母中ARO3位点进行表达。研究结果表明,通过突变解除芳香类氨基酸对莽草酸途径的反馈抑制后,酪醇产量提高了 27.54%。最终,我们通过葡萄糖分批补料发酵实验,获得了 8.37g/L的酪醇产量,该产量是目前已报道的酿酒酵母生物合成酪醇的最高产量。（2）代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成红景天苷酪醇是红景天苷,羟基酪醇等心血管药物合成的直接前体。目前,红景天苷已被广泛应用于医药,食品及化妆品等行业。基于酪醇高产工程菌株DA-9,我们拟通过进一步代谢工程改造,构建高效生产红景天苷的酿酒酵母工程菌株。通过在酪醇高产菌株DA-9的TRP3位点表达来源于拟南芥的葡萄糖苷转移酶基因ugt85a1,构建了酪醇向红景天苷的转化途径,获得了产红景天苷菌株DA-91 菌株。经葡萄糖分批补料发酵实验,该菌株在发酵 216 小时后,其酪醇和红景天苷产量分别达到8.47 g/L和1.82 g/L,这是目前为止,以酿酒酵母为底盘细胞获得的最高产量。
区晓阳[2]（2020）在《具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌的构建及其应用研究》文中研究说明大肠杆菌是基因工程领域中使用最广泛的表达宿主菌之一,在发酵过程中存在杂菌污染和噬菌体侵染的问题,目前仍缺乏有效的解决策略。为解决上述问题,本研究以大肠杆菌为研究对象,旨在构建一株能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌工程菌。在大肠杆菌中增加两条新的稀有氮磷源代谢途径（抗杂菌系统）,其表达的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶能专一性催化甲酰胺和亚磷酸盐分别成为铵根离子和磷酸盐作为大肠杆菌生长的氮源和磷源,以防止杂菌污染。在此基础上引入抗噬菌体系统（CRISPR/Cas9）,赋予大肠杆菌工程菌抵抗噬菌体的能力。构建得到的具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌将具有非常巨大的应用潜力。本课题组通过对具有自主知识产权的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis CS0611的转录组进行分析,发现该菌的基因组中含有甲酰胺酶基因,并利用PCR技术扩增得到了该基因的全长序列;另外,通过菌种筛选得到一株能利用亚磷酸盐的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae strain OU07,并成功克隆了亚磷酸脱氢酶基因的全长序列。详细地分析了两种酶基因及对应蛋白的序列信息和催化结构,发现甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因的完整开放阅读框分别由1014 bp和1011 bp核苷酸组成,并分别编码337和336个氨基酸。其中,来源于P.pasadenensis CS0611的甲酰胺酶属于腈水解酶超家族,为六聚体,包括3个AB二聚体,每个二聚体均由A和B单元组成;该蛋白的二级结构由24.6%的α螺旋,27.0%的β折叠和48.4%的转角组成;Glu60、Lys129和Cys162构成了该甲酰胺酶与甲酰胺结合的催化三联体。来源于K.pneumoniae strain OU07菌株的亚磷酸脱氢酶属于D-2-羟酸脱氢酶家族,该蛋白的二级结构由35.4%的α螺旋,11.9%的β折叠和52.7%的转角组成,且该序列与来源于Pseudomonas stutzeri WM88的亚磷酸脱氢酶序列具有99.4%的相似性。将甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因分别插入表达载体,构建得到的重组质粒分别转化入大肠杆菌,均可实现高效表达。然后总蛋白经GST标签柱分离纯化后,得到纯的重组FmdA和重组PtxD,继而系统地探讨了两种酶的酶学性质。研究发现,重组FmdA和重组PtxD的最适反应温度分别为30 ℃和35 ℃,最适反应pH分别为6.5和7.0。在最适反应条件下,重组FmdA和重组PtxD的比活力分别为10.0 U/mg和10.8 U/mg。通过对两种酶的稳定性进行研究,重组FmdA在温度低于40 ℃和pH为6-8时的稳定性良好;重组PtxD在温度低于30 ℃和pH为5-8时稳定性良好。此外,金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+和表面活性剂SDS对重组FmdA催化甲酰胺的水解具有明显的抑制作用;金属离子Li+、Zn2+、Mo2+和Fe3+对重组PtxD催化亚磷酸盐氧化为磷酸盐产生了明显的抑制作用,Cu2+、Pb2+和表面活性剂SDS完全或几乎完全抑制该酶的催化活性。另外,EDTA对两种重组酶均没有明显的抑制作用,这表明这两种酶可能均属于非金属酶。酶学性质研究表明,重组FmdA和重组PtxD的最适温度和最适pH都接近大肠杆菌的最适生长条件。本文采用融合表达和共表达两种方式把甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因构建到同一个重组质粒（作为抗杂菌系统）中,于大肠杆菌中成功表达,使得到的重组菌在营养缺陷型MOPS培养基中能利用甲酰胺和亚磷酸盐作为氮源和磷源进行生长繁殖。结果表明,以融合表达构建方式得到的重组菌生长速度最快且合成绿色荧光蛋白的荧光强度最大。该重组菌在营养缺陷型MOPS培养基中能高效抵抗杂菌的污染,在培养过程中始终为优势菌。随后,向已具有抗杂菌系统的重组菌中导入CRISPR/Cas9系统（抗噬菌体系统）的质粒,得到的加强型大肠杆菌在LB液体培养基中能高效抵抗T7噬菌体的侵染,但在营养缺陷型MOPS培养基中生长缓慢（第6天达到稳定期）且抵抗噬菌体效率有所降低。为加快加强型大肠杆菌工程菌的生长速度,本研究对调控融合基因的启动子进行了优化。研究发现,中等强度的组成型启动子（BBa＿J23101和BBa＿23106）最有利于工程菌的生长,能使工程菌的生长速度大幅加快。另外,通过将具有相同复制子的质粒进行整合,使双系统的质粒种类减少到能互相兼容的2种,结果表明优化后的加强型大肠杆菌在营养缺陷型MOPS培养基中培养约8 h后达到稳定期,相比优化前的生长速度提高了7.5倍,且能抵抗浓度高达2×107 PFU/m L的T7噬菌体侵染,并且保持高效的蛋白合成能力。以加强型大肠杆菌工程菌为宿主菌,高效表达了3种酶基因（环氧化物水解酶基因、羰基还原酶基因和脂肪酶基因）,并以能表达环氧化物水解酶的加强型大肠杆菌全细胞为催化剂动力学拆分外消旋邻甲苯基缩水甘油醚制备对映体纯的（R）-邻甲苯基缩水甘油醚。研究表明,在反应温度为25 ℃和pH 7.0的条件下,利用E.coli Rob3全细胞动力学拆分20 m M rac-o-GMPE制备（R）-o-GMPE,在12 min的反应时间内,产物的最大产率和ee分别为23.0%和99.2%,湿细胞比活性为6416.7 U/g。另外,为减轻底物对催化的抑制作用和产物对细胞的毒害作用,通过采用体积比为0.5:1的水缓冲液和乙酸丁酯双相体系动力学拆分3 M rac-o-GMPE,使初始反应速率提高到549.7 m M/h,最终得到（R）-o-GMPE的ee为91.7%,产率为17.1%,时空收率为3.66 g/L/h。
隋雨菲[3]（2020）在《黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索》文中研究指明丝状真菌黑曲霉因其杰出的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。系统理解黑曲霉发酵过程中的代谢调控机制对通过代谢工程手段提高这一细胞工厂的性能具有重要意义。本论文分别从基因组学、过程转录组学和辅因子代谢工程三个角度对黑曲霉高效产酶机制提出了合理的解释并对产酶性能进行了优化。基于产孢异常与高蛋白分泌之间的潜在关联,本研究对一株高产糖化酶的无孢黑曲霉LDM3菌株进行了全基因组重测序,并与产糖化酶模式菌株CBS 513.88相比较,从基因组水平探索该工业菌株高产酶的分子机制。基因组装配结果揭示LDM3菌株中存在大范围的染色体重排,表明基因组结构发生了重大变化。比较基因组学分析显示,457个LDM3菌株的特异性基因主要参与氧化还原途径,蛋白质转运和蛋白质修饰过程。非同义突变主要分布于与蛋白质翻译、修饰、代谢、分泌、能量产生和转化密切相关的656个基因上,表明这些变异可能是影响LDM3中糖化酶得率的主要因素。对于与蛋白质合成和分泌能力增强密切相关的无孢表型,生物信息学和共表达网络分析预测全局转录抑制因子tupA的非同义突变是造成无孢表型的主要原因。基因功能实验表明,敲除tupA导致菌体生长速率降低,与参考菌株相比产孢减少了近35%,但胞外蛋白分泌量显着增加了 65%。证实抑制孢子形成可成为提高黑曲霉蛋白分泌的有力手段。氧限制条件是工业化糖化酶生产的重要策略。本研究以糖化酶高产菌DS03043为研究对象,从转录组水平揭示糖化酶发酵生产过程中细胞对氧限制条件的全局响应变化。通过比较黑曲霉补料发酵过程不同阶段的时序转录组数据,共识别到515个差异表达基因。基因表达模式聚类分析揭示,在细胞生长受限后,菌体蛋白合成减弱,而脂类分解代谢上调,部分NADPH途径增强,糖化酶及其原料氨基酸的合成上调,细胞在能量和前体物质分配上向糖化酶合成发生了倾斜,从而使糖化酶在能量供应受限的情况下仍能高效合成,并表现为得率上升。此外,甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）的转录因子SrbB持续显着上调,表明SrbB在黑曲霉适应氧限制条件的转录调控中起到重要作用。根据糖化酶氧限制发酵的过程转录组分学分析发现辅因子NADPH再生可能是影响黑曲霉产酶的限制性因素。基于实验室前期升级的黑曲霉基因组代谢网络模型（GSMM）和文献数据预测,以糖化酶低产菌即黑曲霉模式菌AB4.1为宿主,在Tet-on开关的调控下分别构建9种NADPH再生系统,考察优化NADPH供应对黑曲霉产酶的影响。在摇瓶水平上分析NADPH浓度与目标蛋白合成的关系,发现NADPH再生系统虽然小幅提高了胞内NADPH水平但是对蛋白合成的影响并不显着。因此,推测低产糖化酶菌株中还原力的供应并不是蛋白合成的瓶颈。本实验还从另一个角度探究抑制胞内还原力积累是否阻碍蛋白的合成。通过对NADPH氧化酶调控子riaA的研究,发现过表达riaA没有明显阻碍NADPH的积累,但却严重抑制了糖化酶合成基因glaA的表达。共表达网络分析证明riaA不仅通过调节辅因子代谢还通过抑制蛋白合成、运输等对产酶起到复杂的负调控作用。据报道,体外纯化的Cas9蛋白和体外合成的sgRNA可实现高效的基因编辑并降低脱靶效率。论文对黑曲霉体外CRISPR/Cas9基因编辑体系进行了优化,大大提高了黑曲霉基因靶向编辑的成功率,成功地获得了糖化酶高产菌株B36的尿嘧啶缺陷型突变株YS20.2。为后续在糖化酶高产菌株中开展辅因子工程研究提供了平台。代谢工程研究经典的“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环被越来越多地用于菌株理性设计。为优化黑曲霉细胞工厂的产酶性能,论文进而以上述获得的尿嘧啶缺陷型糖化酶高产株YS20.2为出发菌株,开展同低产菌中相似的辅因子代谢工程策略,利用DBTL方法探究黑曲霉中高效的辅因子调控策略。论文发现,相比于低产菌株,在高产菌株中优化NADPH供应可有效提高蛋白的生产能力,说明模型预测具有菌株依赖性,新产生的NADPH可能更多地流向糖化酶合成而非用于细胞生长。为阐明NADPH扰动引起的胞内代谢适应机制,我们从中选择了三株在摇瓶水平上蛋白合成能力最强的过表达株,即葡萄糖磷酸脱氢酶（G6PDH）、磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）和NADP+依赖型苹果酸酶（NADP-ME）过表达株,进一步开展了麦芽糖限制的反应器水平的恒化培养。不同的遗传扰动对NADPH水平的调控作用以及对细胞资源分配的影响差异很大。过表达G6PDH使NADPH仅微弱积累,但过表达6PGDH和NADP-ME分别使胞内NADPH水平显着提高了 45%和66%,说明6PGDH和NADP-ME是黑曲霉主要的还原力供应途径。值得注意的是,过表达G6PDH使蛋白得率明显降低,但6PGDH和NADP-ME再生系统分别将蛋白合成能力显着提高了 60%和30%。此外,三株过表达株与对照株相比分别呈现不同的代谢图谱,过表达NADP-ME相比调控PP途径引起了更广泛的代谢扰动。本论文首次在黑曲霉中证实NADPH再生是糖化酶高产菌株中蛋白合成的瓶颈,优化胞内NADPH水平可显着提高细胞工厂酶蛋白产率。综上所述,本文通过对具有无孢表型的黑曲霉工业菌株的基因组序列分析,识别了与高产酶相关的基因组差异,并通过基因功能实验揭示了影响菌体产孢和蛋白分泌能力的一个关键基因tupA,基因组数据分析与基因工程实验相结合为基因功能的推断提出更强有力的证据;首次通过转录组学分析描绘了菌体在适应氧限制发酵过程中转录组水平的全局响应机制;,针对前期多组学分析预测的产酶细胞工厂主要限制因素之一——NADPH,基于DBTL循环开展了系统代谢工程研究,首次在黑曲霉中证实强化部分NADPH合成途径,尤其是6PGDH和NADP-ME,可显着提高NADPH供应水平,并提高细胞工厂酶蛋白产率,NADPH辅因子代谢工程研究取得初步成效。以上工作从菌形、全局代谢尤其是NADPH调控的角度为进一步优化黑曲霉产酶细胞工厂的效率打下了坚实基础。
