解飞霞[1]2003年在《对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28与对虾鳃细胞膜蛋白的分离和结合活性分析》文中认为使用差速离心、蔗糖垫和蔗糖密度梯度离心法，从人工感染白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)的克氏原螯虾中提取WSSV，Bradford法测定病毒浓度为0.912mg／ml。分别取1ml的病毒悬液，用两种离子型表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)和脱氧胆酸钠，及两种非离子型表面活性剂Triton X-100和Tween-20室温处理30min后，经不连续蔗糖梯度(40％—52％)离心和SDS-PAGE显示，确定这四种表面活性剂都可以增溶病毒囊膜的蛋白VP28。当病毒浓度为0.912mg／ml时，SDS、脱氧胆酸钠、Triton X-100和Tween-20增溶WSSV囊膜蛋白VP28的最佳浓度(v／v)分别为0.5％、1％、1％、1.5％。 地高辛(DIG,Digoxigenin-3-0-methylcarbonyl-e-aminocaproic acid-N-hydro xysuccinimide ester)标记完整的病毒粒子，标记产量为300pg／μl。标记的病毒用2％(v／v)非离子表面活性剂Tween-20增溶后，经阳离子交换层析(CM-sep harose)纯化，得到了电泳纯的病毒囊膜蛋白VP28。纯化的VP28与对虾鳃细胞膜的结合实验表明，VP28不能与对虾鳃细胞膜结合，即纯化的VP28不具有结合活性。 以健康对虾的鳃组织为材料，经过差速离心后获得对虾鳃细胞膜。测定蛋白浓度后，用地高辛进行标记，并测得标记后的产量为300pg／μL；SDS-PAGE得出对虾鳃细胞膜的多肽图谱；并与对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)进行体外结合实验，确定标记后的对虾鳃细胞膜具有结合活性。 对虾鳃细胞膜经过不同温度、pH、表面活性剂、无机盐离子浓度、DTT(二硫苏糖醇)、有机溶剂，及超声波处理后，再与WSSV结合。结果显示：对虾鳃细胞膜在25℃—45℃之间结合活性没有明显下降，但经煮沸5min后，结合活性丧失；pH的变化可以改变对虾鳃细胞膜的结合活性，其中在pH5和pH8时，活性比其它的pH值要高；NaCl不会使对虾鳃细胞膜的结合活性丧失，但NaCl浓度在1.5M和2.0M时可使其结合活性明显下降；硫酸铵在浓度为1M时对虾白斑综合症病毒仪SSV)囊膜蛋白vp28与对虾鳃细胞膜蛋白的分离和结合活性分析对虾鳃细胞膜的结合活性最高，在低于或高于IM时都会对虾鳃细胞膜的结合活性受到影响;超声波对虾鳃细胞膜的活性影响较大，作用时间505就可使对虾鳃细胞膜的活性丧失。共选用了5种表面活性剂处理对虾鳃细胞膜，包括Tween-Zo、NP并。、TritonX一00、脱氧胆酸钠、sDS(十二烷基磺酸钠)，作用浓度均为2%。前4种表面活性剂对结合活性有影响但不能使结合活性完全丧失，而SDS可使对虾鳃细胞膜的活性丧失。在上述各种表面活性剂中加入了0.IM二硫苏糖醇，实验结果区别很小，证实二硫苏糖醇对对虾鳃细胞膜的结合活性既没有起到保护的作用也没有起到破坏的作用。随着蔗糖浓度的加大，对虾鳃细胞膜的结合活性也随着下降，但是当蔗糖浓度达到62%时，对虾鳃细胞膜的结合活性仍然没有完全丧失。在有机溶剂中，叁氯乙酸可使对虾鳃细胞膜的结合活性丧失，乙醇、丙酮可使对虾鳃细胞膜的结合活性有所下降，但不能完全丧失。 经2%Tween一20处理的对虾鳃细胞膜，CM一sephar0Se FF离子交换层析，得到3个洗脱峰;合并浓缩后测定与WSSV的结合活性，并将活性组分进行SDS一PAGE得到其蛋白多肤图谱。2%Tween一20处理后的对虾鳃细胞膜经过S叩hadexG一75凝胶过滤层析，浓缩后测定与wssv的结合活性，将得到的活性与蛋白量之比的最高峰进行SDS一队GE得到其蛋白多肚图谱。将离子交换的活性组分多肤图谱与凝胶过滤的活性组分多肤图谱相比较，得出分子量约为53KD的对虾鳃细胞膜蛋白具有与WSSV结合的活性。 将对虾鳃细胞膜与不同浓度的肝素钠混合，室温放置3h，发现对虾鳃细胞膜不再具有与WSSV结合的能力。将病毒与不同浓度的肝素钠混合放置同样的时间，却并未使病毒丧失与对虾鳃细胞膜结合的能力。从而推断肝素钠能够与病毒竞争对虾鳃细胞膜上的结合位点。
