杨华卫[1]1999年在《两种DNA探针杂交在检测结核杆菌中的应用研究》文中研究表明为建立一种敏感、特异、快速诊断结核病的方法，本研究以PCR联用探针方法作为对照，对两种类型，两利酶标的DNA探针直接杂交检测结核杆菌的方法与条件及其临床应用做了较系统的研究。 制备、标记两种对结核分枝杆菌复合体特异的DNA探针：5′端标记生物素的寡核苷酸TB-42探钊和PCR合成生物素标记的188bp DNA探针。通过生物素、链霉亲和素系统连接碱性磷酸酶(催化显色反应)或辣根过氧化物酶(催化化学发光反应)枪测探针信号。首次应用188bp DNA探针杂交检测结核分枝杆菌(M.TB)染色体DNA和PCR扩增的317bp片段。系统研究并优化两种探针杂交检测的条件；比较两种探针杂交以化学发光法与显色法检测的敏感性与特异性；采用斑点杂交方法对20株结核分枝杆菌临床分离株，110份采用常规方法处理的痰标本以及68份采用自己建立的简化方法处理的痰标本进行检测、鉴定，验证两种探针临床应用的可行性。 研究发现，点膜条件：杂交与洗膜温度、杂交时间以及杂交液、洗膜液成份、探针浓度等均对杂交检测结果有影响。两种探针分别对21种分枝杆菌与9种非分枝杆菌的染色体DNA、317bp片段进行杂交反应。结果表明，特异性都很强，两者均仅对结核分枝杆菌复合体呈阳性反应，其它受试菌均呈阴性反应。当用显色反应检测时，寡核苷酸探针TB42检测结核分枝杆菌染色体DNA的敏感性为110ng，检测317bp DNA片段的敏感性为200pg；188bp DNA探针杂交检测的敏感性分别为7ng和50pg，结果表
秦迪岚[2]2008年在《荧光纳米标记与编码技术用于几种重要病原菌检测的研究》文中研究指明病原菌检测涉及到食品安全检验、疾病诊断、环境监测以及反生物恐怖等领域,与人类健康、社会安定和国家安全息息相关。传统的病原菌检测方法灵敏度低、费时耗力。各种建立在现代分子生物学、免疫学技术和现代分析仪器基础上的病原菌快速检测方法,为提高检测的灵敏度和可靠性做出了重要贡献,然而这些方法仍然存在各种局限性。功能化纳米材料具有许多普通材料无可比拟的优良特性,在病原菌的快速、灵敏检测上显示出广阔的应用前景。其中,硅壳荧光纳米材料是荧光最强的纳米材料之一,基于硅壳荧光纳米材料建立的荧光纳米标记技术比传统荧光标记技术具有更高的灵敏度和更好的光稳定性,为样品中少量病原菌的超灵敏检测提供了新的契机。本论文瞄准病原菌检测这一研究方向,在对各种病原菌检测方法进行简要综述的基础上,以荧光纳米标记与编码技术用于结核杆菌、大肠杆菌O157:H7等重要病原菌的快速、灵敏和多元检测为主线,主要开展了以下几个方面的研究工作:一、基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法(FNP-IIFM)用于结核杆菌快速检测的研究。将荧光纳米标记技术与免疫荧光分析法相结合,发展了一种新型的基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法用于结核杆菌的快速检测。通过采用兔抗结核杆菌抗体对目标结核杆菌进行特异性识别后,以修饰了葡萄球菌蛋白A的联吡啶钌(RuBpy)硅壳荧光纳米颗粒作为信号指示,利用葡萄球菌蛋白A与抗体之间的特异性结合,实现对结核杆菌的间接标记,通过荧光显微镜对标记的结核杆菌进行荧光成像检测。结果表明,该方法可以成功应用于对缓冲液体系、混合细菌样品和掺杂痰液样品中结核杆菌的检测,整个检测步骤包括样品预处理可在4h内完成;并且,采用硅壳荧光纳米颗粒作为荧光标记物用于结核杆菌的检测比传统荧光染料具有更高的信号强度与更好的光稳定性,有望应用于临床痰液标本中结核杆菌的快速检测。二、基于硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的双色流式细胞术(FSiNP@SG-FCM)用于结核杆菌检测的研究。将基于硅壳荧光纳米颗粒的免疫荧光分析法与流式细胞术相结合,发展了一种新型的基于功能化RuBpy硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的改良双色流式细胞术用于结核杆菌的检测。