元永平[1]2008年在《猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定》文中研究指明猪圆环病毒(Porcine circovirus)属于圆环病毒科,圆环病毒属,它有两个血清型:PCV1和PCV2。PCV1广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系,无致病性;PCV2不仅可以感染猪引起原发性的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PWMS),还可以侵害猪的免疫系统,引发仔猪A2型先天性震颤(CT)、成年猪皮炎肾炎综合征(PDNS)和呼吸道疾病综合(PRDS),对世界养猪业危害严重,因而世界各国都非常重视对PCV2的研究。PCV2有两个主要的阅读框ORF1和ORF2。其中ORF2编码的Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,具有型特异性,因此,猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体对PCV2的鉴别诊断有重要意义。本实验的目的就在于用原核表达的纯化复性后的PCV2-Cap融合蛋白免疫小鼠,制备针对Cap蛋白的稳定的、高特异的单克隆抗体。试验结果如下:1.将已经构建好的原核表达载体在大肠杆菌中进行表达,对表达产物进行了SDS- PAGE分析,结果表明该重组蛋白大小约为45ku,与预期结果一致。利用His-bind亲和层析纯化表达的重组蛋白,经紫外线吸收法检测表明,重组蛋白的浓度约为5mg/mL。2.用纯化的重组蛋白免疫小鼠,取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选及连续3次亚克隆,获得了叁株能稳定分泌抗PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞:1C7A4,4F3F5和4G8F7。杂交瘤细胞株经冻存、复苏及连续传代后仍能稳定分泌单抗,细胞染色体数目均在98~103之间。3.本试验制备所得单克隆抗体的一系列生物学特性鉴定表明,叁株单抗1C7A4,4F3F5和4G8F7的Ig亚类鉴定分别为IgG1,IgG1和IgG2b,对应两个不同的抗原表位,均具有针对PCV2病毒天然Cap蛋白的结合表位,具有很强的特异性(其中4G8F7的特异性最强)。本研究成功制备了抗PCV2-Cap蛋白单克隆抗体,为PCV1和PCV2的鉴别诊断方法的研究提供了材料,为后续的试验研究做了充分的准备。
孙丽华[2]2007年在《猪群中猪圆环病毒带毒情况的调查及猪圆环病毒1型荧光定量PCR方法的建立》文中研究说明猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV2)是引起猪断奶后系统衰竭综合征等相关疾病的重要病原之一。ORF2基因不仅是PCV1和PCV2主要结构蛋白的编码基因,而且也是区分PCV1和PCV2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性,本研究利用PCR技术扩增出PCV1株ORF2基因,进行分子克隆,成功建立了PCV1荧光定量PCR检测方法。采用套式PCR技术对2006年高热病地区和华南地区规模化猪场发病猪群与死亡猪群进行PCV1与PCV2检测,完成了13株PCV2分离毒株的全基因组与11株PCV1分离毒株的全基因组序列测定与分析。1采用套式PCR方法对华南地区的规模化养猪场或个体养殖户送检的144份猪血清进行了猪圆环病毒1型(PCV1)与猪圆环病毒2型(PCV2)病毒检测。PCV1阳性率为14.6%,PCV2阳性率为27.8%;PCV1与PCV2均为阳性的阳性率为4.9%。采用套式PCR方法对2006年高热病地区采集98份猪的病料进行了猪圆环病毒1型(PCV1)与猪圆环病毒2型(PCV2)病毒检测。PCV2总阳性率达到79.6%,PCV1总阳性率为7%;检测结果表明此次高热病猪圆环病毒二型感染相当严重。2从发病猪组织中分离出13株PCV2,11株PCV1并全部进行了全基因组序列测定,结果表明,11株PCV1分离株的基因组全长均为1759 bp,与国、内外分离毒株的全基因组序列比较发现发生的变异很小。13株PCV2分离株的基因组全长均为1767 bp,与国、内外分离毒株的全基因组序列比较发现,5株华南地区PCV2分离株变异很小,8株高热病地区PCV2分离株发生了很大的变异。3根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1 ORF2基因进行PCR扩增,构建重组质粒pMD-ORF2作为标准阳性模板。同时根据测完序的PCV1 ORF2基因序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针。通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法,对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nPCR)具有相近的灵敏度。