秦崇涛[2]2012年在《对虾白斑综合症病毒性质和蛋白激酶wsv083的研究》文中研究指明对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是一种杆状DNA病毒，具有囊膜和被膜，DNA为双链环状。WSSV是目前对虾的最主要的病害，对对虾养殖业造成了巨大危害。所以对WSSV的性质和感染机制等研究对于对虾养殖业意义重大。本研究的主要内容如下：①测定WSSV粒子的质量和其基本组成；②探讨微生物在感染了WSSV的螯虾死亡过程中所起的作用；③研究了WSSV囊膜表面的蛋白的种类；④对WSSV的一个蛋白激酶wsv083进行了初步研究。结果如下：1、通过先计算出WSSV基因组的质量，再测定WSSV的基因组DNA占整个WSSV粒子质量的比例的思路，计算出了一个完整WSSV粒子的质量。进一步测定得到WSSV悬液的每个OD600相当于3.34×108/l的病毒浓度。另外，WSSV各组分在总重量中的比例经测定如下：基因组DNA占10.17%，核衣壳中的蛋白占43.07%，囊膜中的脂类含量约为22%，囊膜中的蛋白质含量约为24.76%；另外还测定了四种主要膜蛋白的相对比例。2、为了研究微生物在感染了WSSV的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的死亡过程中的作用，对染毒螯虾注射抗生素，发现其死亡率与对照组相比有明显下降。平板计数结果显示染毒螯虾的血淋巴中微生物数量有明显增加。分析表明主要是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）和琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）等条件致病菌。而抗生素对WSSV的增殖没有显着影响。研究结果表明螯虾在感染了WSSV后血细胞的消失导致体内病原微生物的数量大幅增加，从而加速了螯虾的死亡速度。3、利用生物素标记转移技术对牛血清白蛋白（BSA）和凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白进行标记，研究其与对虾白斑综合症病毒（WSSV）之间的相互作用。发现分子量在50-56KD之间的两种蛋白质位于WSSV的表面，并且与鳃细胞膜蛋白具有特异性的相互作用。根据分子量推测可能是病毒的两种膜蛋白，VP52A和VP56。4、把wsv083在大肠杆菌中进行表达和纯化，与纯化的VP28和VP19置于激酶缓冲液中看能否催化磷酸化。研究结果表明wsv083并不具备这个功能。另外还发现wsv083存在苏氨酸和酪氨酸的磷酸化，但没有丝氨酸的磷酸化。而wsv083的突变体则没有磷酸化。结果表明wsv083可以催化自身磷酸化。但其具体功能还需进一步研究。
李一宁[3]2009年在《对虾白斑综合症病毒（WSSV）VP36A的原核表达及其功能的初步研究》文中提出对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是导致1992年以来世界性对虾爆发性死亡的主要病原,至今仍给我国对虾养殖业带来重大经济损失。目前对WSSV的研究主要集中于寻找WSSV与宿主相结合的粘附蛋白上,从而研制相应的阻断疫苗以达到防治目的。以前研究表明VP36A(以表观分子量命名)是WSSV中含量很少的一个囊膜蛋白,含有RGD (Arg-Gly-Asp)细胞粘附序列,本实验室用噬菌体展示技术研究发现,VP36A与虾鳃细胞膜有结合活性,还可与WSSV竞争结合对虾鳃细胞膜,提示VP36A可能是WSSV的一个粘附蛋白。本文在此基础上用原核表达的VP36A用ELISA、细胞培养、免疫印迹等技术继续研究其功能。本实验基于中国株WSSV的vp36a基因设计了一对引物,并引入NheI和HindⅢ酶切位点,PCR扩增出VP36A的基因片段,定向克隆至原核表达质粒pBADgⅢB,经酶切、菌落PCR鉴定后测序,表明成功构建了原核表达载体pBADgⅢB-VP36Ao将重组质粒转化进大肠杆菌后经L-阿拉伯糖浓度梯度和不同时间诱导优化表达条件,最后确定用0.2%L-阿拉伯糖诱导4h,SDS-PAGE和Western Blot分析在菌体裂解沉淀中可见40KD左右的特异性条带,表明重组VP36A以包涵体形式在大肠杆菌中得到了成功表达。大量发酵Top10-pBADgⅢB-VP36A菌体,用金属螯合亲和层析柱对rVP36A进行了纯化以继续后续研究。从VP36A序列中选取抗原性较高的两段氨基酸序列,分别合成小肽并免疫新西兰大白兔,得到抗血清经亲和层析纯化,ELISA法检测抗体效价均达到1：10000。