解方为[1]2002年在《ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞功能的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的肝星状细胞信号调控一直是近年来肝纤维化发病机制研究中的热点。ERK信号传导通路由于参与调控细胞增殖与分化，是多种信号交汇点或共同通路而受到关注。既往研究已经证实：乙醛作为一种刺激信号可以激活HSC增殖、分泌ECM，是酒精性肝纤维化发生的关键分子。ERK信号传导通路是否参与调控乙醛刺激的}tSC活化与功能改变及其意义报导甚少。本实验旨在探讨研究乙醛激活HSC后ERK的变化，以及HSC激活转变为mHSC，继而增殖、产生ECM、自分泌TGF β_1等表型改变与ERK活性变化的相关性，揭示ERK信号传导通路在调控乙醛刺激的肝星状细胞功能改变中的地位与作用，为了解酒精性肝纤维化的发生和治疗肝纤维化开辟新的途径。 方法用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度离心法分离培养大鼠肝星状细胞；采用免疫组化法检测乙醛刺激肝星状细胞后ERK表达的变化，以及不同剂量(20，50，100 μ mol／L)PDD98059对乙醛刺激肝星状细胞中ERK表达的影响；采用细胞记数、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同剂量(20，50，100 μ mol／L)PD98059阻断ERK活性后对乙醛刺激的肝星状细胞增殖的影响；采用ELISA、原位杂交法检测不同剂量(20，50，100 μ mol／L)PD98059阻断ERK活性后对乙醛刺激的肝星状细胞I型胶原合成的影响；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及凝胶电泳分析检测不同剂量(20，50，100 μ mo1／L)PD98059阻断ERK活性后对乙醛刺激肝星状细胞TGF B。mRNA和Na~+／Ca~2+泵mRNA表达的影响。 结果 (1)成功分离出大鼠肝星状细胞，细胞得率及纯度较传统方法增高。<WP=9> (2)乙醛刺激卜ISC 5分钟后即出现胞浆表达的ERK向胞核移行，ERK胞浆表达逐步向胞核表达过渡，20分钟后达到高峰。这一过程并可被PD98059呈剂量依赖性阻断：20 μmol／l的PD98059部分抑制ERK核转移，50μmo／1时明显抑制，lOOμ1m01／l完全抑制。 (3)乙醛刺激HSC后明显促进细胞增殖、I型胶原蛋白分泌以及α1(I)型胶原mRNA、TGF B．mRNA与Na~+，／Ca~2+泵mRNA表达，刺激后MTT、细胞计数、ELISA、原位杂交、RT—PCR及凝胶电泳分析指标均明显增高，统计学分析差异有非常显着意义(P(0．01)。 (4)PD98059抑制乙醛刺激肝星状细胞的增殖、I型胶原蛋白分泌、α1(I)型胶原mRNA及TGF β_1 mRNA表达。20 μ mol／L PD98059对HSC增殖、1型胶原及TGF βmRNA表达抑制作用不明显(P>0．05)， 50、100 u mol/L抑制作用明显(P<O．05或P<0．01)， 呈剂量一效应关系：对肝星状细胞Na~+／Ca~2+泵mRNA表达无明显影响。 结论 (1)乙醛刺激肝星状细胞后，ERK被显着活化。 (2)乙醛可以激活静息态的肝星状细胞表达Na~+／Ca~2+泵，并促进细胞增殖、I型胶原及TGFβ_1mRNA表达。 (3)ERK信号传导通路参与调控乙醛刺激肝星状细胞的增殖、I型胶原合成及TGF β_1mRNA表达的过程，但对肝星状细胞激活过程无明显影响。
马洪德[2]2003年在《ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞增殖的研究》文中研究表明背景和目的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化发生过程中细胞外基质（extracellular matrix ,ECM）形成的主要细胞，HSC的活化增殖受细胞内信号传导通路的调控，是近年来肝纤维化防治研究中的热点。ERK信号传导通路由于参与调控细胞增殖与分化，是多种信号交汇点或共同通路，从而备受关注。业已证实：乙醛作为一种刺激信号可以激活HSC增殖、分泌ECM，是酒精性肝病发生的关键分子。我们的前期研究表明：ERK信号传导通路参与了调控乙醛刺激的HSC活化增殖。但调控的分子机制尚未明了。本实验旨在通过特异性MEK阻断剂PD98059作用于乙醛刺激的HSC后，观察HSC内ERK活性、细胞增殖、细胞周期时相和细胞周期蛋白(Cyclins)表达的变化；初步探讨ERK信号传导通路调控HSC细胞增殖的分子机制；以期为肝纤维化的发生和防治提供理论和实验依据。