徐家盛[4]（2018）在《大肠杆菌中EP-bifido途径的构建用于高效生产乙酰辅酶A衍生物》文中研究指明如何使生物制造产业更加经济、高效,减少对粮食及其他生物质资源的使用,是生物制造面临的严峻问题。天然代谢机制较低的碳转化率限制了由底物转化成期望的生物产品过程的经济效益。在天然微生物的代谢系统中,葡萄糖通过糖酵解例如EMP途径、ED途径和这些途径的变体分解成丙酮酸,进而在氧化脱羧酶的作用下脱下一个碳原子变为只拥有两个碳原子的乙酰辅酶A（AcCoA）损失三分之一的碳原子,把以AcCoA为前体的产物的碳转化率的理论极限限制在66%。在微生物的其他很多代谢途径中,类似的碳损失的问题也普遍存在,例如戊糖磷酸途径。为了提高碳转化率,我们将大肠杆菌的EMP途径、PP途径和来自青春双歧杆菌的双歧途径结合在一起,设计构建了人工的EP-bifido途径,可以以葡萄糖为底物产生比来自内源糖酵解途径更多的AcCoA,以提高碳的转化率和减少二氧化碳的释放。该途径设计的关键在于引入了一种来自青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）的双功能磷酸转酮酶（Fxpk）,这种双功能的磷酸转酮酶Fxpk不仅仅可以催化6-磷酸果糖（F6P）转变为4-磷酸赤藓糖（E4P）和乙酰磷酸（AcP）,同时还可以催化5-磷酸木酮糖（X5P）裂解为3-磷酸甘油醛（G3P）和AcP。生成的E4P和G3P可以经由一系列的碳原子重排完全转化为AcCoA而在此过程中没有碳损失。该途径的另一个关键在于对于二磷酸酶的运用,二磷酸酶提供了该途径的第二个不可逆的推动力。PP途径中的氧化部分,一分子葡萄糖进入细胞变成6-磷酸葡萄糖,经过一系列反应,形成5-磷酸核酮糖,这个过程中伴随着一分子CO2和两分子NADPH的产生。磷酸戊糖途径是一个高效的还原力生成途径,其生成还原力这一特点恰好可以弥补f/xpk反应还原力的短板,同时磷酸戊糖途径氧化环节产生的5-磷酸核酮糖恰好可以作为碳重排部分的中间体。我们首先对含有EP-bifido途径的工程菌的基本情况进行了检测,发现相比于对照菌,工程菌产生了更少的副产物。13C代谢流分析成功的证明了 EP-bifido途径在代谢途径通量与对照菌株的差别,验证了我们的猜想。相比于原始对照菌株,发酵过程中CO2的释放显着降低。DH5α（pCDF）的CO2生产速率在7h达到最大值21mL/h,而DH5α-EP（pFF）14h的CO2生产速率最大值仅为5.2mL/h。工程菌在CO2速率方面也比较低,具有较大的优势。然后我们分别以聚羟基丁酸酯（PHB）、甲羟戊酸（MVA）和脂肪酸的生产作为例子,证明了 EP-bifido途径的有效性。通过EP-bifido途径,PHB的碳转化率从26%提高到63.7%,脂肪酸从9.17%提高到14.36%,MVA提高到64.3%（达到最大理论转化率的96%）。该策略可以用于以AcCoA为前体的化合物的生物生产,也可能被利用到其他种类的微生物中。
樊婧婧[5]（2018）在《强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成》文中认为β-香树脂醇是一种五环三萜化合物,也是其它齐墩果烷型三萜,如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗菌、抗病毒等良好的药学特性。通过代谢工程与合成生物学的方法已在酿酒酵母中成功实现了β-香树脂醇的合成,但由于前体物供应不足、有毒中间代谢产物的积累及反馈调节等因素导致产量较低,大大限制了其规模化生产和广泛应用。针对酿酒酵母合成β-香树脂醇中重要起始前体物乙酰辅酶A的供应问题,本研究采用代谢工程策略,强化细胞质乙酰辅酶A供应,同时过表达3-羟-3-甲基-戊二酰辅酶还原酶和合成β-香树脂醇所涉及的ERG系列基因以提高鲨烯合成,从而达到β-香树脂醇在酿酒酵母体内的高效合成。研究结果如下:（1）在增加酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A含量提高终产物β-香树脂醇产量方面,主要从强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径和构建外源乙酰辅酶A途径两方面入手。强化酿酒酵母内源乙酰辅酶A途径包括:（1）采用质粒表达方式,过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因ADH2,使乙醇更多地流向乙酰辅酶A合成途径,以用于终产物β-香树脂醇合成,单位细胞β-香树脂醇产量达3.97mg/g,为出发菌株的1.52倍;（2）在酿酒酵母基因组HO位点过表达乙醛脱氢酶基因和乙酰辅酶A合酶基因ACS1和ACS2,强化细胞质丙酮酸脱氢酶支路,β-香树脂醇产量分别达到30.4和31.24mg/L,分别为出发菌株的1.3倍和1.34倍。但以1分子葡萄糖为底物,通过丙酮酸脱氢酶支路合成2分子乙酰辅酶A,净消耗2分子ATP,影响了以乙酰辅酶A为前体的β-香树脂醇的生产效率;由于酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A合成途径需要消耗较多的ATP,导致乙酰辅酶A合成效率低,为了减少或消除细胞质乙酰辅酶A合成的ATP消耗,研究者开始在酿酒酵母中引入外源乙酰辅酶A合成途径。在酿酒酵母基因组构建的外源乙酰辅酶A合成途径包括:（1）通过引入丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二轻硫辛酸脱氢酶三个外源基因,在酿酒酵母中成功构建丙酮酸脱氢酶途径,结合敲除戊糖磷酸途径（主要生成NAPDH）的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,使NADP+更多地被丙酮酸脱氢复合体利用,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到33.2mg/L,为出发菌株的1.49倍;（2）通过引入构巢曲霉密码子优化的柠檬酸裂解酶基因,在酿酒酵母中成功构建柠檬酸裂解酶途径,直接催化细胞质柠檬酸合成乙酰辅酶A。外源补加柠檬酸,有效提高了β-香树脂醇的产量,达到31.05mg/L,为出发菌株的1.53倍;（3）通过引入分别来自大肠杆菌、肠膜明串珠菌和克氏梭菌的乙酰乙醛脱氢酶、木酮糖特异性磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶,在酿酒酵母中成功构建了两条异源乙酰辅酶A合成途径,并通过表达来自玫瑰杆菌属细菌消耗NADH的和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶提升了途径的NADH平衡,结果有效提高了β-香树脂醇的产量,达到39.49mg/L,为出发菌株的1.95倍。结合进一步敲除柠檬酸合酶以阻止细胞质乙酰辅酶A流失,进一步提高了β-香树脂醇产量,达到69.64mg/L,为出发菌株的3.34倍;（2）强化鲨烯合成方面:过表达甲羟戊酸途径的限速酶基因t HMG1强化鲨烯合成,单位细胞β香树脂醇产量达4.19mg/g,为出发菌株的1.7倍;最后,同时过表达酿酒酵母的乙醇脱氢酶ADH2和t HMG1有效提高了β-香树脂醇的产量,达到32.01mg/L,为出发菌株的1.37倍;（3）发酵优化方面,将高产β-香树脂醇的菌株BA40进行葡萄糖补料发酵,β-香树脂醇产量达到272.42mg/L,为摇瓶发酵的3.91倍,为目前报道的运用酿酒酵母合成β-香树脂醇的最高产量。
卞光凯[6]（2017）在《萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成》文中研究表明萜类化合物是一类广泛存在于自然界中具有高度结构多样性的化合物,在人类日常生活中发挥着举足轻重的作用。目前研究人员已通过代谢工程及组合生物合成策略,利用微生物发酵方式实现了多种萜类化合物的商业化生产。其中一些化合物被广泛应用于香水生产行业、保健品行业、农业生产领域以及医疗行业。在自然界中,萜类化合物可经2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP）和甲羟戊酸（mevalonate,MVA）途径合成,生物体可利用这两个途径以及异戊烯基焦磷酸异构酶（Idi）合成萜类化合物前体物质异戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP）和烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）,随后经异戊烯转移酶（prenyltransferases,PT）催化合成不同链长的异戊二烯单元。并经萜类合酶（terpene synthases,TPSs）催化,合成不同类型的萜类化合物。因而构建一个高效的IPP和DMAPP合成平台是实现萜类化合物高效合成的关键。为此,我们利用课题组开发的定向代谢工程策略,通过过表达MVA途径,在大肠杆菌（Escherichia coli）体内构建了合成萜类化合物的平台。并以紫杉二烯为研究对象,通过一步构建,成功地在 E.coli体内实现了紫杉二烯的高效合成。为其它二萜类化合物在E.coli体内的高效合成奠定了基础。随后将这一策略应用到丝状真菌交链格孢（Alternaria alternata）中,实现了紫杉二烯的稳定合成。在构建A.alternata萜类化合物合成平台之前,我们首先建立了基于农杆菌转化（ATMT）的A.alternata TPF6遗传操作系统。该系统的建立使得我们对其进行代谢工程改造成为可能。为了实现对外源基因的表达进行较为精确的控制,我们借助于荧光显微镜以及RT-PCR研究了 TPF6体内6个外源启动子的强度。随后将其应用于TPF6的代谢工程改造工作中去,在过表达了外源的Idi、tHMG1以及TS后,我们在突变株A.alternata GB127中成功地检测到了 61.9±6.3μg/L的紫杉二烯。这是首次报道在丝状真菌体内实现紫杉二烯的稳定合成,为利用微生物合成紫杉醇提供了一个新的思路。ATMT方法的建立以及外源启动子强度的验证为我们对其进行进一步的代谢工程改造提升紫杉烷类化合物产量奠定了基础。此外,我们还构建了高效供给萜类化合物前体物质的在酿酒酵母（Saccharommyces cerevisiae）平台,为萜类化合物在S.cerevisiae体内的高效合成奠定了基础。为了拓展定向代谢工程指导的高产萜类化合物平台的应用范围,我们进而将该平台用于萜类化合物的挖掘。萜类环化酶（terpene cyclase）能够催化含有不同链长异戊二烯单元的底物合成单环或者多环的萜类化合物。随后这些合成的萜类化合物骨架在不同的部位经一系列的加氧酶、甲基转移酶,酰基转移酶以及糖基转移酶等酶催化一系列后修饰步骤形成数以千计的萜类化合物。因而,挖掘新的萜类环化酶是拓展萜类化合物结构多样性的一个决定性步骤。然而,目前人们对该元件以及萜类化合物生物合成途径中的其它元件的挖掘还远远不足,这也直接阻碍了那些高附加值的萜类化合物的代谢工程研究和商业化生产。基因组测序及注释为研究人员提供了大量未知功能的萜类合酶。这其中许多萜类环化酶具有底物和反应杂泛性（promiscuous）,能够接受不同链长的底物合成种类丰富的萜类化合物。然而,传统的基因组挖掘（genome mining）方法通常受限于异源表达宿主的产物合成能力,仅能对其中主要的产物进行挖掘鉴定,这在很大程度上掩盖了这些萜类环化酶的生物合成潜力。因而,开发一个高效的萜类化合物生物合成元件及其产物挖掘平台,对一些潜在的新的萜类环化酶进行研究从而发现新的萜类化合物是加速萜类化合物研究进程的关键所在。为此,本研究对丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012菌株（Fusariumgraminearum J1-012）的基因组信息进行生物信息学分析,从基因组中挖掘I型多功能萜类环化酶。