用纯化的抗体对重组VP36A进行Western Blot分析,呈现特异性条带,表明所制备抗体对重组VP36A均具有良好抗体反应活性；但对病毒中的天然VP36A没有预期的反应条带,其原因有待于进一步研究。用ELISA结合实验和荧光显微镜法分别验证了VP36A与对虾鳃细胞膜、血淋巴细胞具有结合活性。进一步用Far Western Blot从虾鳃细胞膜蛋白和WSSV结构蛋白中钓取与VP36A相互作用的蛋白,结果表明WSSV的一个结构蛋白可能与VP36A结合,对虾鳃细胞膜的一个32KD左右蛋白可能与VP36A结合。这两个蛋白需要进一步用质谱鉴定。本研究表明一个WSSV蛋白和一个对虾鳃细胞膜蛋白和VP36A有结合作用,下一步需进行蛋白鉴定并验证其结合作用,以期为WSSV的分子病毒机制研究提供一定的理论基础。
韩亚利[4]2017年在《WSSV-CN04的基因组测定与感染性分析》文中研究指明对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是严重阻碍对虾养殖业健康发展的主要病害之一,能够导致养殖的对虾大规模死亡。在本研究中,我们从自然感染的日本囊对虾中分离出了一株新的WSSV,命名为WSSV-CN04。全基因组测序表明WSSV-CN04的基因组长度为281,054 bp,编码157种蛋白。序列比对表明WSSV-CN04的基因组序列与低毒株WSSV-CN03密切相关,具有97.5%的同源性。值得注意的是,WSSV-CN04的主要囊膜蛋白VP24不仅C-末端有片段缺失,而且在病毒粒子中也检测不到。由于VP24之前被报道是一种几丁质结合蛋白,通过介导WSSV-几丁质相互作用对WSSV经口腔途径的感染有着至关重要的作用。因此本研究我们进一步分析了WSSV-CN03和WSSV-CN04通过口腔途径感染凡纳滨对虾的情况。结果表明:由于WSSV-CN04的VP24基因部分缺失,导致剩余部分无法定位到病毒粒子的囊膜上。缺失VP24的病毒粒子减弱了与消化道中几丁质组分的结合能力,更容易被排出消化道,造成病毒粒子在消化道的滞留时间减少,降低了病毒粒子穿过消化道壁进入体内的机会,从而体现出较弱的感染性。本文的研究进一步证明了VP24在WSSV经消化道途径感染中的重要作用,这为防治WSSV病毒感染提供了新的思路和方法。
梁艳[5]2005年在《白斑综合征病毒（WSSV）粘附蛋白及与其相互作用的对虾细胞膜蛋白定位》文中认为白斑综合征病毒(white spot syndrome, WSSV)是引起养殖对虾大规模死亡主要病毒性病原。本文定位了WSSV的4种粘附蛋白,并得到与粘附蛋白之一VP37相互作用的对虾细胞膜53 kDa蛋白,为进一步阐明WSSV致病的分子机理提供理论基础。本文首先通过地高辛(DIG)标记的WSSV与中国明对虾原代培养的多种细胞(心脏、类淋巴器官、造血组织、血细胞等)存在特异性的结合作用,证实了对虾细胞上存在WSSV的受体。再用地高辛标记的对虾血细胞膜和鳃细胞膜蛋白与印迹到硝酸纤维素膜上,通过SDS-PAGE分离的病毒蛋白结合,定位了WSSV的4种粘附蛋白,分别为:37 kDa,39 kDa,和高于97 kDa的2个蛋白。通过质谱分析获知VP 37是wsv254编码的蛋白。根据毕赤酵母的嗜性对粘附蛋白vp37基因改造后人工合成,在毕赤酵母中成功表达得到有活性的重组目的蛋白rVP37。并通过Ni~(2+)亲和层析的作用,得到与VP37相互作用的53 kDa对虾鳃细胞膜蛋白。这一结果与2% Tween-20处理WSSV,其组份分别经过离子交换层析和凝胶过滤层析及ELISA活性验证,确定53 kDa对虾膜蛋白具有结合活性的结果相符。质谱分析推测该蛋白与ATP synthase beta subunit (Drosophila melanogaster)有较高的同源性。洗脱回收粘附蛋白之一VP 37,免疫兔子制备抗血清,能与VP 37特异性结合,同时在较高分子量范围的病毒蛋白和VP 37在抗原性上没有相似性。对VP37含有“R G D”结合结构域的9个氨基酸功能小肽(L I Q E R G D E I)人工合成后验证活性,发现“R G D”对结合活性起重要作用,但不代表VP37结合活性的全部。VP 28是WSSV囊膜的主要结构蛋白之一,本文使用表面活性剂处理得到的电泳纯VP 28,并ELISA实验验证其结合活性。结果显示VP 28不能与对虾鳃膜蛋白结合。选取凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的4种组织(鳃、血淋巴、肝胰腺、肌肉),着重对膜蛋白的提取方法及其多肽组成进行了初步分析。确定了这几种
