【摘要】 目的：探讨Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白对骨质疏松症发病机理的影响。方法：收集20例患者(骨质疏松症组、正常组各10例)髋关节置换手术中取下股骨头或股骨颈中松质骨，分别进行成骨细胞体外培养，通过ELISA方法检测正常人和骨质疏松症患者成骨细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达情况。结果：对比于正常组，骨质疏松症组中Caspase-3、Caspase-9的表达较正常组增高，差异有统计学意义(P<0.05),而Bcl-2表达水平在骨质疏松症组中较正常组下降，差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论：在骨质疏松症的成骨细胞凋亡过程中，Caspase 依赖性凋亡途径激活，而Bcl-2途径受到抑制。
【关键词】 骨质疏松症；成骨细胞；Caspase-3；Caspase-9；Bcl-2
【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165(2015)18-010-02
骨质疏松症是以一种由于骨强度降低而使骨折风险升高的全身性骨骼疾病[1]，是中老年人的一种常见病、多发病。据统计，至2008年止，我国有骨质疏松症患者约为6944万，随着人口不断老龄化，50岁以上人群低骨量和骨质疏松症的患病率还会增加[2]。成骨细胞中的Caspase家族蛋白、线粒体色素C、线粒体膜间隙蛋白等共同参与了成骨细胞的凋亡过程。我们通过构建两种体系的成骨细胞蛋白质表达谱，比较正常人和骨质疏松症患者蛋白质表达谱的差异，挖掘出两者不同的特征蛋白标志物，藉此探讨骨质疏松症的发病机理，为骨质疏松症的病情分级提供合理的客观量化依据。
1 研究方法
1.1 标本的收集
病例来源：广州医科大学附属第一医院骨科标本收集的部位：来自髋关节置换手术中取下股骨头或股骨颈中松质骨。
1.2 骨质疏松症患者松质骨的收集
1.2.1 纳入标准
①女性在绝经 1 年以上，年龄 50-55 岁；②经骨密度检查诊断为骨质疏松症者；③能够收集到较为齐全的相关资料者；④均签订知情同意书。
1.2.2 排除标准
继发性骨质疏松症患者；6 个月内服用过影响骨代谢药物的患者；合并其他疾病的患者；不同意和配合进行研究的患者。
1.3 正常成人松质骨的收集
1.3.1 纳入标准
①女性在绝经 1 年以上，年龄 50-55 岁；②能够收集到较为齐全的相关资料者；③均签订知情同意书。
1.3.2 排除标准
6 个月内服用过影响骨代谢药物的患者；合并其他疾病的患者；不同意和配合进行研究的患者。
1.4 病例分组
选择符合上述各项标准患者分为骨质疏松症组、正常组，每组10例。研究前需同患者签定知情同意书，严格控制各组年龄及绝经时间，以达到组间均衡，使之在统计学上无差别意义。
1.5 成骨细胞的培养及增殖凋亡检测
将松质骨剪成 2mm×2碎片，Hank’s 反复冲洗至骨片变白，用胰蛋白酶消化骨片，前 3 次将消化的上清弃掉，自第 4 次收集上清进行离心，用 10%胎牛血清和DMEM 培养液将沉淀物吹打均匀，滤过后接种于 25cm2培养瓶内，每 3 天更换培养液至细胞融合备用，液氮冻存备用。采用四甲基偶氮唑盐法对成骨细胞增殖进行检测， 在波长 490nm 处于酶标仪上测定光度值。对各组细胞用流式细胞仪在488nm 波长氩离子激光下以 Elite 软件分析细胞凋亡率。
1.6 线粒体的提取及蛋白质的测定
采用细胞匀浆法对细胞进行分离线粒体：使细胞生长铺满整个培养表面，分别加入 PBS 缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去，再加入胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面，然后置入 37 ℃培养箱，经离心、涡旋震荡，移出上清液后，保留沉淀颗粒以获得线粒体沉淀物，再重复上述步骤，以获得高纯线粒体样品，最后置于-70℃冰箱保存备用。将线粒体沉淀，加入适量裂解液，室温放置巧分钟，其间不断涡旋搅动，12000rpm 离心弃去不溶物，吸取上清液，即为蛋白质样品溶液。蛋白质的测定采用ELISA法测定。
2 实验结果
2.1 骨质疏松症组与正常组基本特征情况见表1
骨质疏松症组年龄( 5 1 . 9 0 0 0 ± 1 . 7 9 2 0 ) 与正常组年龄(52.0000±1.4142)两独立样本资料T检验，P>0.05，差异无统计学意义。骨质疏松症组绝经时间(2.2300±1.1036)与对照组绝经时间(2.2500±1.0865)两样本资料T检验，P>0.05，差异无统计学意义。两组组间基线特征均衡，骨质疏松症组与正常组具有可比性。另外，通过MTT法测定细胞活性,结果显示骨质疏松症组细胞活性降低,与正常空白组差异明显(P<0.05)，有统计学意义。