徐妮[3]2014年在《山东省猪圆环病毒病的血清学调查及PCV2分离株的遗传变异分析》文中进行了进一步梳理为了解山东省猪群中猪圆环病毒(PCV)的感染情况，本研究于2013年3月~2014年2月期间，对山东省6个未接种猪圆环病毒疫苗的规模化猪场进行血清学调查，采集不同年龄阶段猪血清用ELISA方法检测猪圆环病毒2型（PCV2）抗体，抗体阳性率均在90.0%以上；为排除母源抗体的干扰，又采用PCR的方法对哺乳仔猪及刚断奶仔猪进行抗原检测，哺乳仔猪（1~3周龄）抗原阳性率为1.67%，4、5、6、7周龄抗原阳性率分别为16.67%、33.33%、50.0%、50.0%。表明山东省PCV2感染已极为普遍，种猪抗体阳性率达100%；哺乳仔猪可从母猪获得母源抗体，且抗体水平随日龄的增加呈现先降低后升高的趋势，伴随抗体水平的降低和升高，抗原阳性率也逐渐升高。对4个已接种商品化猪圆环病毒疫苗的规模化猪场进行血清学调查，抗体阳性率分别为99.1%、96.0%、94.4%、89.4%，PCR方法检测其抗原，阳性率分别为13.6%、10.9%、20.0%、13.8%。表明现有疫苗的保护效果参差不齐，保护率均在90.0%以下，但PCV2抗原阳性率显着低于未免疫猪群。将获得的7株猪圆环病毒Ⅱ型山东株全基因组进行克隆和鉴定,测序后登录于GenBank中，登录号分别为KJ511870、KJ511871、KJ511872、 KJ511873、 KJ511874、KJ511875、 KJ511876，与已发表的16株国内外PCV2毒株进行序列比较。结果表明：山东省内7株流行毒株同源性非常高，为96.3%~99.8%；与国内参考毒株的同源性为94.4%~99.8%；与国外参考毒株的同源性为94.0%~98.6%。绘制系统发育进化树可以看出，所获得的7株全基因组序列中有6株属于PCV2d亚型，且均与山东参考株AY556473同属于一个大分支；仅KJ511874一株属于PCV2b基因亚型，与河南株、法国株遗传距离较近。由此说明山东省内流行毒株遗传关系较近，且PCV2d亚型处于主导地位，PCV2b亚型次之。
翟淑燕[4]2013年在《猪圆环病毒2型单克隆抗体研制与夹心ELISA抗原检测方法的建立》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型(PCV2)是引起世界养猪国家经济损失的重要病原之一。PCV2感染与临床多种综合征疾病有关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)或猪圆环病毒病(PCVD)。 PCV2是一个无囊膜单股环状DNA病毒,PCV2基因组上有4个开放性阅读框ORF1～4,其中ORF1～3编码病毒非结构蛋白,ORF2编码病毒结构蛋白,即Cap蛋白。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,在抗病毒感染免疫中发挥着重要作用。本研究以纯化的PCV2病毒粒子为免疫原,成功筛选出针对PCV2Cap蛋白单克隆抗体,并利用其中的一株单抗和制备的兔多抗血清建立了检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法,为PCV2诊断和病毒蛋白功能研究提供了重要工具。本研究的具体内容如下：1.PCV2单克隆抗体的制备与鉴定本研究利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫Balb/c小鼠,通过单克隆抗体技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、3E6和5A6。体外培养连续传代至第20代,分泌抗体的效价基本一致。3E5、3E6和5A6培养的上清效价分别为1：12800、1：1600和1：6400,腹水效价为1：6400000、1：640000和1：800000；3株单抗亚类与型鉴定,重链均为IgG2a亚类,轻链为κ型；间接免疫荧光试验结果显示,3株单抗均可与PCV2产生特异性荧光反应；病毒中和试验显示,3E5和3E6均具有良好的中和活性,而5A6不具有中和活性；Western blot结果表明,3株单抗均可与PCV2Cap蛋白(约30kDa)发生特异性反应,其识别的表位需要Cap蛋白N端42～50aa区域某些氨基酸的参与。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。2.PCV2夹心ELISA抗原检测方法的建立与初步应用本研究利用PCV2单克隆抗体3E5作为捕获抗体,兔抗PCV2血清为第一抗体,成功建立了PCV2夹心ELISA抗原检测方法,其优化的反应条件为：单抗包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h；用含5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液封闭,37℃作用1h；待检抗原稀释度应在1：2以上,37℃作用2h；兔抗PCV2血清1：8000稀释,37℃作用1h；羊抗兔IgG-HRP稀释度1：10000,37℃作用0.5h; TMB显色时间为37℃作用10min。