张莉[6]2005年在《白斑综合症病毒（WSSV）VAP1基因在酵母双杂交系统中的应用及对虾鳃膜蛋白P53的初步研究》文中指出对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对虾暴发性流行病的主要病原,严重危害对虾养殖业。病毒入侵宿主首先要和靶细胞上对应的特异性受体结合,然后在宿主细胞内大量增殖。深入了解WSSV的感染机制,找到编码受体蛋白的基因,无疑对病害的防治具有基础性意义。本实验把病毒粘附蛋白VAP1的基因进行改造后将其应用于酵母双杂交系统Ⅲ,以探索用于筛选与其相互作用的对虾基因的可行性。 VAP1是白斑综合症病毒(WSSV)囊膜上与宿主有结合活性的粘附蛋白之一,已证实它在酵母双杂交系统中作为诱饵蛋白时存在自激活活性。在其C-末端有一个大的跨膜疏水区,拟去除该跨膜疏水区,即把粘附蛋白VAP1的C-末端去除对应的34个氨基酸。在WSSV全基因组中,针对VAP1基因特定位点去除102个bp后,用Primer Premier软件设计了一对引物,并引入Nde Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点,PCR扩增后,酶切、纯化,并定向连接于载体pGBKT7,然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,提取转化菌的质粒后进行PCR以及双酶切鉴定,确定有重组子后进行测序,结果表明序列完全正确。提取重组质粒并分别转化AH109、Y187酵母感受态细胞,选择性培养基鉴定结果表明:表达的诱饵融合蛋白没有激活报告基因HIS3和ADE2,但激活了MEL1。可利用HIS3和ADE2这两种报告基因进行双杂交筛选。 用文库菌株AH109[cDNA Library]和含融合质粒的菌株Y187[pGBKT7-VAP1]做酵母融合,经TDO、QDO缺陷型培养基筛选,并反复划线培养于QDO缺陷型培养基并结合PCR技术确定了一个阳性克隆。对PCR扩增得到的cDNA片段进行测序,其长度为649bp。以+2阅读框分析其核苷酸序列,该序列从终止密码子(TAA)之前即为一个开放阅读框(ORF),这可能即为该段DNA所编码的蛋白。将该cDNA片段于NCBI中经BLASTP同源性比较分析,结果表明其表达的蛋白与一未命名蛋白产物(Unnamed protein product)的同源性最高为59%,与蛋白酶的同源性为38%,与Cell wall mannoprotein,acceptor of B1-6 glucan的同源性为26%。从病毒与鳃膜蛋白的特异性结合推测该蛋白很可能是一种蛋白酶,它与病毒粘附蛋白的结合类似于酶与底物的结合,具有高度的专一
易志刚[7]2003年在《噬菌体表面展示技术用于对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白的研究》文中提出对虾白斑综合症病毒(WSSV)是养殖对虾的一个主要病原，严重阻碍对虾养殖业的发展。WSSV基因组全序列的测定为其侵染机理的研究奠定了基础，其基因组学的研究重点正转向功能基因组学，即对其众多基因产物的解析。病毒的吸附蛋白作为病毒最先与宿主发生相互作用的蛋白，启动病毒的整个侵染过程，在病毒的生殖周期中发挥着相当重要的作用，也成为病毒防治的一个热点。WSSV的吸附蛋白(Virus attachment protein，VAP)的基因至今还未完全定位。WSSV已定位其基因的囊膜蛋白中的两种，VP28据报道在病毒入侵中发挥重要作用，可能是WSSV的一个吸附蛋白；另一定位的囊膜蛋白VP281序列分析中含有一细胞吸附序列(cell attachment sequence)，可能在病毒吸附中发挥作用。本研究对此2个蛋白进行噬菌体表面展示，确认其对宿主的吸附活性。另外通过对WSSV全序列的分析，找到数个可能的编码囊膜蛋白的开放阅读框(ORF)，分别对其进行展示，分析其对宿主细胞的结合活性。 用纯化的WSSV病毒粒子免疫新西兰大白兔，制备了WSSV的多克隆抗血清，用于病毒蛋白的定位。从对虾组织提取细胞膜粗膜制剂，包被96孔板，用地高辛标记的WSSV病毒与之结合，用酶标的抗地高辛抗体显色系统对其进行检测，确定其结合关系。以肝胰腺细胞膜、肌肉细胞膜、大肠杆菌包板作为阴性对照，结果显示病毒只与其敏感组织虾鳃细胞膜有明显特异性结合现象；未标记病毒与标记病毒竟争结合虾鳃细胞膜，证实了WSSV与虾鳃细胞膜间的特异性结合关系，显色反应的强弱指示结合活性的大小。