对其进行克隆并开展体外实验对其生物学功能进行验证。结果显示,FgMS和FgGS两个酶具有显着的底物和反应杂泛性,能够以GPP、FPP、GGPP以及GFPP为底物合成多种类型的萜类化合物。为了充分了解这两个具有底物及反应杂泛性的萜类合成酶的萜类化合物合成能力,我们构建了一个含有3个不同模块的萜类化合物生物合成平台。第一个模块为基于MVA途径高产平台,该平台能够提供尽可能多的IPP和DMAPP,用于后续不同类型萜类化合物的生物合成。第二个模块为含有不同来源的能高效合成聚异戊烯焦磷酸的法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）,香叶基香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）以及香叶基法尼基焦磷酸合成酶（GFPPS）的文库。第三个模块为多功能的萜类合酶。以此为基础,我们构建了 6个突变株来充分挖掘FgMS和FgGS的萜类化合物合成能力。最终结果显示,他们能够合成多达52种单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜。我们对其中的12个产物进行鉴定,结果显示,其中化合物1、2、5,7-10为新的二萜和二倍半萜化合物,这其中包含有3个新骨架化合物。显示了这两个酶强大的萜类化合物合成能力以及该组合生物合成平台的高效性。随后,为了进一步增加产物的多样性,我们对其中的FgMS进行同源建模,并对其活性口袋附近的潜在的非保守的氨基酸位点进行分析及定点突变。体外研究结果显示F65L和F159G能够合成6个潜在的新的二倍半萜化合物。随后我们通过体内发酵实验获得了化合物56并鉴定其为新的二倍半萜类化合物。这一组合生物合成结合酶的理性改造策略使得我们充分地挖掘了 FgMS和FgGS的生物合成潜力,加速了新的萜类化合物的挖掘进程。此外,我们还开发了基于酿酒酵母平台的萜类化合物生物合成元件及产物挖掘的方法。为此,我们以过表达了 tHMG1的S.cerevisiaeYZL141为平台,过表达了法尼基焦磷酸合成酶（ERG20）和F.graminearum J1-012来源的另一个具有底物和反应杂泛性的萜类合酶FgFS,使其能够高效合成FgFS的产物。发酵结果显示,FgFS能够合成10种倍半萜化合物。对其中8个主要产物进行鉴定,结果显示,化合物1-3为新骨架化合物,其中化合物2和3为顺反异构体体。化合物4为具有重要应用价值的橙花叔醇。同时,结合同位素标记实验阐明了新骨架化合物1-3的合成机理。这一系统的代谢工程辅助天然产物挖掘工作的开展为其它萜类合酶的功能验证以及新骨架化合物的挖掘提供了一个成熟的解决方案。上述实验表明,将组合生物合成、代谢工程、酶的理性改造等策略用于萜类化合物生物合成有关基因的功能验证及产物的挖掘是一个非常有意义的工作,这将在很大程度上加快萜类环化酶元件及其产物的挖掘速度并以及加深我们对萜类环化酶的认识。
郝庆[7]（2016）在《米曲霉酰基辅酶A结合蛋白基因的克隆鉴定》文中进行了进一步梳理米曲霉是我国传统酿造酱、酱油和酒类的生产菌种,已有一千多年的安全应用历史,是GRAS级别的安全菌株,也是较理想的异源蛋白表达宿主。虽然米曲霉的基因组测序于2005完成,但有很多重要功能基因还有待于进一步的诠释和挖掘,酰基辅酶A结合蛋白基因（acbp）就是需要研究的重要基因之一。本文为了克隆鉴定米曲霉菌株中acbp基因并研究酰基辅酶A结合蛋白（acy-CoA-binding protein,ACBP）的功能性质,本课题开展了以下几方面工作:1)提取米曲霉菌株的总RNA,反转录合成acbp cDNA,构建大肠杆菌原核表达载体（PMAL-c4x-acbp）,实现重组ACBP在大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞表达并使用MBP亲和层析柱纯化重组的米曲霉酰基辅酶A结合蛋白（MBP-AoACBP）,SDS-PAGE结果显示MBP-AoACBP的分子质量大小约82 kDa;2)微量热涌动实验结果显示ACBP对长链酰基辅酶A具有很高的亲和性,其中对C20:0酰基辅酶A的亲和性（Kd=23 nM）最强,以上结果表明克隆的acbp基因在米曲霉中参与长链酰基辅酶A的转运。因长链酰基辅酶A是脂肪代谢的重要中间产物,暗示米曲霉ACBP参与调控脂类代谢;3)紫外诱变筛选出一株米曲霉尿嘧啶营养缺陷型作为表达宿主,将acbp基因连入改良的ANEp8-1载体中,构建了过表达载体（ANEp8-acbp）;4)利用qRT-PCR和Western blot考察了米曲霉3.042在不同生长时间ACBP表达水平的变化,结果表明米曲霉在24-72 h之间acbp基因转录水平没有显着差异,而Western blot实验结果显示米曲霉在60 h左右ACBP的表达量明显增加。以上研究结果为米曲霉ACBP的功能研究及其应用奠定了基础。
于海涛[8]（2012）在《抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究》文中进行了进一步梳理草甘膦是一种高效、低毒、广谱、内吸的非选择性灭生除草剂。它于1974年在美国被注册登记,是全世界除草剂消费量最大的品种之一。草甘膦能防除绝大多数一年生及多年生杂草,但由于其非选择性,在杀死杂草的同时对农作物也具有毒害作用。而提高作物对草甘膦的抗性,有利于草甘膦在农业生产中的应用并降低生产成本。因此,抗除草剂基因的发掘与利用己成为当今生物基因工程领域研究的重点。从抗除草剂微生物中分离抗性基因是最主要的途径。从受除草剂极端污染的土壤中筛选抗除草剂菌株是一种有效的方法。本研究从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株高抗草甘膦的真菌,并对其进行了形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA分子鉴定。利用SMARTer技术构建了菌株的全长cDNA文库。以抗草甘膦菌株假丝酵母菌TY-JM（Candida palmioleophila）和黄曲霉TZ1985（Aspergillus flavus）为材料,首次从假丝酵母与黄曲霉中分离得到EPSPS基因,并将其转化大肠杆菌验证其具有抗草甘膦功能,国内外未见报道。期望能为转基因抗除草剂作物新品种的培育提供新的基因资源。主要研究结果如下：1.利用瓶培养富集技术,从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株抗草甘膦浓度高达900mmol/L的真菌,命名为TY-JM。结合形态学观察、生理生化特性及18S rRNA序列分析,TY-JM被鉴定为假丝酵母菌Candida palmioleophila.形态学特征和生理生化特性与前人研究结果一致,18S rRNA系统进化分析表明其与假丝酵母同源性高达99%,序列上传至GenBank登录号为JN656713。2.以菌株TY-JM总RNA为模板,利用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了TY-JM的cDNA文库,并对文库质量进行了鉴定。原始文库滴度为2.58×106cfu/ml,文库库容为2.58×106cfu,扩增后滴度为3.42×109cfu/ml,重组率97.6%,文库插入片段范围为500bp-3kb,主要集中在1kb附近,说明该文库cDNA片段的序列比较完整,文库质量符合标准。3.通过比较基因组学的方法,分离得到了假丝酵母TY-JM和黄曲霉TZ1985的EPSPS蛋白编码序列。编码序列长度分别为1311bp和1353bp,分别编码436个氨基酸和450个氨基酸,理论分子量分别为46kDa和48kDa,等电点分别为5.77和6.04。TY-EPSPS（TY-JM的EPSPS）和TZ-EPSPS（TZ1985的EPSPS）基因推导的氨基酸序列经NCBI Protein BLAST程序分析表明,TY-EPSPS基因与热带假丝酵母、杜氏假丝酵母和白假丝酵母等具有80%的序列一致性；与核盘菌、棒曲霉具有66%的序列一致性,TZ-EPSPS基因与烟曲霉、棒曲霉、黑曲霉、白曲霉和土曲霉具有90%的序列一致性；与杜氏假丝酵母、白假丝酵母和热带假丝酵母具有68%的序列一致性。采用MIEGA4.0软件分析TY-EPSPS和TZ-EPSPS基因与其它种的EPSPS的进化关系,结果表明,TY-EPSPS和TZ-EPSPS均与真菌的EPSPS亲缘关系较近,而与植物和细菌的（?）PSPS亲缘关系较远。其中TY-EPSPS与酵母属亲缘关系最近,TZ-EPSPS与曲霉属的亲缘关系最近。4.将TY-EPSPS和T.Z-EPSPS连接pET-30a载体后转入大肠杆菌BL21（DE3）后,使大肠杆菌对草甘膦的抗性从原来的50mmol/L提高到了75mmol/L,高于空质粒阴性对照。说明重组质粒转化大肠杆菌后在其体内成功进行复制表达,提高了大肠杆菌对草甘膦的抗性。
吕军[9]（2011）在《转基因烟草对土壤磷吸收利用的研究》文中研究说明由于强吸附作用、低溶解性以及难移动性等因素的影响,磷在土壤中有效性很低,因此磷成为限制植物生长的重要因子之一。在全球范围内,70%以上的可耕地面积为酸性和碱性土壤,磷在这类土壤中的存在形式,大部分为植物所不能吸收和利用的难溶性磷酸盐。为了确保植物的产量,提高磷素的利用率,全世界每年要施用的磷肥约达3千万吨,然而,在这些施用的磷肥中,由于吸附、沉降、以及转化成有机物等形式,80%的磷肥在土壤中固定下来,难以被植物吸收利用。所以,提高植物对土壤中难溶性磷的吸收能力,对于农业生态环境的改善以及农作物的增产具有十分重要的作用。现有的研究已经表明改变有机酸在植物体内的代谢水平,增加有机酸的分泌量是增强植物利用难溶磷酸盐的一种潜在分子机制。本研究从高效解磷真菌草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）中克隆了两个有机酸代谢途径关键酶基因,柠檬酸合酶（Cit）和苹果酸脱氢酶（MDH）基因,并对其序列进行了分析。在此基础上,将Po-mCit和Po-mMDH基因分别表达在大肠杆菌和烟草中,对转化体在磷胁迫条件下的生长状况进行了研究。具体研究内容及结果如下：1.根据已知真菌的苹果酸脱氢酶（MDH）、柠檬酸合酶（Cit）基因序列的同源性设计引物,以高效解磷真菌草酸青霉菌总RNA为模板,利用RT-PCR法,获得了草酸青霉菌线粒体苹果酸脱氢酶（Po-mMDH）和柠檬酸合酶（Po-mMDH） cDNA全序列,并由此推测相应的氨基酸序列。Po-mMDH基因cDNA （GenBank accession no. FJ550602）全长1284 bp,其中5’非编码区45 bp,3’非编码区216 bp,编码区1023 bp,编码一个由340个氨基酸构成的多肽,与土曲霉（Aspergillus terreus）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）mMDH具有85%以上的同源性,并具有高度保守的活性中心（VTTLDVVRASRFI）,N端具有23个氨基酸的线粒体导向序列。Po-mCit基因cDNA （GenBank accession no.GQ981487）全长1716bp,包括5’端非编码区96bp,3’端非编码区205bp,开放阅读框1416bp,编码一个由471个氨基酸构成的多肽,与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和黑曲霉（Aspergillus niger） mCit具有85%以上的同源性,并具有高度保守的活性中心（GYGHAVLRKTDPR）, N端都具有31个氨基酸的线粒体导向序列。2.分别将Po-mMDH和Po-mCit基因克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21（DE3）中分别获得可溶性融合表达产物。Po-mMDH工程菌中检测到较高的MDH活性（48.7μmol/mg protein）,是对照的5倍,在以磷酸钙为唯一磷源的培养液中生长,Po-mMDH工程菌发酵液中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和草酸的含量较对照明显增加,分别是对照的2.7、3.7、1.9、2.3和9.1倍,可溶性磷含量（134.8 mg／L）也明显高于对照（39.3 mg/L）。Po-mCit工程菌的Cit的活性为24.6μmol/mg protein,是对照的11倍。