方法 体外培养大鼠HSC；采用Western blot检测乙醛刺激后HSC内ERK活性的变化和观察不同剂量PD98059(20、50、100μmol/L)对乙醛刺激后HSC内ERK活性的影响；采用MTT比色法和免疫组化法分别检测不同剂量PD98059(20、50、100μmol/L)作用于乙醛刺激的HSC后细胞增殖及增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA）表达的变化；流式细胞仪分析PD98059(20、50、100μmol/L)对乙醛刺激后HSC的细胞周期时相变化；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及凝胶电泳分析不同剂量PD98059(20、50、100μmol/L) 作用于乙醛刺激的HSC后CyclinD1mRNA表达的变化。结果(1) HSC被乙醛刺激后,磷酸化ERK(p-ERK)水平增高、PCNA合成及细胞周期蛋白CyclinD1mRNA表达增加、细胞由G1→S期转化增多、促进细胞增殖。与空白对照组比较，统计学分析有显着差异（P<0.05）。(2) 20、50、100μmol/L PD98059 均能抑制乙醛刺激的HSC内p-ERK水<WP=7>平,与对照组比较有显着差异(P<0.05)；20μmol/L PD98059对乙醛刺激的HSC增殖及PCNA合成、CyclinD1mRNA表达的抑制作用与对照组比较无统计学差异(P>0.05)；50、100μmol/L的PD98059可明显抑制乙醛刺激的HSC内PCNA合成及CyclinD1mRNA表达，并明显抑制细胞由G1→S期的转化和细胞增殖，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。结论(1) 乙醛刺激HSC后，引起ERK信号传导通路活化。 (2) 乙醛促进HSC增殖与ERK活化关系密切，并呈剂量依赖性。 (3) 乙醛刺激HSC后,促进HSC由G1期向S期转化，同时PCNA合成及CyclinD1mRNA表达增加。(4) ERK信号传导通路调控乙醛刺激的HSC增殖可能与其调控HSC内PCNA合成、CyclinD1mRNA表达和细胞周期变化有关。
张迪[3]2017年在《PI3K/Akt信号传导通路在乙醛刺激下大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖中的作用》文中研究指明目的:用乙醛刺激大鼠HSC-T6,来探讨PI3K/Akt信号通路与大鼠HSC-T6的增殖之间可能存在的关系。方法:(1)将大鼠HSC-T6随机分为6组:空白对照组(A组):采用10%FBS DMEM培养基;乙醛组(B组):添加乙醛,使终浓度为200μmol/L;实验组(C、D、E、F)先加入不同浓度(25、50、75、100μmol/L)PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002预处理1h后,添加乙醛,使终浓度为200μmol/L,干预时间为24h(乙醛每12h添加一次)。最终用CCK-8法检测各组细胞增殖能力。(2)将大鼠HSC-T6随机分为3组:空白对照组(采用10%FBS DMEM培养基)、乙醛组(添加乙醛,使终浓度为200μmol/L)、乙醛+LY294002组(用50μmol/L的LY294002预处理1h后加入乙醛,使终浓度为200μmol/L)。最终用Western-blotting法检测各组PI3K、p-Akt的表达水平。结果:(1)倒置显微镜下观察细胞的形态:空白对照组(A组)细胞较均匀,不易成团生长;乙醛组(B组)在加入乙醛后,细胞的密度增大,易成簇抱团,胞突增多且伸展延长;实验组(C、D、E、F组)中细胞密度降低,细胞间隙增大,可见变圆透亮的死细胞。(2)用CCK-8法检测各组HSC-T6的增殖能力(用OD值代表):乙醛组(B组)所检测的OD值最大(P<0.01,Vs空白对照组A组,实验C、D、E、F组);实验组(C、D、E、F)检测的OD值随着LY294002浓度的增大逐渐减小,且差异有统计学意义(P均<0.01)。(3)用Western-blotting法检测PI3K、p-Akt蛋白的表达情况:乙醛组、乙醛+LY294002组PI3K、p-Akt蛋白表达量增高(P均<0.01,Vs对照组);与乙醛组比较,乙醛+LY294002组中PI3K、p-Akt蛋白表达量降低(P<0.01,P<0.05)。结论:(1)乙醛可以刺激大鼠HSC-T6的增殖,PI3K/Akt通路的特异性抑制剂LY294002可以抑制乙醛对大鼠HSC-T6的增殖作用。(2)乙醇及其代谢产物乙醛所造成的肝损伤及肝纤维化与PI3K/Akt通路之间可能存在一定的关系。
解方为, 蒋明德, 曾维政, 甘新宇, 马洪德[4]2003年在《Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的影响。方法 用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性 ,以ELISA法定量测定细胞上清Ⅰ型胶原。结果 PD980 5 9在 2 0 μmol/L时可影响HSCⅠ型胶原分泌 ,但无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,5 0、10 0 μmol/L抑制作用明显 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,呈剂量 效应关系。 结论 PD980 5 9对乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌具有抑制作用 ,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌重要通道。
