曾小美[1]2004年在《ATP合酶的结构与功能及其在细胞光自养过程中的活性变化》文中认为F1Fo ATP合酶是能量代谢的关键酶,它利用跨膜的质子动力势合成生物体内的能量通货—ATP。叶绿体ATP合酶是由突出于膜外的CF1和嵌于膜内的CF0两部分组成的。CFo形成跨膜的质子通道,并为CF1提供膜上的结合位点。CF1上具有核苷酸结合和催化位点。体外培养的光自养细胞也是研究光合机构形成的一种新材料,其最重要的优点是其生理条件和生长速率的调节及其组织分化容易控制。本文实验工作主要集中在叶绿体ATP合酶(亚基的结构与功能研究、光自养型愈伤组织的诱导培养及其自养过程中光合特性和光合磷酸化活力的变化等方面。叶绿体ATP合酶(亚基定点突变对其功能的影响 利用突变引物和PCR方法将菠菜叶绿体ATP合酶(亚基N端第叁位的亮氨酸(Leu)分别突变为异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)。(亚基及其突变体基因均能在 E.coli中正常表达。检测突变对(亚基功能和ATP合酶合成ATP活力的影响。结果显示(亚基突变体抑制游离CF1或膜结合ATP合酶的Ca2+-ATP水解能力和其堵塞跨膜质子泄漏功能均比野生型的低。Leu突变成Phe或Ile后,突变体蛋白恢复缺失(亚基类囊体膜ATP合成活力的能力比野生型的稍高些,但其它突变体的均比野生型的低。这些结果表明,叶绿体ATP合酶(亚基N端第叁位氨基酸的疏水、非极性和不带电荷性质对(亚基的抑制ATP水解和堵塞跨膜质子泄漏功能是非常重要的。2. 叶绿体ATP合酶(亚基缺失突变对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其ATP合成能力的影响外加(亚基或缺失突变的(亚基蛋白于叶绿体悬浮液中对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力均有促进作用。N端缺失突变的(亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加, 它们对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力的促进作用逐渐减弱, 且它们与缺失(亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐减小; 但是C端缺失突变的(亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加, 它们的促进作用反而逐渐增强, 且与缺失(亚
常静[2]2016年在《玉米类受体蛋白激酶STK1互作蛋白的初步筛选及其USP结构域的克隆和表达分析》文中研究指明玉米既是非常重要的粮食及饲料作物,也是很多化学、医药的原料作物,其产量和质量与人们的生产生活密切相关。花粉发育作为玉米生长过程中一个非常重要的环节,研究其生长规律和抗逆原理就显得尤为重要。课题组利用Ac/Ds转座标签技术,从玉米中克隆了一个花粉特异基因STK1,并对其功能进行了初步研究,发现STK1只在雄穗之中表达,属于类受体胞质蛋白激酶(RLCK),主要包含激酶域和USP结构域。激酶域具有催化作用,可发生磷酸化反应；USP结构域已在其他植物中被证实与抗逆性和生长发育有紧密的联系,但其在玉米尤其是玉米花粉中的作用未知。本次试验克隆了STK1-USP结构域片段,在体外对STK1-USP进行了原核表达和条件优化。STK1通过与其他蛋白互作来影响花粉的发育及抗性,本文利用免疫共沉淀(Co-IP)的方法筛选玉米STK1的互作蛋白。研究结果如下：(1)收集玉米花粉,利用RT*PCR方法获得玉米花粉cDNA.采用PCR扩增技术获得长度为417bp STK1-USP结构域片断,成功构建pET30a-STK1-USP表达载体,之后转化到大肠杆菌BL21体外表达,SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况,His-STK 1-USP融合蛋白的分子量大约有25 kDa(包含17 kDa的STK1-USP和约8 kDa的His标签)。为了得到纯度更高的融合蛋白,优化表达条件,确定了His-STK1-USP融合蛋白在IPTG浓度为1.0 mM,37℃.180 r/min诱导4h,表达情况最好。(2)表达并纯化STK1蛋白,注入兔子中,制备STK1抗体。Western blot检测STK1抗体可用于免疫共沉淀。Tris-Cl提取玉米花粉全蛋白,利用免疫共沉淀方法从花粉全蛋白中沉淀STK1复合物,SDS-PAGE和质谱分析STK1复合物,筛选出44个可能与STK1互作的蛋白,其中15个质谱分值较高的蛋白经初步分析,发现4个是热激蛋白,2个是ATP合成酶β亚基,2个含有Inos-1-P_synth结构域的功能未知蛋白,1个STK1,1个腺苷高半胱氨酸酶,1个网脉碱氧化酶前体,2个烯醇化酶,1个含有Pept-C1和GRAN结构域的未知功能蛋白,1个含有AAA结构域的未知功能蛋白,推测这些蛋白可能与STK1互作形成复合物,影响玉米花粉生长发育、抗性及可育性。
参考文献：
[1]. ATP合酶的结构与功能及其在细胞光自养过程中的活性变化[D]. 曾小美. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004
[2]. 玉米类受体蛋白激酶STK1互作蛋白的初步筛选及其USP结构域的克隆和表达分析[D]. 常静. 沈阳农业大学. 2016
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