在以磷酸钙为唯一磷源的培养液中生长,Po-mCit工程菌发酵液中柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙酸、和草酸的含量较对照明显增加,分别是对照的2.3、1.6、2.9、3.5和7.6倍,可溶性磷含量（156.6 mg/L）也明显高于对照。表明Po-mMDH或Po-mCit基因的表达能够促进有机酸的合成,增强大肠杆菌对磷的溶解能力。3.利用农杆菌转化技术获得了转Po-mMDH基因烟草,经过PCR、Southern-blot和RT-PCR验证,表明外源Po-mMDH基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。转Po-mMDH基因烟草根系中MDH活性较野生型明显提高,低可利用磷条件下M1株系的酶活最高,达到38.6μmol/mg protein,相对于野生型增长2.2倍。低可利用磷胁迫诱导根系分泌的苹果酸含量是野生型的1.3-2.9倍。在以Al-phosphate （Al-P）, Fe-phosphate （Fe-P）或Ca-phosphate （Ca-P）为唯一磷源的培养条件下,转基因烟草的生长状况明显好于野生型,干物重分别是野生型的2.5、2.3和2.3倍,总磷含量分别增长3.9、3.4和3.2倍。4.利用农杆菌转化技术获得了转Po-mCit基因烟草,并经过PCR和Southern-blot和RT-PCR验证,表明外源Po-mCit基因已整合到烟草基因组中,并在转录水平上表达。转Po-mCit基因烟草根系Cit活性较野生型明显提高,在难溶磷（Al-P）条件下,转基因株系的Cit酶活性最高,其中C2株系的Cit酶活性（28.4μmol/mg protein）是野生型（8.8μmol/mg protein）的3.2倍。根系分泌的柠檬酸含量分别增长1.6、2.7、2.5和2.3倍。在难溶磷（Al-P）培养条件下,转基因株系的地上部干重和根干重明显高于野生型,总磷含量也明显提高,较野生型分别增加1.6、2.4、1.9和1.8倍。
刘礼兵[10]（2006）在《奎尼酸生物合成的代谢工程研究》文中指出奎尼酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体，在医药工业、食品工业、化工等行业均有较大的用途。本研究是将代谢工程技术应用于产奎尼酸基因工程菌的构建。根据代谢工程原理系统分析了细胞代谢网络，并利用DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及其遗传修饰，进而完成细胞特性改造。目的是在大肠杆菌中构建奎尼酸生物合成途径，将碳代谢流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。利用大肠杆菌莽草酸途径合成新的代谢物奎尼酸，需要提高上游几种代谢中间产物PEP、E4P、DAHP、DHQ的含量，与之对应的编码其合成酶的几种基因分别是ppsA、tktA、aroG、aroB。另外须在宿主细胞引入编码与奎尼酸合成有关的异源酶基因扩展代谢途径，然后串联表达酶基因，同时适量增加不同种属的多个关键酶的有效含量，改善限速反应。利用同源重组进行基因整合和基因破坏，改造染色体结构定向改变微生物代谢途径。本文主要从以下几个方面对奎尼酸基因工程菌进行了改造：1．编码奎尼酸脱氢酶的qutB基因是来自于构巢曲霉。在现有的基础上构建了一系列包含qutB基因的表达重组质粒。SD序列与起始密码子不同距离的pBVqutB1，pBVqutB2；具有qutB双拷贝三基因串联的pBVqutBqutBaroG；具有ppsA、tktA、qutB三基因串联的pBVPTB，以及新构建的单基因重组质粒pETqutB，pBVtacqutB，pTrcqutB。并对含有qutB基因的一系列重组质粒在大肠杆菌中进行了表达与否的验证。结果显示pTrcqutB，pBVtacqutB没有特异的蛋白表达带，说明pTrc99a和pBVtac载体不适合用于qutB基因的表达。pETqutB经过IPTG诱导后有特异的蛋白表达，并且在2—5小时内随着时间的延长而增加，但是时间更长（7h）则因为蛋白降解而出现表达蛋白减少的迹象。pBVqutB1和pBVqutB2同本实验室保存的pBVqutB没有出现明显的蛋白表达量上的差异，这说明利用pBV220表达载体表达qutB基因，起始密码子与SD序列之间距离的远近并不是影响其表达量的关键。含有两个qutB基因和一个aroG基因的多基因串连质粒pBVqutBqutBaroG，经过热诱导，也出现了非常明显的表达条带。2．对含有qutB基因在大肠杆菌中可以表达几种重组质粒进行酶活测定，与含有pBVqutB的对照菌相比，含有pBVqutB1，pBVqutB2的菌株的奎尼酸脱氢酶的酶活没有明显变化，三基因串联的pBVqutBqutBaroG甚至出现了酶活降低的现象。3．成功地从粗糙脉孢菌的基因组中克隆了奎尼酸脱氢酶的基因qa-3，并与几种表达载体连接得到了pBVqa3、pETqa3、pBVtacqa3、pTrcqa3，但是这些质粒重组子在大肠杆菌中均没有观察到该基因的特异表达条带。4．结合qa-3基因的密码子的特点和计算机模拟的mRNA二级结构，对qa-3基因的密码子和mRNA二级结构进行改造，优化该基因的密码子结构，降低形成mRNA二级结构的自由能，得到新的基因qa3RGm。构建的pBVqa3RGm重组质粒在大肠杆菌中成功的表达了奎尼酸脱氢酶，酶活也比对照明显提高。同时还构建了ppsA、tktA、qa3RGm三基因串联的重组质粒pBVPTA。5．成功的构建了pUC-DK、pUC-DAK、pUC-DBK并制备了线性化片段DK、DAK、DBK，为基因敲除和基因替换做好了准备。利用Red重组系统成功的地进行了基因敲除和基因替换，并稳定了敲除和替换菌株的基因型，把这株菌株定名为大肠杆菌31K。6．成功的构建奎尼酸发酵的工程菌5、AP、B、A、BP、5K、APK、BK、AK、BPK、220K。通过实验室摇瓶初步发酵，在硅胶板上可以初步确定，菌株AP（31BK/pBVPTA）产生的奎尼酸量最大，也最稳定。7．将菌株AP扩大摇瓶发酵的规模，然后经过树脂富集，HPLC制备，得到了微量的奎尼酸样品。经过红外光谱、核磁共振、电子喷雾质谱以及紫外、液质联用等的鉴定可以确定与奎尼酸标准品无差异，由此可以确定我们利用生物合成并且分离鉴定了奎尼酸。总之，为了合成奎尼酸并提高其产量，本研究从分子进化、基因重组、网络构建等不同的方面对奎尼酸生物合成进行了许多有益尝试，既为研究奎尼酸的生物合成奠定了基础，也为基因工程应用于代谢工程提供一定的借鉴意义。
二、构巢曲霉奎尼酸脱氢酶基因qutB在大肠杆菌中的克隆与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、构巢曲霉奎尼酸脱氢酶基因qutB在大肠杆菌中的克隆与表达（论文提纲范文）
（1）代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 研究背景及意义 |
| 1.1 酿酒酵母作为底盘细胞合成天然产物 |
| 1.1.1 酿酒酵母作为微生物细胞工厂的应用 |
| 1.1.2 酿酒酵母中芳香类化合物的生物合成 |
| 1.2 酪醇及其衍生物的研究现状 |
| 1.2.1 酪醇及其衍生物的应用 |
| 1.2.2 酪醇及其衍生物的生产工艺 |
| 1.2.3 酪醇及红景天苷的生物合成途径及研究进展 |
| 1.3 研究内容、思路及意义 |
| 1.3.1 本文的研究内容 |
| 1.3.2 研究思路 |
| 1.3.3 研究意义 |
| 第二章 改造酿酒酵母中心碳代谢途径生产酪醇 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂、溶剂及缓冲液 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基及培养条件 |
| 2.2.5 质粒、菌株和引物 |
| 2.2.6 实验方法及步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 酿酒酵母Ehrlich途径的重构 |
| 2.3.2 改造酿酒酵母乙醇分支途径提高酪醇产量 |
| 2.3.3 改造酿酒酵母分支酸代谢途径提高酪醇产量 |
| 2.3.4 酿酒酵母工业菌株单倍体的分离及鉴定 |
| 2.3.5 高产酪醇的酿酒酵母工业菌株的构建 |
| 2.3.6 改造酿酒酵母PP途径对酪醇生物合成的影响 |
| 2.3.7 PP途径和Xfpk途径的热动力学参数的比较和分析 |
| 2.3.8 在酿酒酵母中导入Xfpk途径以提高酪醇产量 |
| 2.3.9 葡萄糖补料分批发酵生产酪醇 |
| 2.3.10 减轻来源于Xfpk途径的AcP对酿酒酵母的影响 |
| 2.3.11 改造莽草酸途径提高酪醇产量 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 酿酒酵母中红景天苷的生物合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验材料及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂、溶剂及缓冲液 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 培养基及培养条件 |
| 3.2.5 菌株、质粒和引物 |
| 3.2.6 实验方法及步骤 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 红景天苷生物合成酿酒酵母工程菌株的构建 |
| 3.3.2 葡萄糖补料分批发酵高产红景天苷 |
| 3.4 本章小结 |
| 附录 |
| 附录1 紫色红曲霉的桔霉素生物合成研究 |
| 附录2 冠突曲霉的遗传操作体系的建立及次级代谢研究初探 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间已(待)发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌的构建及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 发酵工程 |
| 1.1.1 发酵工程的定义 |
| 1.1.2 发酵工程的研究技术和应用领域 |
| 1.2 基因工程 |
| 1.2.1 基因工程的定义 |
| 1.2.2 分子克隆的载体与宿主系统 |
| 1.3 大肠杆菌发酵过程 |
| 1.3.1 大肠杆菌发酵中存在的问题 |
| 1.3.2 解决发酵失败的常用手段 |
| 1.4 甲酰胺酶研究进展 |
| 1.4.1 甲酰胺酶催化甲酰胺水解 |
| 1.4.2 甲酰胺酶及其基因的发现 |
| 1.4.3 甲酰胺酶对甲酰胺水解的催化机制研究 |
| 1.5 亚磷酸脱氢酶的研究进展 |
| 1.5.1 亚磷酸脱氢酶及其基因的发现 |
| 1.5.2 亚磷酸脱氢酶的理化性质 |
| 1.5.3 亚磷酸脱氢酶的催化机理 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 系统介绍 |
| 1.7 本研究的主要内容和意义 |
| 1.7.1 研究的主要内容 |
| 1.7.2 研究的主要意义 |
| 第二章 甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂材料 |
| 2.2 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 产亚磷酸脱氢酶菌株的筛选 |
| 2.3.2 获取目的基因的基本操作 |
| 2.3.2.1 细菌基因组的提取 |
| 2.3.2.2 菌体16SrDNA的扩增及分子鉴定 |
| 2.3.2.3 目的基因的获取 |
| 2.3.2.4 目标基因的酶切和连接体系 |
| 2.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 大肠杆菌转化步骤 |
| 2.3.5 蛋白电泳分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 甲酰胺酶基因的获取 |
| 2.4.2 甲酰胺酶的三级结构预测分析 |
| 2.4.3 产亚磷酸脱氢酶菌株的筛选 |
| 2.4.4 重组质粒的构建及重组菌的诱导表达 |