蒋明德, 解方为, 马洪德, 甘新宇, 曾维政[5]2002年在《Erk信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨乙醛激活HSC过程中Erk的变化,以及阻断Erk信号传导通路对HSC增殖的影响。方法:用乙醛刺激,不同剂量PD98059预处理后的HSC,采用免疫组织化学方法检测细胞中Erk的变化,并以细胞计数和MTT比色法观察PD98059Erk对HSC增殖的影响。结果:乙醛刺激HSC后Erk胞浆表达向胞核移行,PD98059阻断Erk核内移行,随剂量递增愈发明显,PD98059在20μmol/L时对HSC增殖有抑制作用,P<0.05;50μmol/L、100μmol/L时抑制作用明显,P<0.01。结论:Erk信号传导通路参与乙醛激活HSC的过程,PD98059对乙醛刺激的HSC增殖具有抑制作用,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSC增殖重要通道。
钟显飞[6]2004年在《c-Jun氨基末端激酶信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞增殖、凋亡的研究》文中指出背景和目的 肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化发生过程中细胞外基质(extracellular matrix, ECM)形成的主要细胞，HSC的活化、增殖及凋亡受细胞内信号传导通路的调控，近年来，肝纤维化的发病机制与HSC信号传导一直是研究的热点。对酒精性肝病的研究已证明：乙醇的代谢产物—乙醛作为有效刺激信号是激活HSC导致肝纤维化发生的关键分子。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路参与调控细胞的增殖、分化与凋亡，是丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的重要成员之一。目前就JNK信号传导通路的激活与肝纤维化发生机制的研究报道较少，有研究显示JNK信号通路的活化与肝细胞的增殖、HSC内Ⅰ胶原及其相关基因的表达密切相关。我们前期研究证实MAPK家族中的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路是调控乙醛刺激HSC增殖的重要通道，但国内外尚未有关JNK与HSC的增殖及凋亡的研究报道。本实验旨在通过JNK特异性阻断剂SP600125作用于乙醛刺激的HSC后，观察HSC内JNK活性变化与细胞增殖、细胞凋亡的关系；初步探讨JNK信号传导通路调控HSC细胞增殖及凋亡的分子机制；以期为肝纤维化的发生和防治提供理论和实验依据。 方法 体外培养大鼠HSC株；采用Western blot、免疫组化法检测乙醛刺激后HSC内JNK活性的变化，和用不同剂量SP600125(20、60、100 ng／ml)对乙醛刺激HSC内JNK活性的影响；采用MTT比色法、流式细胞仪分别检测上述剂量的SP600125作用于乙醛刺激的HSC后细胞增殖及其细胞周期变化；DNA片段凝胶电泳及流式细胞仪分析SP600125对乙醛刺激后HSC的细胞凋亡的影响。 结果 (1)HSC被乙醛刺激后，磷酸化JNK(phosphorylated-JNK,p-JNK)水平增第叁军医人学硕士研究生论文高，细胞由Gl~S期转化增多、促进细胞增殖。与空白对照组比较，统计学分析有显着差异(尸<0.05)。 (2)浓度为20、60、100 ng/ml的Sp600125均能抑制乙醛刺激的HSe内p一JNK水平，与对照组比较有显着差异(p<0.05):同时明显阻滞细胞由Gl一S期转化，进而抑制细胞增殖。 (3)DNA凝胶电泳图谱上可见中、高浓度组(60、1 00 ng/ml)呈典型的凋亡梯形带(DNA Ladder)，而空白对照组、乙醛组和低浓度组(Zong/ml)未见梯形条带;在流式细胞仪结果中:空白对照组及乙醛组中细胞凋亡率为2.肚0.2%和6.0士0.5%(两者有显着性差异P<0.05)，经sP600125处理后细胞凋亡率上升(分别为11.1土0.4%;26.9土0.9%;”.1士1.3%)，同乙醛组相比有显着性差异(P<0.05)，故sP600125具有促进HSe凋t的作用。结论 (1)乙醛刺激HSC后，引起JNK信号传导通路活化。 (2)乙醛促进HSC增殖与JNK活化呈正相关，并呈剂量依赖性。 (3)乙醛刺激HSC后，HSC凋t增加，用sP6ool25抑制JNK信号传导通路后凋亡率明显升高。提示SP600125通过阻断JNK通路，促进HSC凋亡，故JNK信号通路可能参与了HSC的凋亡的调控。