判定标准为：样品的OD450nm值≥0.209时为阳性,样品OD450nm值<0.191时为阴性,介于0.191～4).209之间为可疑。该ELISA方法与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪巨细胞病毒(PCMV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)及副猪嗜血杆菌(Hps)等均无交叉反应性。检测PCV2细胞毒,其最低检测下限为10259TCID50/mL;批内和批间试验显示其变异系数均小于10%,说明该ELISA方法具有较高特异性、敏感性和重复性。采用倍比稀释PCV2标准样品绘制病毒抗原定量检测的标准曲线,检测范围为390.6～25000TCID50/mL,相关系数r为0.99。应用该方法定量检测6份细胞毒样品中PCV2含量,结果与间接免疫荧光法测得的病毒TCID50相似；该方法与经β-丙内酯灭活的PCV2细胞毒、真核表达的PCV2Cap蛋白均可有效反应,但不能与甲醛灭活的PCV2抗原反应。用该方法检测临床发病猪淋巴结组织样品中PCV2含量,发现仔猪表现PMWS的临床症状与其组织中PCV2的病毒含量有明显的正相关性。以上结果表明该方法在应用于PCV2含量检测和PCVAD诊断方面,具有重要应用前景。综上所述,本文筛选到单克隆抗体与PCV2反应性良好,可以应用于Western blot、IFA和病毒中和试验中作为PCV2抗原的诊断试剂。建立的检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法,具有较好的特异性、敏感性、重复性。这些抗体的制备和ELISA方法的建立为今后PCVAD的诊断和流行病学调查提供了有用方法。
吕建伟[5]2007年在《猪圆环病毒Ⅱ型新疫苗可预防猪圆环病毒Ⅱ型相关疾病》文中认为美国堪萨斯州州立大学科学家完成了一项研究,结果表明新研制的猪圆环病毒Ⅱ型疫苗能有效预防猪圆环病毒Ⅱ型。病毒学家、诊断医学和病理学
边少国[6]2007年在《猪圆环病毒Ⅱ型特异性单克隆抗体的研究》文中研究表明猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是近年来新发现畜禽类病毒之一，疑为一种潜在人兽共患病病原。根据猪圆环病毒的致病性及基因组特征，可分为无致病性Ⅰ型(PCV1)和有致病性Ⅱ型(PCV2)。其中PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体。它与许多猪相关疾病的发生有关，如猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病，并且这些相关联猪的疾病，已在全世界范围内发生和流行，死亡率10％～30％不等。较严重的地区，猪场在暴发断奶仔猪多系统衰竭综合征时，死淘率高达40％左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的重要的猪传染病，目前还没有有效的预防和治疗措施。因此，如何防制该病和尽早检测该病已成为养猪生产面临的新问题。传统的检测方法(电镜法、免疫荧光技术、原位杂交法、免疫组化法、聚合酶链式反应等)多适用于实验室检测，无法应用于实践或进行大面积的血清学调查。因此，建立一种快速、敏感、特异的检测方法对猪场进行清群，建立健康猪群，有着重要的意义。猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，二十面体对称，核酸为共价闭合、环状、单股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有两个主要的开放阅读框，即ORF1和ORF2。其中ORF1编码病毒的复制相关蛋白(Rep蛋白)，是PCV1、PCV2产生抗原交叉性的主要蛋白质。ORF2编码病毒的主要结构蛋白(Cap蛋白)，是PCV1、PCV2的主要保护性抗原，在PCV1与PCV2间不发生交叉反应，只有PCV2 ORF2蛋白可以被PCV2多抗识别。本研究利用PCV2吉林株(JL01)作为免疫原，PCV2 ORF2原核表达蛋白作为间接ELISA包被抗原，进行PCV2特异性单克隆抗体的筛选和制备，为建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法奠定基础。首先采用PK-15细胞对PCV2吉林株(JL01)培养，收获的细胞培养物反复冻融3次，经PCR鉴定和蔗1密度梯度离心提纯后，作为免疫原；根据GenBank中发表的PCV2ORF2基因序列，设计合成一对特异性引物，采用PCR方法从收获的病毒液中，扩增出大小为579bp的核苷酸片段，并克隆到表达载体pET-32a中，经限制性内切酶酶切和PCR鉴定，得到阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中，经IPTG诱导，成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白，经SDS-PAGE分析，表达特异带约为40KD。