绕过组织培养，建立了一个评价病毒粘附蛋白及虾受体蛋白结合活性的方法。虾细胞膜在变性条件下(SDS-PAGE)丧失病毒结合活性，提示此受体蛋白活性的结构依赖性。 对两个已经鉴定的WSSV囊膜蛋白VP28、VP281的基因进行了噬菌体表面展示。在WSSV全基因组中，针对VP28，VP281基因特定位点，用Primer Premier软件分别设计了一对引物，并引入Not Ⅰ，Sfi Ⅰ酶切位点，PCR扩增后，酶切、连接于噬菌体表面展示载体pCANTAB 5E，转导E. coli TG1，用辅助噬菌体M13K07进行超感染，得到展示VP28、VP281的重组噬菌体；重组噬菌体用Anti-E-tag抗体检测E-tag序列的表达与否；用WSSV的多克隆抗血清检测展示的VP28、VP281的抗原性。外源基因片段都得到了表达，VP28、VP281都保持较好的抗原性；展示的VP28、VP281与虾鳃细胞膜进行结合实验，结果VP28、VP281都没有结合活性，证明VP28、VP281可能不是WSSV的吸附蛋白。 分析WSSV全基因组序列，从中选取8个可能编码囊膜蛋白的开放阅读框(ORF)，设计PCR引物，对其进行噬菌体表面展示；用Anti-E-tag的抗体对展示ORF的重组噬菌体进行筛选，筛选出表达E-tag序列，即展示外源片段的重组噬菌体；展示ORF的重组噬菌体与包被于酶标板的虾鳃细胞膜进行结合实验，筛选出能与虾细胞膜结合的ORF的重组子；用能与虾鳃细胞膜结合的ORF展示产物与地高辛标记的WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，看是否能竞争病毒与虾鳃细胞膜的结合。除ORFS#不能展示外，其余7个ORF都能获得展示;其中有4个ORF表现出与虾鳃细胞膜的结合活性，用此4个展示的ORF与WSSV竞争结合虾鳃细胞膜，其中只有ORFI#表现出竞争结合活性，提示此ORF可能编码WSSV的一个吸附蛋白。 用展示ORF的重组噬菌体感染五col了HBZ 1 51，从SOBAGN平板上挑取克隆，提取质粒鉴定插入片段，对阳性克隆进行增值，工PTG诱导表达。提取表达细胞的周质空间蛋白，进行免疫印迹实验(Westernblot)，用Anti一E一tag的抗体检测E一tag序列的表达情况;用WSSV的多克隆抗体对表达的蛋白进行定位。ORFI#能成功检测到E一tag序列的表达，即ORFI#蛋白的表达，得到2分子量分别为35.SKD、29.SKD的蛋白条带;用病毒多克隆抗体对其定位，未检测到阳性结果。其余ORF未检测到E一tag序列的表达。对表达成功的ORFI#的基因序列进行分析发现，在ATG下游有两个TATA box，且其后紧跟与第一个ATG同框的ATG起始密码子，其长度为8 1 3bp，编码蛋白的理论分子量为30.25KD。蛋白序列分析的结果发现其有烷基化、磷酸化、N糖基化等蛋白修饰位点。 本研究把噬菌体表面展示技术应用于WSSV囊膜蛋白的研究，证实已报道的wSSv的2囊膜蛋白vP28、vP281对宿主细胞没有结合活性;找到一个可能编码病毒吸附蛋白的ORF，对其蛋白序列分析，存在潜在的蛋白修饰位点。
冯书营[8]2004年在《不同宿主及不同组织细胞与白斑综合症病毒（WSSV）的结合研究》文中提出本文利用病毒与其宿主细胞上受体蛋白的特异性结合原理，建立了用于研究WSSV与宿主细胞结合的荧光素标记法，该方法具有简单、快捷、经济性等优点。在该方法的基础上初步查明了在日本囊对虾、凡纳滨对虾和克氏原螯虾等宿主的不同组织细胞与WSSV的结合特异性。日本囊对虾的鳃细胞和血细胞能够与WSSV发生特异性的结合，肝胰腺细胞和肌细胞与WSSV没有该结合关系，该特异性的结合关系反映出组织细胞上存在有病毒特异性的受体蛋白。凡纳滨对虾和克氏原螯虾二者宿主不同组织细胞与WSSV的结合结果与日本囊对虾宿主不同组织细胞的结合结果存在着相似性和一致性，凡纳滨对虾和克氏原螯虾的鳃细胞、血细胞和甲壳下表皮组织与WSSV产生了特异性的结合，肌细胞和肝胰腺细胞没有此结合关系，不仅查明了WSSV在二者宿主上不同组织细胞结合的特异性，而且初步弄清了WSSV在不同宿主相同组织细胞上的结合共性，可以得出病毒侵染组织细胞的共同性，加速病毒受体的确定和分离工作。 为了查明WSSV在不同宿主不同组织细胞上的结合活性高低，又分别提取了各宿主的组织细胞膜与WSSV进行了结合试验，其结果显示：凡纳滨对虾的鳃细胞膜、血细胞膜和甲壳下表皮组织细胞膜与WSSV产生了特异性的结合，并以鳃细胞膜的结合活性最高，甲壳下表皮组织细胞膜次之，血细胞膜的结合活性低于二者；肌细胞膜和肝胰腺细胞膜不与WSSV发生结合；不同组织细胞膜与WSSV的结合结果和在细胞上的结合结果完全一致，进一步确定了WSSV在凡纳滨对虾宿主不同组织细胞上的结合特异性。