采用RuBpy硅壳纳米颗粒标记的抗体对样品中目标结核杆菌进行免疫荧光染色后,以核酸染料SYBR Green I对样品中细菌的核酸进行染色,从而将细菌与样品中的碎片杂质区分,通过多参数流式细胞术对样品中双染色的结核杆菌进行测定与分析。将该方法用于对缓冲液体系和掺杂尿液样品中的结核杆菌进行检测。结果表明,该方法显著地减小了由纳米颗粒团聚以及纳米颗粒对杂质碎片的非特异性吸附所引起的假阳性信号,对缓冲液体系和掺杂尿液样品的检测下限分别为3.5×10~3和3.0×10~4 cells/ml结核杆菌,并且比基于FITC标记的传统流式细胞术具有更高的灵敏度,整个检测步骤包括样品预处理可在2h内完成,有望应用于临床尿液标本中结核杆菌的快速检测。三、多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备研究。基于荧光共振能量转移(FRET)与反相微乳液法硅壳荧光纳米材料制备技术,发展了一种简易的多色光学编码硅壳荧光纳米材料的制备新方法。采用两种FRET供受体荧光染料按不同的比例与载体材料人免疫球蛋白(或多聚赖氨酸)作用制备荧光编码的载体材料,以荧光编码的载体材料为内核材料,利用氨水催化硅烷化试剂在反相微乳液中水解包裹内核材料制备成一系列多色光学编码硅壳纳米材料。对两类光学编码硅壳纳米材料的形貌和荧光性质进行考察,结果表明,以人免疫球蛋白为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为球形,而以多聚赖氨酸作为载体材料制备的光学编码硅壳纳米材料为棒状,通过改变供受体染料的标记比,可以获得一系列具有不同荧光发射光谱性质的纳米球或纳米棒,由于荧光共振能量转移效应,这些材料能以同一波长的光激发出不同颜色的荧光,而且荧光强、性质稳定、制备方法简便易行,在病原菌多元检测、多基因表达分析、蛋白质多元分析、多通道生物学测定、医学诊断学等方面都有广阔的应用前景。四、多色光学编码硅壳荧光纳米棒用于病原菌DNA片断多元检测的研究。基于多色光学编码硅壳荧光纳米棒建立多元荧光标记技术并与三明治固相核酸杂交检测技术相结合,发展了一种可用于对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种常见食源性病原菌DNA片断同时检测的多元分析方法。针对三种目标菌编码特异性毒素的基因序列合成目标DNA片断以及特异性的捕获探针和信号探针,在微珠上分别修饰三种捕获探针,对三种细菌目标DNA片断进行杂交捕获后,以分别修饰了三种信号探针的三种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示对目标DNA进行杂交检测。利用该方法对单一目标细菌DNA片断检测性能的考察表明,方法的检测下限为0.3 nM DNA、线性范围为0.3-1.9 nM DNA、可在2 h内完成分析;在此基础上进一步利用三种不同颜色的光学编码硅壳纳米棒作为信号指示与三明治核酸杂交相结合成功地实现了对大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生性李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种食源性病原菌DNA片断的同时检测,极大地提高了检测的效率。该方法可望用于病原菌基因的多元分析中。
钟华[3]2008年在《基于纳米粒子标记的化学发光DNA生物传感器的研究》文中研究指明本论文的主要内容就是将流动注射化学发光分析技术、纳米技术与核酸分子杂交技术相结合,研制高灵敏度高选择性的新型化学发光DNA传感器,对特定DNA片段进行选择性地识别和测定,为许多疾病的临床早期诊断提供基础性研究。本文着重进行了三种类型的DNA传感器的研制和性质研究:1.研究了一种新颖、灵敏的将luminol-H_2O_2-Cu~(2+)流动注射化学发光(FIA-CL)体系用于短序列DNA检测的生物传感器。工作原理如下:首先将目标DNA固定在玻碳电极(GCE)上,然后与标记了CuS纳米粒子的探针DNA杂交;用酸溶液将Cu~(2+)从杂交产物中溶出;最后,利用luminol-H_2O_2-Cu~(2+)体系对Cu~(2+)进行流动注射化学发光的检测,通过该体系的化学发光强度可以获知Cu~(2+)的浓度,从而实现对DNA的定量检测。