Western-Blot印迹表明，表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别。由此说明，重组表达蛋白具有良好的反应原性，可以作为间接ELISA包被抗原，进行PCV2ORF2抗体的筛选。与此同时，将免疫原与等量佐剂混合后，采取常规免疫与体外脾脏加强免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠。将纯化、变性、复性等处理后的重组蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA诊断方法。按常规方法取免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合和克隆，经间接ELISA筛选，成功获得2株抗PCV2 ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为C4D2和E3D4，其细胞培养上清效价分别为1∶1 024、1∶512，小鼠腹水效价分别为1∶204 800、1∶102 400。单克隆抗体特异性结果显示，C4D2和E3D4仅与融合表达的PCV2 ORF2蛋白和PCV2吉林株反应，而与PCV1、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不反应，说明此2株单克隆抗体特异性好。2株单克隆抗体的获得，为建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了有力的手段。
陈艳[7]2004年在《猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）主要ORFs的克隆与表达》文中研究说明猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)主要ORFs的克隆与表达 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员，分为Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)两个型，其基因组为共价闭合环状的单链DNA，大小约1.7kb。其中PCV2被疑为断奶猪多系统衰竭综合征(Postweaning pigs multisystemic wasting snydrome，PMWS)的病原。 目前国内外对PCV2的研究主要集中在其复制及与其他病原相关致病性上，在对病毒蛋白研究方面，除了对ORF1(复制相关蛋白Rep)和ORF2(衣壳蛋白Cap)的编码蛋白和功能研究较多之外对其它潜在ORFs编码蛋白研究较少。 为了建立快速、准确的PCV2的诊断方法，研制具有良好免疫原性的亚单位疫苗，首先设计并合成两对引物，通过PCR扩增出PCV2完整的ORF1(Rep)、ORF2(Cap)基因。利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切获得Cap基因C端约400bp(ΔCap)片段。将这叁种外源片段利用带有6×His残基的原核表达系统pPROHTb载体和带有谷胱苷肽-S-转移酶(GST)的pGEX-6p-1载体构建了重组质粒pPRO-Rep、pPRO-Cap，pGEX-PCV_(421-37)(pGEX-ΔCap)在大肠杆菌中融合表达重组蛋白His-Rep、His-Cap、GST-ΔCap。将3种重组蛋白梯度浓度包被酶标板，与不同浓度的PCV2阳性血清和SPF猪阴性血清进行ELISA实验。叁种重组蛋白与PCV2阳性血清均可发生反应，但反应强度不同，其中GST-ΔCap的反应原性最强，可用于PCV2的血清学诊断。pPRO-Cap、GST-ΔCap表达PCV2 ORF2的重组蛋白可作为PCV2亚单位疫苗的候选抗原。 国内外除对PCV2的Rep和Cap研究较多外，对其余的小的阅读框研究较少，为了了解PCV2病毒在复制过程中是否表达这些小的阅读框，进而研究其有何功能，设计并合成四对引物，通过PCR扩增出PCV2完整的ORF3、ORF4、ORF5和ORF6基因，构建了重组质粒pGEX-ORF3、pGEX-ORF4、pGEX-ORF5、pGEX-ORF6，在大肠杆菌中融合表达为重组蛋白GST-ORF3、GST-ORF4、GST-ORF5、GST-ORF6。 纯化这四种重组蛋白经免疫2kg体重的的健康新西兰兔制备兔高免血清，与PCV2超离病毒做免疫印迹试验，由抗GST-ORF3抗体可检测到与PCV2有特异性陈艳猪圆环病毒11型(PCV2)主要ORFs的克隆与表达2004年5月反应条带，证明在病毒复制过程中病毒可能表达ORF3编码的蛋白。此基因片段既不在Rep基因也不在CaP基因内，而是位于Rep基因互补链上的一段基因序列，其功能还需进一步研究。