同时比较凡纳滨对虾不同组织细胞膜之间的相互作用，证明了血细胞膜和甲壳下表皮组织膜对鳃细胞膜与WSSV的结合具有封闭抑制作用，初步查明WSSV在凡纳滨对虾宿主不同组织细胞上的受体蛋白是相同的。在克氏原螯虾宿主中，存在类似的结合结果，鳃细胞膜和血细胞膜与WSSV具有特异性的结合，肌细胞膜和肝胰腺细胞膜不与WSSV发生结合，同时比较了凡纳滨对虾鳃细胞膜对克氏原螯虾鳃膜、血细胞膜与WSSV结合活性的影响作用，结果显示了前者对后者与WSSV之间的结合具有封闭抑制作用，初步证明了在二者宿主上WSSV的受体蛋白相同。凡纳滨对虾和克氏原螯虾不同的组织细胞膜经过SDS-PAGE分析，初步确定了各细胞膜的蛋白条带组成。 日本蟳宿主的不同组织细胞膜与WSSV结合试验中，鳃细胞膜和血细胞膜能与WSSV产生结合，并以鳃膜的结合活性稍高一点；肝胰腺细胞膜与肌细胞膜不与WSSV 不同宿主及不同组织细胞与白斑综合症病毒(WSSv)的结合研究产生结合。同时比较了日本崛鳃细胞膜和血细胞膜对凡纳滨对虾鳃膜与WSsV结合的影响作用，证明了前者组织细胞膜对后者鳃细胞膜与WSSV结合基本上没有影响，初步表明WSSV在日本崛和凡纳滨对虾宿主上的结合位点或受体蛋白不同，从侧面说明WSSV的受体蛋白并非单一性的，有可能是多个受体蛋白位点。经过SDS一PAGE对不同细胞膜进行分析，初步确定了各细胞膜的蛋白条带组成。 查明了挠足类细胞膜、卤虫细胞膜和藤壶细胞膜与WSSV之间存在特异性的结合关系，该结合关系表明了在叁者宿主细胞膜上存在有WSSV的受体蛋白，为支持叁者宿主属于WSSV的侵染宿主范围提供了重要依据，为查明叁者宿主在白斑病的暴发和流行过程中所起的作用有着积极的意义。叁者宿主细胞膜经过SDS一PAGE分析，确定了各细胞膜的蛋白条带组成。同时比较了凡纳滨对虾鳃膜对挠足类细胞膜、藤壶细胞膜、卤虫细胞膜与WSSV结合的影响作用，前者对后者的结合有明显的封闭作用，初步说明了WSSV在挠足类、卤虫、藤壶和凡纳滨对虾宿主细胞膜上的受体蛋白相同。表面活性剂Tween 20对挠足类细胞膜与WSSV的结合具有明显的增强作用，而TritonX一100对二者的结合没有明显的影响，初步表明了WSSV的受体蛋白在细胞膜上占有较小的一段跨膜区域。 本文着重查明了以上七种宿主及其不同组织细胞与WSSV结合关系，并进一步比较了提取各种组织细胞膜与WSSV的结合活性，其结果显示了日本蝎、卤虫和藤壶等宿主的结合活性较高，凡纳滨对虾、克氏原鳌虾和挠足类等宿主的结合活性低于前叁者，不仅说明了卤虫和藤壶属于WSSV的侵染宿主，而且证明了二者的结合活性明显高于其它宿主。在日本崛、卤虫和藤壶叁者宿主中以日本崛结合活性最高，卤虫细胞膜和藤壶细胞膜结合活性次之。在凡纳滨对虾、克氏原鳌虾和挠足类叁者宿主中以凡纳滨对虾宿主的结合活性最高，克氏原鳌虾和挠足类二者宿主的结合活性相似，低于凡纳滨对虾宿主。初步查明了WSSV在不同宿主以及不同组织细胞上受体的有无以及不同细胞膜的结合活性高低，加速该病毒受体的确定和进一步分离工作，从而反映出WSSV在白斑病的暴发和流行过程中感染宿主的先后次序以及不同宿主对该病毒病所起的作用，有可能WSsV首先侵染蟹类、藤壶和卤虫等环境宿主，由环境宿主携带和传播WSSV，造成大面积的白斑病的暴发，为控制和监测白斑病的暴发提供了警示线索。最终找到阻断病毒入侵的方法或有效途径，控制对虾白斑病暴发和流行。
王轶南[9]2008年在《对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选》文中提出白斑症病毒(WSSV)病是危害对虾养殖业健康发展的主要疾病之一,十余年来国内外学者已对其进行了大量研究。由于WSSV的囊膜与靶细胞相互作用从而介导病毒对宿主的感染,因此探明这一机理并进而阻断,成为防控WSSV感染的重要途径。本文通过抗WSSV不同囊膜蛋白单克隆抗体的研制,分别获得了抗VP28,VP26及VP19线性表位的单抗;通过WSSV囊膜蛋白单克隆抗体对WSSV的体内与体外中和,筛选得到两株具明显病毒中和作用的抗VP28单抗;应用抗VP28单抗检测分析VP28与宿主细胞的作用关系,论证了其在WSSV感染中的作用;另外,论文通过单抗标记及流式细胞术检测螯虾血细胞内的WSSV,分析了机体感染进程中WSSV对血细胞的感染规律。具体研究内容和结果如下:(1)WSSV囊膜蛋白单抗的研制。