| 2.4.5 两种重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-fmdA/ptxD)与普通大肠杆菌生长比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 重组甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶的酶学性质 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种和培养基 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶的分离纯化 |
| 3.3.1.1 重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的诱导培养 |
| 3.3.1.2 重组甲酰胺酶和重组亚磷酸脱氢酶粗酶液的提取 |
| 3.3.1.3 重组酶的分离纯化 |
| 3.3.2 蛋白质电泳分析及蛋白浓度测定 |
| 3.3.3 重组酶甲酰胺酶和重组亚磷酸脱氢酶的酶活检测方法 |
| 3.3.4 重组甲酰胺酶和重组亚磷酸脱氢酶的酶学性质研究 |
| 3.3.4.1 重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶的最适温度及稳定性测定 |
| 3.3.4.2 重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶的最适pH及pH稳定性测定 |
| 3.3.4.3 不同金属离子和化学试剂对重组甲酰胺酶和重组亚磷酸脱氢酶催化活性的影响 |
| 3.3.4.4 重组甲酰胺酶和重组亚磷酸脱氢酶的反应动力学研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶的分离纯化 |
| 3.4.2 重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶的最适反应温度及热稳定性研究 |
| 3.4.3 重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶的最适反应pH及pH稳定性研究 |
| 3.4.4 金属离子和化学试剂对重组甲酰胺酶与重组亚磷酸脱氢酶催化相应底物的影响 |
| 3.4.5 重组甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶的反应动力学研究 |
| 3.4.5.1 重组甲酰胺酶的反应动力学 |
| 3.4.5.2 重组亚磷酸脱氢酶的反应动力学 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 加强型大肠杆菌工程菌的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种和质粒 |
| 4.1.2 主要培养基 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 含抗杂菌系统(N&P系统)的重组大肠杆菌的构建 |
| 4.3.2 重组大肠杆菌的培养 |
| 4.3.3 抗杂菌污染能力的验证 |
| 4.3.4 观察与测定大肠杆菌荧光强度 |
| 4.3.5 含抗T7 噬菌体侵染的CRISPR/Cas9 系统的构建 |
| 4.3.6 抗T7噬菌体侵染的功能验证 |
| 4.3.7 双系统共转化入同一株大肠杆菌 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 以甲酰胺作为唯一氮源的MOPS培养基培养重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-fmdA) |
| 4.4.1.1 含不同浓度甲酰胺的LB培养基对普通大肠杆菌生长的影响 |
| 4.4.1.2 不同培养温度对重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-fmdA)生长的影响 |
| 4.4.1.3 含不同浓度甲酰胺的MOPS培养基对重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-fmdA)生长的影响 |
| 4.4.1.4 重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-fmdA)在含甲酰胺为唯一氮源的MOPS培养基中的生长曲线 |
| 4.4.2 以亚磷酸盐作为唯一磷源的MOPS培养基培养重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-ptxD) |
| 4.4.2.1 不同浓度亚磷酸盐对普通大肠杆菌E.coli BL21(DE3)生长的影响 |
| 4.4.2.2 不同培养温度对重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-ptxD)生长的影响 |
| 4.4.2.3 重组菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-ptxD)在含亚磷酸盐为唯一磷源的MOPS培养基中的生长曲线 |
| 4.4.3 构建含甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因的氮磷(N&P)系统作为抗杂菌系统 |
| 4.4.4 三种重组菌在营养缺陷型MOPS培养基中的遗传稳定性 |
| 4.4.5 三种方式构建的大肠杆菌工程菌在LB培养基中合成绿色荧光蛋白 |
| 4.4.6 三种方式构建的大肠杆菌工程菌在营养缺陷型MOPS培养基中生长与合成绿色荧光蛋白的情况 |
| 4.4.6.1 三种方式构建的大肠杆菌工程菌在营养缺陷型MOPS培养基中的生长曲线 |
| 4.4.6.2 三种方式构建的大肠杆菌工程菌在营养缺陷型MOPS培养基中合成绿色荧光蛋白的情况 |
| 4.4.7 含抗杂菌系统的大肠杆菌工程菌抗杂菌效率的验证 |
| 4.4.8 抗T7噬菌体系统的构建 |
| 4.4.8.1 间隔区序列 |
| 4.4.8.2 Cas9蛋白对细胞的毒性 |
| 4.4.8.3 六种不同CRISPR/Cas9 系统剪切T7 噬菌体基因组的效率 |
| 4.4.8.4 含间隔区N20-1的CRISPR/Cas9 系统的大肠杆菌在LB液体培养基中的生长曲线 |
| 4.4.9 抗杂菌系统和抗噬菌体系统共转化入同一株大肠杆菌 |
| 4.4.10 加强型大肠杆菌在营养缺陷型MOPS培养基中的生长曲线 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 启动子的优化和双系统质粒的整合 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 质粒和培养基 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 融合基因启动子的优化及质粒整合 |
| 5.3.2 基因无缝连接 |
| 5.3.3 酶切体系 |
| 5.3.4 大肠杆菌转化步骤 |
| 5.3.5 甲酰胺的检测方法 |
| 5.3.6 荧光定量PCR |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 融合基因启动子的优化 |
| 5.4.2 质粒整合 |
| 5.4.3 加强型大肠杆菌工程菌在营养缺陷型MOPS培养基中的生长曲线 |
| 5.4.4 加强型大肠杆菌工程菌在含不同浓度甲酰胺的营养缺陷型MOPS培养基中的甲酰胺消耗量、生长情况及合成蛋白的能力 |
| 5.4.5 加强型大肠杆菌工程菌抵抗T7噬菌体的效率 |
| 5.4.6 荧光定量PCR检测Cas9和N20-1-sg RNA的 RNA转录水平 |
| 5.4.7 加强型大肠杆菌和普通大肠杆菌之间的比较 |
| 5.4.7.1 加强型大肠杆菌与普通大肠杆菌在不同培养基中的生长曲线比较 |
| 5.4.7.2 加强型大肠杆菌与普通大肠杆菌在不同培养基中合成目标蛋白的能力比较 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 加强型大肠杆菌工程菌的应用研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 质粒和培养基 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.2 主要实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 重组菌的构建及诱导表达 |
| 6.3.2 E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE制备(R)-o-GMPE的基本步骤 |
| 6.3.3 关键因素对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE的影响 |
| 6.3.4 不同产物浓度对E.coli Rob3 全细胞催化活性的影响和对细胞的毒性 |
| 6.3.5 E.coli Rob3 全细胞在以有机溶剂为第二相的双相体系中动力学拆分rac-o-GMPE制备(R)-o-GMPE的影响 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 不同酶基因的克隆及在加强型大肠杆菌中的表达 |
| 6.4.2 关键因素对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE制备(R)-o-GMPE过程的影响 |
| 6.4.3 底物对催化反应的抑制作用和产物对E.coli Rob3 细胞的毒性 |
| 6.4.4 分批补加细胞策略对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE的影响 |
| 6.4.5 在双相体系中不同有机溶剂和体积比对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE的影响 |
| 6.4.5.1 以不同有机溶剂为第二相的反应体系对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE的影响 |
| 6.4.5.2 水缓冲液与乙酸丁酯的不同体积比对E.coli Rob3 全细胞动力学拆分rac-o-GMPE的影响 |
| 6.4.6 在体积比为0.5:1 的水缓冲液与乙酸丁酯双相体系中E.coli Rob3 全细胞动力学拆分高浓度rac-o-GMPE的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑曲霉 |
| 1.2 工业化糖化酶生产 |
| 1.3 黑曲霉基因组学研究进展 |
| 1.4 黑曲霉转录组学研究进展 |
| 1.4.1 比较转录组学分析指导黑曲霉的高效生产 |
| 1.4.2 转录组学分析揭示黑曲霉调控次级代谢产物合成的机制 |
| 1.4.3 转录组学揭示黑曲霉在不同碳源条件下的转录响应 |
| 1.5 黑曲霉代谢物组学 |
| 1.6 黑曲霉多组学整合研究 |
| 1.7 黑曲霉基因遗传改造平台 |
| 1.7.1 Tet-on可诱导表达系统的应用 |
| 1.7.2 丝状真菌中CRISPR基因编辑技术研究进展 |
| 1.8 代谢工程研究优化微生物细胞工厂的性能 |
| 1.8.1 DBTL循环驱动高效智能细胞工厂的构建 |
| 1.8.2 黑曲霉细胞工厂的研究进展 |
| 1.8.3 辅因子代谢工程 |
| 1.9 本课题的研究内容与意义 |
| 第2章 比较基因组学分析预测与糖化酶工业菌株高蛋白分泌能力有关的基因 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和培养基 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 |
| 2.2.3 测量干重,总分泌蛋白,残糖和糖化酶酶活的方法 |
| 2.2.4 构建ΔtupA和ΔprpA敲除株 |
| 2.2.5 黑曲霉LDM3基因组拼接 |
| 2.2.6 生物信息学分析 |
| 2.2.7 SNP、InDel和SV分析 |
| 2.2.8 共线性区域分析 |
| 2.2.9 LDM3基因组中相比于参考基因组的菌株特异性基因 |
| 2.2.10 TupA和PrpA编码基因的共表达网络分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌株培养和基因组DNA的质量检测 |
| 2.3.2 LDM3基因组特征 |
| 2.3.3 结构变异分析 |
| 2.3.4 LDM3菌株特异性基因分析 |
