王政 (白城医学高等专科学校 人体解剖及组织胚胎学教研室 吉林省白城137000)
摘要：LCM技术最早是在美国肿瘤基因解剖计划开发的一项新技术，该技术操作简单、定位准确，能够在短时间内获取大量单细胞。说明看下技术的不断发展促使很多先进技术应用到医学工作中，推进法医学发展。随着该项技术的不断发展完善，LCM技术已经逐渐渗透到各个领域中。在法医学检验中LCM技术占有重要地位，能够给公安机关提供更加准确的线索，明确侦查方案，提供有科学依据的法医证据。本文主要研究LCM技术对早期流产组织胚胎成分的分离检验，实现母体与胎儿成分的有效分离。
关键词：LCM技术；早期流产；胚胎组织；分离
前言
生命科学技术的发展推动很多新兴技术运用到法医工作中，极大推动法医学发展。在国际国内的法医学时间也经常会遇到混合、微量检材的DNA分离问题。比如在性侵案件与亲子鉴定的案件中，就经常会遇到早期胚胎流程情况。被害人在怀孕3个月时进行流产手术，母体与胎儿成分是很难做到有效分离，微量母亲成分会导致分离失败。此种样品是性侵案或者怀孕妇女自杀案件经常遇到的，往往会得到模糊结论，不能作为有效证据，这样生物检材证据就无法发挥其价值。近年来，LCM技术结合低体积扩增技术为分离实验提供了全新方案，能够从复杂组织党中获得微量细胞，对于法医学检验有重要意义。但目前国内的平台还仅限于使用LCM技术进行精子与口腔细胞分离，对于早期流产组织中获取细胞实现有效分离的实验，还缺乏稳定的实验案例。
一．激光捕获显微切割技术中早期胚胎成分与亲权关系研究
1.实验目的
法医生物物证的提取是犯罪现场中非常重要的任务，在此检验过程中混合检材的分离以及微量物质的取证是非常关键的技术。本次研究就是为了解决检案中的困难，获取新技术与方法，扩大犯罪现场的检材检材范围，提高挖掘的案件检材证据价值性。比如在法庭实验室中检验性侵案件以及亲子鉴定案件中，经常会碰到早期流产情况，在被害人怀孕3个月时进行流产手术，就会经常遇到早期胚胎流产现象，要让混合普带分离失败的可能性非常大，微量的母体成分会让母体与胎儿成分难以分离，这种情况是性侵或者怀孕妇女自杀检材时经常会遇到的现象，得出的结论相对含糊，并不能作为直接的呈堂证供，无法发挥生物检材的价值。此研究主要是针对法医物证鉴定以及亲子关系确定设立的，对早期流产组织中母体与胚胎成分混合导致的母体与胎儿成分难以分离的问题进行研究，通过激光捕获技术来获取切片中的胚胎绒毛细胞，实现胚胎的有效分离，证明亲子关系。
2.实验方法
用福尔马林来固定新鲜流产组织，把石蜡包埋制成石蜡切片，通过激光捕获显微切割的方式来获取胚胎绒毛细胞，设置20.30.40个细胞数目组。把捕获的不同数目绒毛细胞用蛋白酶进行裂解，再用低体积扩增仪来进行体系扩增。通过3130遗传分析仪来得出胚胎个体分型图谱，并且比较每一个细胞组中的个体识别率，等位基因丢失率以及非特异扩增情况，最后再进行实际案例应用。
3.实验结果
只要捕获石蜡切片上20个以上的胚胎绒毛细胞就能够获得胚胎个体分型。细胞数目越多的胚胎得到的分型率就越高，地位基因丢失率以及非特异性扩增率就会降低。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆所以20个细胞数目组的胚胎检出率低，但基因的丢失率以及非特异性扩增率会增高。激光捕获显微切割技术结合低体积扩增技术可用于石蜡切片，实现胚胎与母体成分之间的精确分离，证明亲权关系。
二．应用LCM技术对早期流产组织冰冻切片中胚胎成分的分离检验
1.实验目的
冰冻切片以及石蜡切片都可以用激光捕获显微切割技术来进行，但是石蜡组织切片因为前期的处理会导致核酸结构受到损坏，通过捕获较少细胞是很难获取大片等位基因，冰冻组织切片就不同了，它的前期处理依然能够保存核酸完整性。在实验过程中无需担心前期处理问题，此研究主要是通过激光捕获显微切割技术结合低体积扩增技术来捕获冰冻切片上的绒毛细胞，实现胚胎与母体的精确分离，证明亲权关系，寻找新的研究实验技术。
2.实验方法
先准备好实验的早期流产组织冰冻切片，通过激光捕获显微切割技术来捕获胚胎绒毛细胞，实验过程中要设置20,30.40三个小组进行对照实验。把捕获的不同绒毛细胞用PK蛋白酶进行裂解，利用低体积扩增仪进行扩增，同3130遗传分析仪来得出胚胎个体分型图谱，并且比较各组中的检出率、等位基因丢失率以及非特异性扩增情况，最后再进行模拟案例检验。
3.实验结果
最少捕获10个胚胎绒毛细胞就可以完成完整胚胎STR-DNA分型。冰冻切片中捕获30个细胞数目组的胚胎分型检出率最高，等位基因的丢失率以及非特异性扩增率最低。由此可见，细胞数目越多检出率最高，等位基因的丢失率以及非特异性扩增率就会降低。激光捕获显微切割技术联同低体积扩增技术可以用在胚胎与母体成分DNA精确分离与检验，只要10个以上的胚胎绒毛细胞进行试验就能够得到完整的胚胎STR-DNA分型，来证明亲权关系。
三．结论
本文通过激光显微切割技术联合应用低体积扩增技术来进行早期胚胎流产成分分离实验，用国际通用的STR标记方式来对流产组织中母体、胚胎混合DNA分型问题进行探讨，建立了一套完整的胚胎分离技术，使用石蜡切片、冰冻切片来联合低体积扩增技术实现胚胎个体分型，应用到案例检材中，得出以下结论：
1.低体积扩增技术比常规体积扩增技术灵敏度高、准确性高，适合进行微量细胞扩增检验。
2.激光显微切割系统可以用于石蜡切片、冰冻切片两种胚胎绒毛细胞分离实验中，并且分型与提取方式有很多共同性。激光捕获显微切割技术结合低体积扩增技术的操作技巧性非常高，每一步的操作失误都会导致实验结果出现误差。
3.实验一定要多此进行，单次检测的结果并不具备说服力，可能会出现等位基因缺失以及非特异性扩增现象。所以实验一定要分组进行，并且保证每次细胞的数量都达到10个以上，促使实验过程与结果说服力更强。实验过程的检材类型也是千差万别，根据不同的组织进行不同处理方式，保证实验准确性。
参考文献
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作者简介：
王政（1970.07）男 汉族 硕士 副教授 从事人体解剖学和组织胚胎学研究
论文作者:王政
论文发表刊物:《医师在线》2016年2月第3期
论文发表时间:2016/6/7
标签：胚胎论文; 技术论文; 细胞论文; 切片论文; 母体论文; 绒毛论文; 成分论文; 《医师在线》2016年2月第3期论文;