差速离心和蔗糖密度梯度离心从对虾鳃组织中分离获得WSSV,之后通过SDS-PAGE、切胶、蛋白洗脱方式分离获得病毒系列蛋白(VP31、VP28、VP26、VP19、以及VP76和VP51左右蛋白)。以获得的病毒蛋白为抗原免疫Balb/C小鼠,采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得3种抗WSSV囊膜蛋白线性表位的单抗,其中抗VP28单抗8株(1D6、2C8、2G3、2H5、3A6、3E1、4B5、5D2),抗VP26单抗3株(2D10、3G7、3H9),抗VP19单抗2株(2C7、2E9)。间接免疫荧光证明各株单抗均与感染WSSV的虾鳃切片呈特异性反应;Western-blot实验证明上述叁组单抗所结合的抗原决定簇分别位于WSSV的VP28、VP26以及VP19上;抗体的亚型分析测定结果表明:单抗1D6,2G3,2H5,3A6,3E1,4B5,5D2, 3G7,3H9,2C7和2E9属IgG亚型;单抗2C8和2D10属IgM亚型。(2)单抗对WSSV的体内中和。以克氏原螯虾(Cambarus proclarkii)动物模型检测WSSV各囊膜蛋白单抗的中和效果。从自然感染的对虾组织中粗提WSSV,将病毒液作一定浓度稀释后与单抗1:1孵育2h,之后皮下注射克氏原螯虾(50μl/只),观察记录螯虾的死亡情况。结果显示2株VP28单抗(1D6,2G3)与病毒混合作用后感染的螯虾组出现死亡的时间(4d,3d)和达到100%死亡率的时间(13d,12d)比对照组(注射未经单抗作用病毒,1d,7d)明显延迟,其他单抗组与对照组相近或稍有提前。结果表明1D6和2G3可明显延缓WSSV对宿主的感染,部分中和了WSSV的感染力。(3)单抗对WSSV的体外中和。通过ELISA实验分析单抗对WSSV与对虾血细胞膜结合的阻断效果验证单抗的中和性。提取中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞膜并对WSSV进行地高辛(DIG)标记,将病毒和各单抗混合作用后吸附对虾血细胞膜,使用抗地高辛抗体检测结合到血细胞膜上的病毒。结果显示单抗1D6,2G3组WSSV的结合量(OD值:0.207,0.235)明显低于对照组(病毒未与单抗作用,OD值:0.401),其它单抗组与对照组差异不明显。结果表明单抗1D6,2G3可以明显降低WSSV和血细胞膜的结合,通过阻碍WSSV与宿主细胞的结合进而延缓病毒感染,两株单抗均具有部分中和作用。(4)VP28与靶细胞作用关系的分析。中国对虾血细胞与提纯的VP28作用后,应用VP28单抗进行免疫荧光染色,结果显示对虾血细胞与VP28作用后细胞边缘呈现特异性荧光亮点;中国对虾血细胞膜与提纯的VP28作用后,应用VP28单抗进行ELISA实验,结果显示呈现阳性反应;对虾血细胞电泳转移至硝酸纤维素膜,铺覆VP28作用后,应用VP28单抗进行免疫印迹试验,结果显示VP28与中国对虾血细胞膜上的72kDa蛋白结合。以上叁项实验均表明洗脱提纯的VP28可与对虾血细胞膜特异性结合,其通过与宿主细胞的黏附作用介导病毒感染,同时推测VP28作用的关键位点为线性结构。(5)WSSV对克氏原螯虾血细胞的感染。通过皮下注射WSSV感染螯虾后每24h收集血细胞,经WSSV单抗及荧光二抗染色后应用流式细胞仪检测,同时记录累积死亡率及血细胞密度。结果显示感染后1-5天:螯虾的累积死亡率为3.3,13.3,16.7,36.7,70.0(%);血细胞被感染比例为6.47,6.93,10.65,26.08,4.94(%);被感染细胞平均荧光强度为10.7,10.89,11.71,13.77,15.47;血细胞密度(×106个/ml)为7.56±0.30,5.60±0.24,4.21±0.30,1.45±0.26,1.21±0.21(未感染为5.34±0.22)。以上结果表明,在机体感染进程中,螯虾血细胞密度呈现先升高后下降的趋势,至后期仅为感染前的1/5;血细胞被感染率同时也呈现了先上升后下降的变化趋势,但被感染血细胞中的病毒量则始终呈上升趋势;血细胞处于最高感染率时机体濒临死亡,表明血细胞的WSSV感染程度与机体的感染状况密切相关。综上,本论文在获得WSSV多种囊膜蛋白单克隆抗体的基础上,成功筛选到两株能够明显中和WSSV的单抗,这为进一步应用中和抗体阻断WSSV感染提供了工具;同时,应用VP28单抗表明了提纯的VP28可通过与宿主细胞发生特异性结合作用,为明确WSSV囊膜蛋白在病毒感染中的作用提供了参考和依据;论文的研究结果对WSSV感染机理和防治研究具有重要意义。