陈锦锐[8]2007年在《分子佐剂CpG、细胞因子对猪圆环病毒DNA疫苗的佐剂效应研究》文中研究说明本研究用一段人工合成的CpG序列与猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因(ORF2)共同构建一种含CpG寡核苷酸的新型猪圆环病毒Ⅱ型基因疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-CpG)。将5种猪细胞因子IL-2，IL-4，IL-6，IL-6/4，IFN-γ及含CpG寡核苷酸的真核表达质粒作为分子免疫佐剂，与本实验室保存的pcDNA-PCV-ORF2基因疫苗共同免疫仔猪，采用间接ELISA试验和流式细胞仪(FACS)分别对仔猪特异性抗PCV2抗体IgG和外周血T淋巴细胞亚类CD~3+、CD~4+、CD~8+的动态变化进行检测。以本试验室申请的大规模提取质粒的专利方法进行基因疫苗和分子佐剂的制备，并以壳聚糖进行包裹。将基因疫苗pcDNA-PCV-ORF2和6种分子佐剂pcDNA-PCV-ORF2-CpG，IL-2，IL-4，IL-6，IL-6/4，IFN-γ，按照1:1的比例以250μg和500μg两种剂量肌注免疫仔猪，检测仔猪的外周血中CD~3+、CD~4+、CD~8+T淋巴细胞数和仔猪血清中特异性PCV2血清抗体IgG动态变化。结果表明，pcDNA-PCV2-ORF2基因疫苗免疫仔猪后，特异性抗体和T淋巴细胞数显着升高，与对照组差异显着(P＜0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG组免疫仔猪后，外周血T淋巴细胞有明显的反应性，CD~3+T淋巴细胞数实验组高于对照组，差异极显着(P＜0.01)或显着(P＜0.05)。但是各佐剂试验组之间差异不显着(P＞0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG基因疫苗免疫仔猪后诱导仔猪产生了PCV2特异性抗体，与空载体及空白对照组相比，差异极显着(P＜0.01)；各佐剂试验组之间差异不显着(P＞0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG抗体水平高于pcDNA-PCV2-ORF2组，且持续时间长，大剂量组优于小剂量组。猪细胞因子佐剂组免疫仔猪后，细胞和体液水平都高于未加佐剂组和对照组，差异极显着(P＜0.01)或显着(P＜0.05)。细胞免疫方面IL-2，IFN-γ佐剂组的抗体水平要明显高于其他佐剂组，差异显著(P＜0.05)，IL-2和IFN-γ佐剂组的CD~3+T淋巴细胞数在免疫仔猪后第35d达到最高。而IL-4，IL-6，IL-6/4佐剂组在体液免疫方面表现出明显的佐剂效应，与空载体组和对照组差异显着(P＜0.05)。其中IL-6佐剂组的抗体水平升高快，持续的时间长(90d)。pcDNA-PCV2-ORF2基因疫苗和猪细胞因子共同免疫仔猪后诱导仔猪产生了良好的体液和细胞免疫应答。结果表明PCV2 DNA疫苗与以上佐剂的配合均能够诱导仔猪产生良好的体液和细胞免疫应答，以CpG和IL-6的免疫增强作用最佳，IL-6/4，IL-2，IL-4和IFN-γ次之，并且呈剂量相关性。本研究应用猪圆环病毒DNA疫苗和CpG及5种细胞因子为佐剂，以壳聚糖纳米载体包裹后，按不同剂量肌肉免疫仔猪，探讨了其体液和细胞免疫应答，旨在为PCV2基因疫苗的临床应用提供科学依据。应用CpG和5种细胞因子对PCV2的佐剂效应研究在国内外尚属首次报道。
李玲[9]2012年在《猪圆环病毒2型的分子流行病学分析及病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是无囊膜单股环状负链DNA病毒，基因组大小约为1.76kb，根据PCV的基因组成以及其抗原性不同可将其分为两种基因型，即猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type1,PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)。PCV1最初是从污染的猪肾传代细胞(porcine kidney-15cells,PK-15)上分离得到的一种广泛存在且无致病性的动物病毒。PCV2是由Ellis等首次从断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning MultisystemicWasting Sydrome,PMWS)病猪体内分离到，已证明是PMWS的主要病原，自1991年加拿大首次爆发PMWS以来，其他国家和地区也相继报道PMWS的传播与发生。PCV2可能还是其他疾病，如猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、增生性坏死性肺炎、先天性振颤等的相关病原。1、为了解PCV2分子流行病学变化趋势，本实验室于2008-2011年间从福建、江西、广东、安徽、浙江、河南、河北、广西壮族自治区、内蒙古自治区、上海、江苏和山西共12个省(市、区)的健康猪群和发病猪群共采集452份样品，对其进行PCV2检测，结果显示，452份样品中，有354份样品检测为PCV2阳性，感染率高达78.3%。