为了增强DNA传感器的灵敏度,还利用阳极伏安溶出技术(ASV)进行了Cu~(2+)的预富集过程。在实验选定的最佳条件下,得到了目标DNA的线性范围为2.0×10~(-12)～1.0×10~(-10) mol/L,检测限为5.5×10~(-13) mol/L。另外,两碱基错配序列和完全非互补序列的杂交情况同样被检测。其中,两碱基错配序列显示有微弱的化学发光强度而完全非互补序列则无信号检出。这说明我们设计的DNA传感器具有良好的选择性。最后,对我们实验中所采用的luminol-H_2O_2-Cu~(2+)体系的化学发光机理进行了研究和探讨,并作出合理的理论推测。2.在前期工作的基础上,我们改进了实验方法,研究了另一种灵敏度更高的基于金纳米粒子信号放大的流动注射化学发光法检测DNA特定序列的生物传感器。首先,将巯基修饰的捕获DNA固定在金电极表面,之后分别与目标DNA和3'位标记CuS纳米粒子、5'位端基标记Au纳米粒子的信号DNA探针杂交,形成了“三明治”式的DNA杂交复合物。杂交结果的监测是通过从杂交物上溶解下来并预富集后的Cu~(2+)参与luminol-H_2O_2-Cu~(2+)体系反应的化学发光强度来完成的。因为单个Au纳米粒子可负载很多修饰了CuS纳米粒子的信号DNA探针,所以将Au纳米粒子设计到该传感器中能够很大的增强其灵敏度。而利用阳极溶出伏安技术进行的Cu~(2+)的预富集过程进一步增强了传感器的灵敏度。结合以上两种因素,该DNA传感器可检测到fmol/L级的低浓度的目标DNA,并在两碱基错配DNA的测定上显示出良好的选择性。同时,对实验的最佳检测条件进行了选择,对DNA探针的微观性质进行了系统研究和探讨。在最佳条件下进行检测,在2.0×10~(-14)～2.0×10~(-12) mol/L范围,化学发光强度随目标DNA浓度的增加而增加,该法检测限可达到4.8×10~(-15) mol/L。3.在以上两种DNA传感器的研究基础上,我们结合最新的文献报道构建了一种新颖的、利用CuS纳米粒子修饰的鸟嘌呤(G-CuS NPs)探针检测单碱基错配DNA序列的流动注射化学发光法。与前两种不同的是这一新的传感器的研究目的不再局限于完全互补序列和非完全互补序列DNA的识别和检测,它的主要用途是DNA缺陷(DNA损伤)或DNA突变的检测。其原理是:首先将巯基修饰的捕获DNA固定在金电极表面,之后直接与单碱基错配目标DNA序列(碱基错配相当于模拟实际样品中的DNA缺陷或损伤、突变的情况)进行杂交并以与捕获DNA完全互补的DNA序列封闭活性点,最后,在DNA聚合酶的催化下,按照Watson-Crick碱基配对法则,硫化铜纳米粒子修饰的鸟嘌呤探针通过与目标DNA上的错配碱基的配对结合连接到dsDNA上。同样地,杂交结果的监测通过从杂交物上溶解下来并预富集后的Cu~(2+)参与luminol-CN--Cu~(2+)体系反应的化学发光强度来完成。为了增强DNA传感器的灵敏度,还利用阳极伏安溶出技术进行了Cu~(2+)的预富集过程。理论上如无缺陷或损伤及突变情况(捕获序列与目标序列完全杂交),则探针不能与双链结合无信号检出。在实验选定的最佳条件下,体系的化学发光强度随单碱基错配目标DNA的浓度的增大而增强,验证了该实验方案的可行性。
梁建琴[4]2005年在《应用膜反向斑点杂交技术快速鉴定分枝杆菌菌种和耐药结核分枝杆菌基因型》文中进行了进一步梳理目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分枝杆菌菌种鉴定方法,研究膜反向斑点杂交方法在快速鉴定分枝杆菌菌种方面的应用价值。 方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,简称PCR)—单链构象多态性(single stranded conformation polymorphism,简称SSCP)分析253株分枝杆菌临床分离株;设计与合成用于鉴定分枝杆菌菌种的16S rRNA寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上。