| 2.3.5 SNP和InDel分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 黑曲霉产糖化酶发酵过程中的全局转录响应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 摇瓶发酵 |
| 3.2.3 反应器水平发酵 |
| 3.2.4 取样 |
| 3.2.5 酶活和干重 |
| 3.2.6 RNA提取 |
| 3.2.7 链特异性RNA测序 |
| 3.2.8 与参考基因组的比对和基因表达水平的归一化 |
| 3.2.9 差异表达基因分析 |
| 3.2.10 基因功能注释 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 黑曲霉产糖化酶发酵过程的生理学特性 |
| 3.3.2 RNA-Seq数据概况 |
| 3.3.3 差异表达基因的功能注释和表达模式分析 |
| 3.3.4 糖化酶发酵过程中代谢途径的转录响应 |
| 3.3.5 分泌途径上的转录响应 |
| 3.3.6 转录因子的转录水平响应 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 探究NADPH供应对黑曲霉低产糖化酶菌株产酶的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 过表达质粒克隆和大肠杆菌转化方法 |
| 4.2.4 大肠杆菌菌落PCR |
| 4.2.5 An14g00430和An16g02510基因敲除盒的构建 |
| 4.2.6 黑曲霉孢子液洗脱方法 |
| 4.2.7 获得黑曲霉菌丝体的方法 |
| 4.2.8 黑曲霉原生质体转化法 |
| 4.2.9 真菌基因组提取方法 |
| 4.2.10 Diagnostic PCR验证阳性转化子 |
| 4.2.11 Southern杂交验证阳性转化子 |
| 4.2.12 发酵液分析 |
| 4.2.13 活性氧种类ROS的定量 |
| 4.2.14 荧光定量PCR |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 构建NADPH供应酶的相关过表达质粒 |
| 4.3.2 摇瓶水平上探究NADPH调控对糖化酶低产菌株产酶的影响 |
| 4.3.3 NADPH氧化酶调控子riaA对黑曲霉蛋白合成的调控 |
| 4.3.4 NADP+依赖型转氢酶对NADPH水平的调控作用 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9基因编辑技术构建黑曲霉高产糖化酶菌株B36的尿嘧啶营养缺陷型突变株 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株和培养基 |
| 5.2.2 同源重组法构建尿嘧啶缺陷株的策略 |
| 5.2.3 获取黑曲霉B36菌丝体用于原生质体转化 |
| 5.2.4 黑曲霉原生质体转化方法 |
| 5.2.5 合成和体外纯化Cas9蛋白策略 |
| 5.2.6 体外合成sgRNA策略 |
| 5.2.7 体外CRISPR/Cas9体系编辑pyrG基因 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 同源重组方法构建B36尿嘧啶缺陷株 |
| 5.3.2 Cas9蛋白的体外纯化 |
| 5.3.3 体外CRISPR/Cas9体系编辑pyrG基因 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 NADPH辅因子代谢工程优化黑曲霉蛋白生产性能 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 菌株和培养基 |
| 6.2.2 黑曲霉菌落PCR |
| 6.2.3 黑曲霉批发酵实验设计 |
| 6.2.4 黑曲霉碳限制恒化培养实验设计 |
| 6.2.5 葡萄糖和胞外有机酸测定 |
| 6.2.6 Dot blotting定量糖化酶酶量 |
| 6.2.7 发酵过程尾气检测 |
| 6.2.8 胞内代谢物快速抽提方法 |
| 6.2.9 GC-MS检测胞内氨基酸和磷酸糖类代谢物 |
| 6.2.10 LC-MS检测辅因子、有机酸和磷酸糖类代谢物 |
| 6.2.11 胞内NADPH定量 |
| 6.2.12 荧光定量PCR |
| 6.2.13 胞内代谢物组学数据的多元统计学分析方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 B36尿嘧啶缺陷株转化效率验证 |
| 6.3.2 优化糖化酶高产菌株的原生质体转化效率 |
| 6.3.3 NADPH辅因子代谢工程对黑曲霉产酶的影响具有菌株依赖性 |
| 6.3.4 不同NADPH再生系统在批培养发酵过程中的影响 |
| 6.3.5 恒化培养揭示黑曲霉辅因子调控引起的胞内代谢响应机制 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 卷内备考表 |
（4）大肠杆菌中EP-bifido途径的构建用于高效生产乙酰辅酶A衍生物（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 选题背景、研究工作及意义 |
| 1.1.1 非氧化性糖酵解途径的简介 |
| 1.1.2 重组大肠杆菌中EP-bifido途径用于以AcCoA为前体的产物合成 |
| 1.2 聚羟基脂肪酸酯(PHA)概述 |
| 1.2.1 PHA的生物合成 |
| 1.2.2 PHA的生物合成途径及相关酶 |
| 1.2.3 PHB的生物合成 |
| 1.3 MVA概述 |
| 1.3.1 MVA的简介 |
| 1.3.2 MVA的生物合成及相关酶 |
| 1.3.3 MVA生产菌株的改造及代谢研究 |
| 1.4 脂肪酸概述 |
| 1.4.1 脂肪酸的简介 |
| 1.4.2 游离脂肪酸的生物合成途径及相关酶 |
| 1.4.3 游离脂肪酸生产菌株的代谢改造 |
| 第二章 大肠杆菌中EP-bifido途径构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验引物 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 相关试剂与缓冲液 |
| 2.1.5 常用生化试剂 |
| 2.1.6 常用试剂盒 |
| 2.1.7 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种和核酸片段的保藏 |
| 2.2.2 分子生物学常规操作技术 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌体内EP-bifido途径的设计和构建 |
| 2.3.2 通过~(13)C-MFA代谢流分析 |
| 2.3.3 工程菌DH5α-EP (pFF)的生理特性 |
| 2.3.4 其他大肠杆菌EP-bifido途径的扩展 |
| 本章小结 |
| 第三章 应用EP-bifido途径合成AcCoA衍生物 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 实验引物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组大肠杆菌生产PHB的发酵方法 |
| 3.2.2 PHB的检测方法 |
| 3.2.3 重组大肠杆菌生产MVA的发酵方法 |
| 3.2.4 细胞浓度、葡萄糖和胞外有机酸的检测方法 |
| 3.2.5 重组大肠杆菌生产FFAs的发酵方法 |
| 3.2.6 脂肪酸的检测方法 |
| 3.2.7 CO_2产量的检测方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 EP-bifido途径用于PHB的生产 |
| 3.3.2 EP-bifido途径用于MVA的生产 |
| 3.3.3 EP-bifido途径用于游离脂肪酸的生产 |
| 3.3.4 EP-bifido途径的CO_2产量 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 酿酒酵母合成萜类化合物 |
| 1.1.1 酿酒酵母萜类化合物合成途径 |
| 1.1.2 酿酒酵母萜类化合物合成的调控策略 |
| 1.1.3 酿酒酵母合成β-香树脂醇现状 |
| 1.2 酿酒酵母乙酰辅酶A的合成与分解代谢 |
| 1.3 酿酒酵母线粒体乙酰辅酶A穿梭系统 |
| 1.3.1 乙醛酸支路系统 |
| 1.3.2 柠檬酸裂解酶系统 |
| 1.3.3 肉毒碱穿梭系统 |
| 1.4 酿酒酵母乙酰辅酶A合成萜类化合物的调控策略 |
| 1.4.1 酿酒酵母细胞质乙酰辅酶A调控 |
| 1.4.2 酿酒酵母线粒体直接合成萜类化合物 |
| 1.4.3 强化酿酒酵母辅酶A合成 |
| 1.5 本课题研究的内容与意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 实验溶液配制 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 酿酒酵母的培养 |
| 2.2.2 菌体生物量的测定 |
| 2.2.3 目的基因的扩增 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 2.2.5 大肠杆菌热激转化 |
| 2.2.6 酿酒酵母载体表达盒的构建 |
| 2.2.7 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.2.8 大肠杆菌基因组提取 |
| 2.2.9 酵母化学转化法 |
| 2.2.10 酿酒酵母基因组提取 |
| 2.2.11 酿酒酵母质粒提取 |
| 2.2.12 酿酒酵母总RNA的提取与反转录 |
| 2.2.13 基因表达水平检测 |
| 2.2.14 β-香树脂醇及其他代谢产物的提取与鉴定 |
| 2.2.15 酿酒酵母生理参数的测定 |
| 2.2.16 发酵罐的培养 |
| 第3章 强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成 |
| 引言 |
| 3.1 酿酒酵母中途径的构建策略与方法 |
| 3.1.1 过表达乙醇脱氢酶基因ADH2工程菌的构建 |
| 3.1.2 内源丙酮酸脱氢酶支路在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.3 外源丙酮酸脱氢酶途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.4 外源柠檬酸裂解酶途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.5 外源PK/PTA途径和A-ALD途径在酿酒酵母中的构建 |
| 3.1.6 敲除酿酒酵母苹果酸合酶和柠檬酸合酶 |
| 3.1.7 强化酿酒酵母辅酶A合成在酿酒酵母中的构建 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 过表达乙醇脱氢酶基因ADH2对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.2 强化酿酒酵母内源丙酮酸脱氢酶支路对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.3 构建外源丙酮酸脱氢酶途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.4 构建外源柠檬酸裂解酶途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.5 构建外源PK/PTA途径和A-ALD途径对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.2.6 强化酿酒酵母辅酶A合成对β-香树脂醇合成的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 强化酿酒酵母鲨烯合成途径的β-香树脂醇合成 |
| 引言 |
| 4.1 酿酒酵母中途径的构建与方法 |
| 4.1.1 过表达3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶tHMG1工程菌的构建 |