通过扩增、克隆和测序共获得31株PCV2ORF2基因编码序列，比对分析结果表明，31株PCV2均为PCV2b基因亚型，其中有21株归类于PCV1A/1B基因亚群，而9株为PCV1C亚群。对31株PCV2ORF2编码氨基酸序列比对分析表明PCV2基因亚型及亚群具有其特异的氨基酸变异位点，这对于临床上区别PCV2亚型及亚群具有一定的指导意义。从基因水平上来说，自2008年以来我国以PCV1A/1B亚群为主要流行株，但值得我们关注的是，PCV1C亚群毒株从无到有并有逐渐增多的趋势，并将来可能在PCV2的流行毒株中占据主要地位。2、本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统，将编码PCV1A/1B的ORF2基因经昆虫细胞密码子偏爱性优化后人工合成，然后将其插入供体质粒pFastBac~(TM)ⅠPPH启动子控制下的多克隆位点，将构建质粒转化至DH10BAC感受态细胞，经抗性和蓝白斑筛选，获得了重组穿梭杆粒rBacmid-cap和rBacmid-opt-cap，转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，通过间接免疫荧光证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达。通过荧光定量PCR方法测定上清中病毒拷贝数来选择获得最高滴度的扩增条件。通过蛋白印迹法测定不同表达时间和感染复数(Mutiplicity of infection, M.O.I)值条件下细胞中目的蛋白表达量，确定目的蛋白的最佳表达条件。结果表明，目的蛋白在昆虫细胞中实现了表达，并可以装配成病毒样颗粒(Virus-likeparticles, VLPs)，直径约为17纳米。与野生型基因相比，经过密码子优化的PCV1A/1B ORF2基因在昆虫细胞中的表达水平得到提高。以M.O.I值为0.05感染昆虫细胞后在96h条件下可以收获最高滴度的重组杆状病毒，以M.O.I值为5.0表达48h可以获得最佳的目的蛋白表达量。病毒样颗粒的表达与表达条件的优化，能够为PCV2基因工程疫苗的开发打下扎实的基础。
杨晓农[10]2007年在《猪圆环病毒Ⅱ型ORF1、ORF3及ORF5基因部分功能的研究》文中提出猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，目前尚无有效的疫苗防制该病。PCV2的全基因组为1767～1768bp，可能含11个阅读框架，其中的许多读框架的功能仍不十分清楚。本研究从病料中直接扩增PCV2全基因组并进行克隆，采用酶切缺失方法分别构建ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突变毒株，通过PCR检测、PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)以及透射电镜观察，鉴定其对IBRS-2细胞的感染性，并进行动物接种试验，研究其对仔猪的致病性及免疫原性。目的是为研究上述基因的功能，探讨其对病毒复制能力及致病力的影响，同时为构建新型基因工程疫苗候选毒株提供新的方法和理论依据。设计了一对特异性引物(AF-P1／AF-P2)，并引入便于后期操作的SacⅡ酶切位点。从成都地区某猪场送检的，经多重PCR方法检测为PCV2阳性的病料中一次性扩增获得了1767bp的PCV2全基因组(命名为：PCV2-CD)。将其克隆到pMD18-T Simple载体上，构建了重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD，并进行了酶切鉴定和测序鉴定。核苷酸序列分析表明：PCV2-CD株与Genbank中公布的其它12个PCV2毒株间的同源性高达95.0％～100％。采用EcoRⅤ、BragBⅠ双酶切重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD，缺失碱基187bp，获取4272bp目的线性DNA片段，回收平端连接环化构建了ORF1基因缺失重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-A；分别采用NcoⅠ和BstBⅠ单酶切pMD18-TSimple-PCV2-CD获取4459bp线性目的DNA片段，补平、连接环化分别构建了ORF3、ORF5基因插入缺失重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-C和pMD18-TSimple-PCV2-CD-E。新构建的3个基因缺失重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定均证实构建正确。用SacⅡ酶切重组质粒pMD18-T Simple-PCV2-CD-A、pMD18-T Simple-PCV2-CD-C和pMD18-T Simple-PCV2-CD-E，获得基因缺失后的PCV2-CD的线性基因组。