迟妍妍[10]2011年在《抗WSSV-VP37结合蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用》文中研究说明白斑症病毒(WSSV)病是危害对虾养殖业健康发展的主要疾病之一,自1993年暴发以来,国内外学者纷纷对其开展研究。由于病毒粘附蛋白与宿主细胞受体的结合是病毒感染的起始与关键环节,因此,从分子水平上研究WSSV的粘附蛋白及其在宿主细胞表面的结合蛋白,对于弄清WSSV感染机理、探索防治途径具有关键意义。VP37是WSSV的主要囊膜蛋白之一,据报道其抗体具有病毒中和效果,它可能是WSSV一个重要的粘附蛋白。本论文对VP37进行了原核重组表达,利用VOPBA技术鉴定了重组VP37(rVP37)在凡纳滨对虾鳃细胞膜上的结合蛋白,对其纯化后经质谱鉴定为F1ATP合成酶β亚基(β-F1ATPase);用纯化的VP37结合蛋白免疫小鼠,制备了抗VP37结合蛋白的单克隆抗体;研究了该单抗与不同对虾鳃组织的免疫反应,并利用该单抗开展了WSSV与宿主细胞体外结合的阻断研究。具体研究内容与结果如下:(1)VP37结合蛋白的提纯与鉴定。本实验扩增了VP37编码基因,全长843 bp,构建了融合表达载体PET32a-VP37,转入大肠杆菌后成功表达,获得分子量为52 kDa的rVP37蛋白。利用差速离心法提取了凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白,经VOPBA鉴定了rVP37在凡纳滨对虾鳃细胞膜上的结合蛋白,结果显示rVP37能与凡纳滨对虾鳃细胞膜上1条分子量为53 kDa的蛋白带结合。经切胶、电泳洗脱纯化该目的蛋白,质谱鉴定其为β-F1ATPase。(2)抗VP37结合蛋白单克隆抗体的研制。将纯化的VP37结合蛋白为抗原,免疫Balb/C小鼠,细胞融合后,通过间接ELISA法筛选分泌抗VP37结合蛋白的阳性杂交瘤,并采用有限稀释法克隆获得了6株稳定分泌抗VP37结合蛋白的单抗(1A5、1D5、1H5、1E8、2H4和2G5);经间接免疫荧光实验(IIFA)和免疫印迹实验(Western-blot)对该单抗的特性进行分析。IIFA结果显示各株单抗均能与凡纳滨对虾鳃组织发生特异性的荧光反应;Western-blot显示各株单抗均能与凡纳滨对虾鳃细胞膜上分子量为53 kDa左右的蛋白发生特异性结合。抗体类型分析表明:单抗1A5、1H5、1E8、2H4和2G5属IgG类;单抗1D5属IgM类。(3)抗VP37结合蛋白单克隆抗体的初步应用。通过IIFA检测单抗与中国对虾、斑节对虾和日本对虾的鳃组织的免疫反应,发现抗凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37结合蛋白单抗均能与这叁种对虾的鳃组织发生交叉反应,说明这些WSSV易感对虾的鳃细胞上存在着与凡纳滨对虾鳃细胞膜上VP37结合蛋白相同的抗原表位。进而,利用该抗体开展了WSSV与凡纳滨对虾鳃细胞膜体外结合的阻断研究,阻断ELISA结果显示单抗1E8、1H5和2H4能够部分抑制WSSV与凡纳滨对虾鳃细胞膜的结合,暗示了VP37结合蛋白β-F1ATPase可能在WSSV感染凡纳滨对虾的过程中起重要作用。
参考文献：
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[3]. 对虾白斑综合症病毒（WSSV）VP36A的原核表达及其功能的初步研究[D]. 李一宁. 中国海洋大学. 2009
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[6]. 白斑综合症病毒（WSSV）VAP1基因在酵母双杂交系统中的应用及对虾鳃膜蛋白P53的初步研究[D]. 张莉. 中国海洋大学. 2005
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[8]. 不同宿主及不同组织细胞与白斑综合症病毒（WSSV）的结合研究[D]. 冯书营. 中国海洋大学. 2004
[9]. 对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选[D]. 王轶南. 中国海洋大学. 2008
[10]. 抗WSSV-VP37结合蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用[D]. 迟妍妍. 中国海洋大学. 2011