| 4.1.2 共表达ADH2和t HMG1 工程菌的构建 |
| 4.1.3 过表达ERG系列基因工程菌的构建 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 过表达3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.2.2 共表达ADH2和t HMG1对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.2.3 过表达ERG系列基因对β-香树脂醇合成的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 高产β-香树脂醇酵母工程菌的发酵优化 |
| 引言 |
| 5.1 乙醇补料发酵 |
| 5.2 葡萄糖补料发酵 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文与研究成果清单 |
| 致谢 |
（6）萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 萜类化合物的生物合成 |
| 1.1.1 萜类化合物简介 |
| 1.1.2 萜类化合物的生物合成途径 |
| 1.1.3 MEP和MVA途径在萜类化合物代谢工程改造中的应用 |
| 1.2 代谢工程与萜类化合物的高效合成 |
| 1.2.1 代谢工程简介 |
| 1.2.2 代谢工程增加萜类化合物产量的策略 |
| 1.2.2.1 平衡萜类化合物生物合成途径中各个酶组分的表达 |
| 1.2.2.2 碳代谢及能量代谢的平衡 |
| 1.2.2.3 细胞膜与萜类化合物的高效合成 |
| 1.3 代谢工程在萜类化合物生物合成领域的应用 |
| 1.3.1 代谢工程改造E.coli合成紫杉烷类化合物 |
| 1.3.2 代谢工程改造E.coli和S. cerevisiae合成青蒿酸 |
| 1.3.3 代谢工程改造丝状真菌合成萜类化合物 |
| 1.4 萜类化合物生物合成元件及其产物的挖掘 |
| 1.4.1 传统的萜类化合物挖掘手段 |
| 1.4.2 基因组测序辅助萜类化合物挖掘 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 实验材料与研究方法 |
| 2.1 培养基 |
| 2.1.1 大肠杆菌及根癌农杆菌常用培养基 |
| 2.1.2 丝状真菌常用培养基 |
| 2.1.3 酿酒酵母常用培养基 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌基因组总DNA的提取 |
| 2.3.2 丝状真菌基因组总DNA的提取 |
| 2.3.3 丝状真菌RNA的提取 |
| 2.3.4 反转录单链cDNA |
| 2.3.5 小量PCR产物的纯化及凝胶回收DNA片段 |
| 2.3.6 DNA的酶切反应 |
| 2.3.7 DNA的酶连反应 |
| 2.3.8 Simple Cloning方法组装载体 |
| 2.3.9 大肠杆菌质粒DNA的少量提取 |
| 2.3.10 Gibson方法组装载体 |
| 2.3.11 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.12 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的纯化 |
| 2.3.13 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.3.14 DNA assemble方法在S.cerevisiae体内构建重组质粒 |
| 2.3.15 LiAc法转化S.cerevisiae |
| 2.3.16 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.3.18 Real-Time检测荧光蛋白的表达情况 |
| 2.3.19 萜类合酶的体外反应 |
| 2.3.20 萜类合酶的体外酶动力学检测 |
| 2.3.21 萜类化合物的GC-MS检测 |
| 2.3.22 ECD谱计算化合物绝对构型 |
| 2.3.23 基因组,转录组测序和组装 |
| 2.3.24 基因组注释 |
| 2.3.25 同源建模 |
| 第三章 基于MVA途径的萜类化合物合成平台的搭建及紫杉二烯的合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 E.coli体内高产萜类化合物平台的构建及紫杉二烯的合成 |
| 3.3.2 A.alternata TPF6遗传操作系统的建立及外源启动子强度的研究 |
| 3.3.3 A.alternata TPF6体内萜类化合物合成平台的搭建及紫杉二烯的合成 |
| 3.3.4 高产萜类化合物 S.cerevisiae平台的构建 |
| 3.3.4.1 改造MVA途径质粒的构建 |
| 3.3.4.2 高产萜类化合物 S.cerevisiae平台的构建 |
| 3.4 本章小结与展望 |
| 第四章 基于组合生物合成策略的不同类型萜类化合物合成平台的搭建及产物挖掘 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 F.graminearum J1-012基因组测序及组装 |
| 4.3.2 Ⅰ型萜类合酶的挖掘 |
| 4.3.3 F.graminearum J1-012来源萜类化合物的挖掘及组合生物合成 |
| 4.3.4 基于组合生物合策略的FgMS以及FgGS生物合成潜力挖掘 |
| 4.3.5 理性改造FgMS拓展其产物合成能力 |
| 4.3.6 FgMS和FgGS产物合成化学机理的推测 |
| 4.3.7 真菌来源clade Ⅲ分支Ⅰ型萜类合酶系统发育分析 |
| 4.4 本章小结与展望 |
| 第五章 搭建S.cerevisiae平台挖掘倍半萜合酶及其新骨架化合物 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株及质粒 |
| 5.2.2 引物 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 FgJ03939蛋白纯化底物识别能力研究 |
| 5.3.2 酵母高产倍半萜平台及其在真菌天然产物挖掘领域的应用 |
| 5.3.3 FgFS新骨架化合物的化学合成机理 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 本研究工作总结 |
| 6.2 本研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（7）米曲霉酰基辅酶A结合蛋白基因的克隆鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 米曲霉 |
| 1.2 米曲霉脂肪酸代谢与酰基辅酶A结合蛋白 |
| 1.3 酰基辅酶A结合蛋白 |
| 1.4 ACBP在各种生物体内的分布 |
| 1.5 ACBP国内外研究背景 |
| 1.5.1 脂肪酸中间体的储运及转运 |
| 1.5.2 参与脂类(Lipid)代谢 |
| 1.6 大肠杆菌表达系统 |
| 1.6.1 大肠杆菌的生物学特性 |
| 1.6.2 外源蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 1.6.3 影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素 |
| 1.7 曲霉的转化 |
| 1.7.1 米曲霉的营养缺陷型筛选标记 |
| 1.7.2 米曲霉的抗药型筛选标记 |
| 1.7.3 曲霉的转化 |
| 1.8 本课题研究内容和研究意义 |
| 1.8.1 本课题的研究内容 |
| 1.8.2 本课题的研究意义 |
| 1.8.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液与缓冲液 |
| 2.1.5 培养基与抗生素 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 米曲霉的培养及孢子悬液的制备 |
| 2.2.2 米曲霉基因组、总RNA的提取与纯化 |
| 2.2.3 米曲霉cDNA的合成 |
| 2.2.4 重组质粒pMAL-c4x-acbp的构建 |
| 2.2.5 蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.6 目标蛋白与酰基辅酶A的结合实验 |
| 2.2.7 米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选 |
| 2.2.8 米曲霉酰基辅酶A结合蛋白过表达载体构建 |
| 2.2.9 原生质体法转化米曲霉体系的建立 |
| 2.2.10 米曲霉不同生长时间ACBP表达水平变化 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 重组表达质粒pMAL-c4x-acbp的构建 |
| 3.1.1 米曲霉总RNA的提取 |
| 3.1.2 cDNA的合成及acbp基因的克隆 |
| 3.1.3 重组质粒pMAL-c4x-acbp的构建 |
| 3.2 蛋白表达与纯化 |
| 3.2.1 重组蛋白MBP-AoACBP的表达 |
| 3.2.2 重组蛋白MBP-AoACBP与MBP标签的纯化 |
| 3.2.3 蛋白的浓度测定 |
| 3.3 重组蛋白MBP-AoACBP与酰基辅酶A的结合实验 |
| 3.4 米曲霉acbp基因过表达菌株的构建 |
| 3.4.1 米曲霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的获得 |
| 3.4.2 ACBP真菌过表达载体ANEp8-acbp的构建 |
| 3.4.3 米曲霉原生质体的制备 |
| 3.4.4 米曲霉原生质体的转化 |
| 3.5 不同生长时间米曲霉acbp基因的转录水平 |
| 3.5.1 不同生长时间米曲霉总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 3.5.2 荧光定量RT-PCR |
| 3.6 不同生长时间米曲霉ACBP的表达水平变化 |
| 3.6.1 绘制标准曲线 |
| 3.6.2 不同生长时间米曲霉总蛋白的浓度 |
| 3.6.3 蛋白免疫印迹法检测ACBP蛋白的表达水平 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 论文发表情况 |
| 8 致谢 |
（8）抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 草甘膦生产及发展 |
| 1.2 草甘膦性质及作用机理 |
| 1.2.1 草甘膦结构及理化性质 |
| 1.2.2 草甘膦的优缺点 |
| 1.2.3 草甘膦作用机制 |
| 1.3 草甘膦抗性来源 |
| 1.4 EPSPS研究进展 |
| 1.4.1 EPSP合酶分类 |
| 1.4.2 EPSP合酶的定位和转运肽 |
| 1.4.3 EPSP合酶的高级结构与活性区 |
| 1.4.4 EPSPS基因研究 |
| 1.5 抗草甘膦转基因作物的发展 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 1.7 本研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌种与载体 |
| 2.1.2 供试除草剂 |
| 2.1.3 供试培养基 |
| 2.1.4 常用试剂配制方法 |
| 2.1.5 试剂盒、酶及其它试剂耗材 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 菌株TY-JM的分离鉴定及系统发育树研究 |
| 2.2.1 菌株TY-JM的富集、分离与纯化 |
| 2.2.2 菌株TY-JM的形态学研究 |
| 2.2.3 菌株TY-JM的生理生化特性测定 |
| 2.2.4 18S rRNA的PCR扩增和序列测定 |
| 2.2.5 系统发育树的构建 |
| 2.3 菌株TY-JM的cDNA文库构建 |
| 2.3.1 TY-JM总RNA的提取 |
| 2.3.2 菌株全长cDNA文库的构建及文库质量鉴定 |
| 2.4 菌株TY-JM的EPSPS基因克隆 |
| 2.4.1 引物设计 |
| 2.4.2 PCR扩增EPSPS基因片段 |