分别回收1580bp、1771bp和1769bp的目的片段，经体外连接环化构建了ORF1、ORF3、ORF5基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C、mPCV2-E。叁个基因缺失突变毒株分别用脂质体转染法转染IBRS-2细胞(PCV1和PCV2检测阴性)培养并盲传。经PCR检测、PCR-RFLP分析，在分别转染后培养并盲传4代的细胞中，特异性地检测到mPCV2-A、mPCV2-C、mPCV2-E的DNA，并能与亲本毒株PCV2-CD相区别；电镜观察发现，培养、盲传6代的IBRS-2细胞胞核或胞浆中存在PCV2各缺失突变毒株的病毒颗粒。鉴定结果表明，构建的3个PCV2基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E具有感染性，能够在IBRS-2细胞中复制增殖。发现ORF5基因、并证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因；ORF1中187bp的缺失对PCV2的复制未产生明显的影响。24头28～30日龄健康仔猪(PCV1、PCV2检测为阴性)，随机分成5组。其中，A、B、C组为试验组(5头／组)，各组每头分别肌肉注射mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E细胞培养物2ml；D组为PCV2-CD对照组(5头)，每头肌肉注射PCV2-CD细胞培养物2ml；E组为阴性对照组(4头)，每头肌肉注射生理盐水2ml。A、B、C、D四个组中各有一头猪在接种后10d(10DPI)进行屠宰，采集组织器官用于病毒在体内复制增殖的检测及组织病理学观察；分别于接种后第0d、7d、14d和21d采集试验猪前腔静脉血进行T淋巴细胞亚群以及PCV2抗体的动态检测，数据用DPS v6.55统计分析软件进行处理。结果表明：用已建立的PCR和PCR-RFLP方法，分别从各试验组接种后10天(10DPI)屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到基因缺失突变毒株DNA，发现基因缺失突变毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E能够在仔猪体内复制增殖，基因缺失突变未影响病毒在机体内的复制增殖。组织病理学观察表明，叁个试验组(mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E组)屠宰仔猪淋巴结显现次级淋巴小结数量减少和／或生发中心的扩大，肝细胞出现颗粒变性和水泡变性，肺泡壁上皮细胞肿胀并见淋巴细胞浸润，脾脏、肾脏和心脏组织未见病理变化；PCV2-CD组的病变较严重。基因缺失未改变突变毒株的组织侵蚀途径，并显示基因缺失可导致病毒致病力的降低。用流式细胞仪(FACS)对外周血中CD3~+、CD4~+及CD8~+ T淋巴细胞亚群百分含量动态检测表明，基因缺失对病毒的细胞免疫功能未产生影响，mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。用酶联免疫吸附法(ELISA)对外周血中PCV2抗体的动态检测发现，基因缺失毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E均明显地诱导了仔猪的体液免疫，具有良好的免疫原性，基因缺失对病毒的体液免疫功能未产生影响。基因缺失毒株mPCV2-A、mPCV2-C和mPCV2-E可作为PCV2基因缺失疫苗的候选毒株。
参考文献：
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[3]. 山东省猪圆环病毒病的血清学调查及PCV2分离株的遗传变异分析[D]. 徐妮. 山东农业大学. 2014
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[5]. 猪圆环病毒Ⅱ型新疫苗可预防猪圆环病毒Ⅱ型相关疾病[J]. 吕建伟. 国外畜牧学(猪与禽). 2007
[6]. 猪圆环病毒Ⅱ型特异性单克隆抗体的研究[D]. 边少国. 吉林农业大学. 2007
[7]. 猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）主要ORFs的克隆与表达[D]. 陈艳. 新疆农业大学. 2004
[8]. 分子佐剂CpG、细胞因子对猪圆环病毒DNA疫苗的佐剂效应研究[D]. 陈锦锐. 四川农业大学. 2007
[9]. 猪圆环病毒2型的分子流行病学分析及病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达[D]. 李玲. 中国农业科学院. 2012
[10]. 猪圆环病毒Ⅱ型ORF1、ORF3及ORF5基因部分功能的研究[D]. 杨晓农. 四川农业大学. 2007
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