钟显飞, 蒋明德, 马洪德, 曾维政, 李小安[7]2005年在《JNK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响》文中研究说明目的: 初步探讨JNK信号通路调控乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的分子机制.方法: 体外培养大鼠HSC株,用c Jun氨基末端激酶(c- JunN terminalkinase,JNK)特异性阻断剂SP600125对乙醛刺激的大鼠HSC株进行处理,以MTT比色法检测细胞增殖,Western blotting检测磷酸化JNK(p JNK)水平的变化.结果: 乙醛刺激后HSC内p -JNK的水平升高,增殖明显;SP600125对乙醛刺激的HSC对p -JNK的水平有明显下调作用,同乙醛组相比有显着性差异. {MVI比值[ (36. 0±3 .4 ), ( 24. 2±1 .8 ), ( 3. 2±0 .9 ) ]vs( 47. 6±8. 6),P<0. 05},强度呈剂量依赖关系;同时具有抑制细胞增殖的作用: 空白对照组及乙醛组中吸光度(A)为( 0. 07±0 .01)和(0. 16±0 .02),两者有显着性差异(P<0 .01 ),经不同剂量的SP600125 ( 20, 60, 100μg/L)处理后吸光度值下降[分别为(0 .13±0. 01), (0 .12±0. 01), (0 .12±0. 01) ],同乙醛组相比有显着性差异(P< 0 .05 ),细胞抑制率分别为19 .3%, 22. 4%, 28. 6%.结论: JNK活性变化与乙醛刺激的大鼠HSC的增殖呈正相关,抑制JNK活性可影响HSC的增殖,提示JNK信号传导通路在调节HSC的增殖中起着重要的作用.
杨斌[8]2010年在《红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞Wnt信号通路的影响及其意义》文中研究说明目的肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化的中间可逆阶段。在肝纤维化的病程中,肝星状细胞(hepatic stellate cells HSCs)的活化是其核心环节,因此对肝星状细胞的活化进行干预是临床治疗肝纤维化的发展方向。由于肝星状细胞的活化涉及众多的细胞信号传导通路,因此了解肝星状细胞的活化中各种信号通路的作用机制十分重要。引起肝星状细胞活化的病因很多,乙醛是酒精性肝病中作用于HSCs的致病因子,将乙醛作为HSCs的激活剂在各种实验中广泛运用。乙醛刺激大鼠HSCs活化的主要特点是增殖速度增快和包括α1胶原(α1 (I) collagen)在内的细胞基质分泌增多。在前期的实验中,红景天甙已经被证实可以影响肝星状细胞活化过程中的TGFβ-Smad和Rho-ROCK信号通路从而抑制HSCs的激活和过量细胞基质的产生,但是对其抑制HSCs增殖的具体分子机制仍然不是很明确。近年对Wnt信号通路的研究发现:它通过对目的基因MYC、CyclinD1等的转录调控影响细胞的增殖和转化,并与肝星状细胞的活化密切相关。因此了解红景天甙对活化的肝星状细胞中Wnt信号通路和细胞活性的影响对研究红景天甙的药理作用和治疗肝纤维化的分子机理具重要意义。本研究项目通过观察红景天甙处理乙醛刺激的大鼠肝星状细胞生长速度的变化以及细胞中Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因mRNA表达和蛋白水平的改变,探讨Wnt信号通路在肝星状细胞活化中的作用。方法用红景天甙和乙醛处理体外培养的大鼠肝星状细胞,同时用正常培养细胞和单以乙醛刺激的细胞为对照[1],由MTT法绘制细胞生长曲线并对比,采用RT-PCR和Western-blot的方法分别从mRNA水平和蛋白水平观察Wnt信号通路相关指标β- catenin和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达变化,并用统计方法进行对比分析。结果从各组细胞生长曲线的对比可以清晰发现:单用乙醛刺激可使大鼠肝星状细胞增殖速度增快,红景天甙可以明显降低大鼠肝星状细胞在乙醛刺激后的生长和增殖速度。运用RT-PCR和Western-blot的方法,在单用乙醛组的大鼠肝星状细胞中,发现I型胶原[2]、Wnt信号通路中β- catenin(β-链蛋白)和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的mRNA表达和蛋白合成相对于正常细胞均增强(P<0.05),在红景天甙处理组的大鼠肝星状细胞中,细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和β- catenin(β-链蛋白)的mRNA表达和蛋白合成相较于单用乙醛组均出现不同程度的下降(P<0.05)。结论Wnt信号通路的开放参与了乙醛刺激的肝星状细胞活化,红景天甙能有效降低大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的活性从而抑制乙醛刺激的大鼠肝星状细胞的活化和增殖。