| 2.4.3 目的片段回收 |
| 2.4.4 连接载体 |
| 2.4.5 转化及克隆检测 |
| 2.4.6 测序 |
| 2.4.7 生物信息学分析 |
| 2.5 菌株TZ1985的EPSPS基因克隆 |
| 2.5.1 基因组DNA的提取 |
| 2.5.2 菌株TZ1985的AROM基因DNA片段分离 |
| 2.5.3 菌株TZ1985的EPSPS基因片段分离 |
| 2.6 EPSPS基因的原核表达研究 |
| 2.6.1 制备带酶切位点的EPSPS基因片段 |
| 2.6.2 制备载体 |
| 2.6.3 连接重组质粒 |
| 2.6.4 重组质粒的测序验证 |
| 2.6.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.6.6 重组大肠杆菌草甘膦抗性的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗草甘膦菌株TY-JM的分离鉴定 |
| 3.1.1 菌株的分离 |
| 3.1.2 菌株的形态学特征 |
| 3.1.3 菌株的生理生化特性 |
| 3.1.4 18S rRNA序列分析 |
| 3.1.5 基于18S rRNA序列的系统发育树构建 |
| 3.2 菌株TY-JM的cDNA文库构建 |
| 3.2.1 TY-JM总RNA质量分析 |
| 3.2.2 合成ds cDNA的PCR最佳循环数的确定 |
| 3.2.3 cDNA片段化分级分离 |
| 3.2.4 文库质量鉴定 |
| 3.3 菌株TY-JM的EPSPS基因克隆 |
| 3.4 菌株TZ1985的AROM基因同源序列的确定 |
| 3.5 TZ1985的AROM基因DNA片段扩增 |
| 3.6 菌株TZ1985的EPSPS基因克隆 |
| 3.7 EPSPS基因序列分析 |
| 3.8 EPSPS基因原核表达研究 |
| 3.8.1 制备带酶切位点的基因片段 |
| 3.8.2 原核表达载体构建 |
| 3.8.3 转化大肠杆菌及阳性克隆子检测 |
| 3.8.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.8.5 重组大肠杆菌草甘膦抗性的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抗草甘膦菌株TY-JM的分离鉴定 |
| 4.2 cDNA文库构建及文库质量鉴定 |
| 4.3 EPSPS基因的克隆与表达研究 |
| 4.4 EPSPS基因的进一步研究 |
| 5 结论 |
| 5.1 菌株TY-JM鉴定为假丝酵母菌 |
| 5.2 成功构建了菌株TY-JM的cDNA文库 |
| 5.3 EPSPS基因的克隆与序列分析 |
| 5.4 TY-EPSPS和TZ-EPSPS具有抗草甘膦功能 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）转基因烟草对土壤磷吸收利用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 植物适应低磷胁迫的机制及相关基因工程研究进展 |
| 1.1 土壤中磷素营养状况 |
| 1.2 磷在土壤中的循环、转化及有效性 |
| 1.2.1 磷在土壤—植物生态系统中的循环 |
| 1.2.2 磷在土壤中的转化及有效性 |
| 1.3 缺磷对植物的影响 |
| 1.3.1 磷营养与植物生长发育 |
| 1.3.2 磷营养与植物光合作用 |
| 1.3.3 磷营养与植物的产量和品质 |
| 1.4 植物适应低磷胁迫的生理学机制 |
| 1.4.1 根系形态和空间构型 |
| 1.4.2 根冠间的互作 |
| 1.4.3 根系分泌物 |
| 1.4.4 土壤微生物 |
| 1.5 根系分泌物中有机酸的分泌及活化土壤难溶磷的机制 |
| 1.5.1 根系有机酸的分泌机制 |
| 1.5.2 根系有机酸活化土壤难溶磷的机制 |
| 1.6 有机酸代谢途径基因的基因工程研究进展 |
| 1.6.1 柠檬酸合酶基因cit的基本原理 |
| 1.6.2 柠檬酸合酶基因cit的研究现状 |
| 1.6.3 苹果酸脱氢酶基因mdh的基因工程原理 |
| 1.6.4 苹果酸脱氢酶基因的研究现状 |
| 1.7 本论文研究目的及意义 |
| 2 Po-mMDH和Po-mCit基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 菌种与质粒 |
| 2.1.3 主要药品 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要配制试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 草酸青霉菌总RNA的提取 |
| 2.2.2 Po-mMDH和Po-mCit编码区部分片段的克隆 |
| 2.2.3 Po-mMDH和Po-mCit cDNA的5’端序列克隆 |
| 2.2.4 Po-mMDH和Po-mCit cDNA的3’端序列克隆 |
| 2.2.5 Po-mMDH和Po-mCit基因cDNA全长序列克隆 |
| 2.2.6 Po-mMDH和Po-mCit基因编码蛋白的分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Po-mMDH和Po-mCit基因cDNA全序列的克隆 |
| 2.3.2 Po-mMDH基因序列及同源性分析 |
| 2.3.3 Po-mCit基因序列及同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 Po-mMDH和Po-mCit基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 菌种与质粒 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要配置试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Po-mMDH和Po-mCit基因原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 Po-mMDH和Po-mCit基因的表达与纯化 |
| 3.2.3 蛋白质浓度测定 |
| 3.2.4 SDS-PAGE |
| 3.2.5 酶活性测定 |
| 3.2.6 磷溶解能力测定 |
| 3.2.7 上清液含磷量和有机酸含量检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组Po-mMDH和Po-mCit的分离纯化 |
| 3.3.3 Po-mMDH基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.4 Po-mCit基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Po-mMDH基因植物表达载体构建及烟草表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 菌种与质粒 |
| 4.1.3 主要药品 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 主要配制试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Po-mMDH基因植物表达载体的构建 |
| 4.2.2 Po-mMDH基因转化烟草 |
| 4.2.3 转化植株的分子检测 |
| 4.2.4 转基因烟草根部MDH活性分析 |
| 4.2.5 转基因烟草根部malate含量和根分泌malate量 |
| 4.2.6 转基因烟草在低可利用磷介质中的生长状况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Po-mMDH基因植物表达载体的构建 |
| 4.3.2 Po-mMDH基因的烟草转化及分子检测 |
| 4.3.3 转基因烟草根系的MDH活性分析 |
| 4.3.4 转基因烟草根系和根分泌的苹果酸含量 |
| 4.3.5 转基因烟草对难溶性无机磷的利用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Po-mCit基因植物表达载体构建及烟草表达 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 菌种与质粒 |
| 5.1.3 主要药品 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 主要配制试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Po-mCit基因植物表达载体的构建 |
| 5.2.2 Po-mCit基因转化烟草 |
| 5.2.3 转化植株的分子检测 |
| 5.2.4 转基因烟草根部Cit活性分析 |
| 5.2.5 转基因烟草根部citrate含量和根分泌citrate量 |
| 5.2.6 不同磷条件下转基因烟草的生长状况 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.3.1 Po-mCit基因植物表达载体的构建 |
| 5.3.2 Po-mCit基因的烟草转化及分子检测 |
| 5.3.3 不同磷条件下转基因烟草柠檬酸合酶活性分析 |
| 5.3.4 不同磷条件下转基因烟草根中和根分泌的柠檬酸含量 |
| 5.3.5 不同磷条件下转基因烟草的生长和磷营养状况 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新点摘要 |
| 有待进一步开展的工作 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）奎尼酸生物合成的代谢工程研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 奎尼酸的分布及其应用价值 |
| 2 生产奎尼酸的方法 |
| 3 代谢工程在奎尼酸生产中的应用 |
| 4 奎尼酸生物合成的策略与优化 |
| 第一章 qutB基因系列表达质粒的构建 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二章 qa-3基因的克隆与改造 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 奎尼酸生物合成途径的构建 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四章 奎尼酸的初步发酵与分离鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 附录一: 博士学习期间发表的综述和论文(全文) |
| 附:发表文章 |
四、构巢曲霉奎尼酸脱氢酶基因qutB在大肠杆菌中的克隆与表达（论文参考文献）
- [1]代谢工程改造酿酒酵母生产酪醇及红景天苷的研究[D]. 郭伟. 山东大学, 2020(08)
- [2]具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌的构建及其应用研究[D]. 区晓阳. 华南理工大学, 2020(01)
- [3]黑曲霉产糖化酶菌株的多组学分析和NADPH辅因子代谢工程探索[D]. 隋雨菲. 华东理工大学, 2020(08)
- [4]大肠杆菌中EP-bifido途径的构建用于高效生产乙酰辅酶A衍生物[D]. 徐家盛. 山东大学, 2018(02)
- [5]强化酿酒酵母乙酰辅酶A途径的β-香树脂醇合成[D]. 樊婧婧. 北京理工大学, 2018(07)
- [6]萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成[D]. 卞光凯. 武汉大学, 2017(06)
- [7]米曲霉酰基辅酶A结合蛋白基因的克隆鉴定[D]. 郝庆. 天津科技大学, 2016(05)
- [8]抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究[D]. 于海涛. 东北农业大学, 2012(03)
- [9]转基因烟草对土壤磷吸收利用的研究[D]. 吕军. 大连理工大学, 2011(06)
- [10]奎尼酸生物合成的代谢工程研究[D]. 刘礼兵. 中国人民解放军军事医学科学院, 2006(04)