表1 骨质疏松症组与正常组基本特征( )
2.3 通过蛋白检测
我们发现骨质疏松症组成骨细胞中 Caspase-3、Caspase-9 的表达水平均高于正常组，且差异有统计学意义(P<0.05)；而骨质疏松症组成骨细胞中Bcl-2低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。
表3 各组成骨细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2的变化比较( )
3 结论
目前对凋亡的认识已经由细胞核为中心的调控模式转变为以线粒体为中心的调控模式。主要有三种：内源性途径、外源性途径和内质网途径[3-4]。内源性途径又称为线粒体途径，主要是Caspase-9的活化作用[5]；线粒体依赖途径涉及胞浆中一个非常重要的蛋白分子--凋亡蛋白酶激活因子-1 (apototic protase activating factor-1, Apaf-1)，Apaf-1能与ATP/dATP结合，使其水解，所释放的水解产物和细胞色素C可共同促进Apaf-1的聚合, 而形成一个700kD、具有很强Caspase-9激活活性的复合体，活化的Caspase9，激活各种下游Caspase家族蛋白，诱导凋亡[6-7]。
线粒体膜间隙( intermembrane space, IMS) 蛋白全部在细胞质中合成, 这部分蛋白的转运机制与线粒体其他部分蛋白的转运相比有其特殊性。依据转运机制和能量来源不同可以将其分为3类：Ⅰ类蛋白含有一段双组份分选信号；Ⅱ 类蛋白需要膜间隙的辅助因子协同折叠；Ⅲ类蛋白含有与膜相互作用的疏水面。这些蛋白参与caspase活化，或以非caspase依赖的方式诱导细胞凋亡。
Caspase-3、caspase-9同属于caspase家族蛋白，aspase-9为凋亡始动子，属启动型蛋白酶，位于级联反应的上游[8]。caspase-3为凋亡效应子，属执行型蛋白酶，位于级联反应的下游，能被上游的始动子激活，激活后的caspase作用于特异性底物使得细胞发生生化及形态学改变[9]。Zehendner等[10]发现在急性脑缺血中，Caspase-3被迅速激活，紧密连接蛋白的断裂也随之启动，实验肯定了Caspase-3在此过程中的重要作用。Boivin等[11]研究后发现，肌肉蛋白的分解代谢与Caspase-3的活性呈正相关，认为终末期肾病肌肉萎缩的原因可能是IL- 6诱导激活的Caspase- 3导致细胞凋亡。Saintier等[12]通过对破骨细胞的体外实验，认为雌二醇能提高Caspase-9活性，促进细胞的凋亡。Chua等[13]进行了地塞米松对MC3T3-E1成骨细胞凋亡机制的研究，认为地塞米松激活Caspase-9的活性，进而引起了级联反映，导致了凋亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的代表。体外实验证实Bcl-2、Bcl-xL等能在线粒体上形成离子通道，提示它们可能参与调节一些与凋亡有关的细胞现象。过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性改变，并影响线粒体通透转换孔的形成，从而抑制凋亡[14-15]。通过本项目的研究发现，骨质疏松症组中caspase-3、caspase-9含量增加，说明在骨质疏松症组的成骨细胞凋亡过程中，caspase 依赖性凋亡途径激活。。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白的代表，目前认为其可抑制细胞的凋亡主要与以下几点相关：(1)Bcl-2能抑制氧化剂诱导的凋亡。(2)Bcl-2能抑制细胞内钙离子的跨膜运动。钙离子参与凋亡早期信号的转到和凋亡的执行阶段。(3)通过形成离子通道抑制细胞凋亡。在本项目的实验中，骨质疏松症组当中Bcl-2表达下降，抑制细胞凋亡作用下降，骨质疏松症组中细胞凋亡情况较正常组严重。
参考文献
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论文作者:刘嘉眉1 李颖2
论文发表刊物:《医师在线》2015年9月第17期供稿《医师在线》2015年9月第18期供稿
论文发表时间:2015/11/6
标签：细胞论文; 线粒体论文; 骨质疏松症论文; 凋亡论文; 蛋白论文; 患者论文; 统计学论文; 《医师在线》2015年9月第17期供稿《医师在线》2015年9月第18期供稿论文;