蒋明德, 马洪德, 解方为, 钟显飞, 曾维政[9]2003年在《细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响》文中进行了进一步梳理目的 观察PD980 5 9(特异性丝裂原细胞外信号反应激酶阻断剂 )调控乙醛刺激大鼠肝星状细胞 (HSC)周期 ,影响细胞增殖、Ⅰ型胶原蛋白分泌及转化生长因子 (TGF) β1mRNA表达。方法 不同浓度PD980 5 9对乙醛刺激的HSC进行处理 ;流式细胞仪检测细胞周期 ,MTT法检测细胞增殖变化 ,ELISA法检测HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌 ,RT PCR法检测HSC内TGFβ1mRNA表达。结果 PD980 5 9能剂量依赖性地影响乙醛刺激的HSC周期 ,使G0 /G1期细胞百分比增高 ,S期细胞减少 ,从而抑制乙醛刺激的HSC增殖、HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1mRNA表达。结论 细胞外信号调节激酶信号通路影响乙醛刺激的大鼠HSC增殖Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1mRNA表达
蒋明德, 解方为, 曾维政, 甘新宇, 马洪德[10]2004年在《ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Na~+/Ca~(2+)泵mRNA表达的研究》文中指出目的 :探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞 (HSC)Na+ /Ca2 + 泵mRNA表达的影响。方法 :用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用RT PCR测定PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性后Na+ /Ca2 + 泵mRNA表达。结果 :乙醛刺激后 ,HSC后明显促进Na+ /Ca2 + 泵mRNA表达 (P<0 0 1) ,不同剂量PD980 5 9对肝星状细胞Na+ /Ca2 + 泵mRNA表达的影响无统计学意义。结论 :Erk信号传导通路可能对乙醛刺激的肝星状细胞激活状态的启动无明显影响
参考文献：
[1]. ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞功能的研究[D]. 解方为. 第叁军医大学. 2002
[2]. ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞增殖的研究[D]. 马洪德. 第叁军医大学. 2003
[3]. PI3K/Akt信号传导通路在乙醛刺激下大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖中的作用[D]. 张迪. 石河子大学. 2017
[4]. Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的研究[J]. 解方为, 蒋明德, 曾维政, 甘新宇, 马洪德. 四川医学. 2003
[5]. Erk信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响[J]. 蒋明德, 解方为, 马洪德, 甘新宇, 曾维政. 西南国防医药. 2002
[6]. c-Jun氨基末端激酶信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞增殖、凋亡的研究[D]. 钟显飞. 第叁军医大学. 2004
[7]. JNK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响[J]. 钟显飞, 蒋明德, 马洪德, 曾维政, 李小安. 第四军医大学学报. 2005
[8]. 红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞Wnt信号通路的影响及其意义[D]. 杨斌. 第叁军医大学. 2010
[9]. 细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响[J]. 蒋明德, 马洪德, 解方为, 钟显飞, 曾维政. 中华消化杂志. 2003
[10]. ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Na~+/Ca~(2+)泵mRNA表达的研究[J]. 蒋明德, 解方为, 曾维政, 甘新宇, 马洪德. 西南国防医药. 2004
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