与待测的28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和253株分枝杆菌临床分离株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。 结果:应用PCR—膜反向斑点杂交方法分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步鉴定,198株为结核分枝杆菌复合群,经膜杂交,显示a1杂交阳性,两种鉴定方法结果一致:36株非结核分枝杆菌经膜杂交,11株鉴定为堪萨斯、瘰疬、胃、猿猴分枝杆菌,6株鉴定为胞内分枝杆菌,4株鉴定为耻垢分枝杆菌,3株鉴定为母牛分枝杆菌,3株鉴定为龟分枝杆菌,2株鉴定为戈登分枝杆菌,2株鉴定为偶发分枝杆菌,2株鉴定为结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为鸟胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为土分枝杆菌,1株鉴定为鸟分枝杆菌,另19株未出现分析探针阳性杂交。PCR-膜反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种的灵敏度为92.49%,特异度为100%。 选用孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜,选择各菌种特异性探针,探针终浓度为1.5pmol/μl,采用杂交温度42℃、杂交时间60分钟、45℃洗膜5分钟杂交结果较理想。 结论:影响杂交的主要因素是探针序列的组成、探针浓度、杂交和洗膜温度、洗膜时间等。PCR-膜反向斑点杂交技术可简便、快速、特异地鉴定分枝杆菌菌种,仅需2天时间。
蒋杰[5]2013年在《发光功能化纳米材料在结核病诊断化学发光核酸传感器中的应用》文中指出论文首先综述了化学发光、纳米材料参与的液相化学发光体系、化学发光核酸传感器、发光功能化纳米材料及其在化学发光核酸传感器中的应用和结核病诊断方法的研究现状。化学发光分析由于灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、价格便宜等优点,已经成为生物分析包括免疫分析与核酸分析的主要探测手段。目前发光生物分析方法主要依赖于标记技术,各种标记物与蛋白分子或核酸片段偶联形成生物分析探针,因此,制备特异、灵敏的分析探针是这一技术成功的关键。现行的商业上基于标记技术的化学发光生物分析方法中,一个分析探针仅能联接单个信号分子,使分析的灵敏度受到限制,难以进行低含量组分的检测。因此,一个分析探针联接多个信号分子的多标记分析方法受到了人们的关注。通过在纳米材料上富集多个化学发光信号分子即发展发光功能化的纳米材料,成为一种具有创新概念的纳米科学发展新趋势。这些发光功能化纳米材料为核酸分析探针提供了一种理想的具有信号放大功能的标记物,有望对传感器的灵敏度的提高起到积极地推动作用。基于此,本论文围绕着发光功能化纳米材料在结核病诊断化学发光核酸传感器中的应用这一研究主题,开展了一系列研究工作。利用实验室前期工作合成的鲁米诺发光功能化纳米金构建核酸分析探针,发展了均相和异相两种分析策略,开发出两种化学发光核酸传感器,并进一步推向于实际应用,实现对结核病临床快速灵敏特异诊断。此外,我们探索新型简单快捷的合成方法,制备了具有高量子产率的新型发光纳米材料——碳点,研究了所制得碳点的形貌、表面化学组成和荧光性质等；设计与构建碳点参与的化学发光新体系,探索了其化学发光行为、规律和机理。主要研究内容如下：1.基于鲁米诺发光功能化纳米金卓越的信号放大功能,标记DNA构建信号探针,同时引入纳米金修饰电极以及生物素-链霉亲和素生物放大系统,构成多重信号放大基元,由此发展了一种新型的超灵敏电致化学发光DNA传感器,用于结核分枝杆菌(TB)的检测。传感器的构建过程如下：我们选取结核分枝杆菌特异性插入序列IS6110中一段DNA片段作为靶基因序列,设计与合成了能与之发生特异性互补杂交的两段探针。将捕获探针固载到链霉亲和素包裹的纳米金修饰电极上,与TB目标链反应后,鲁米诺发光功能化纳米金标记的信号探针随即组装连接到修饰电极的表面,形成“三明治”模式的TB传感器。富集在鲁米诺发光功能化纳米金表面的鲁米诺发光分子作为信号源,在双阶脉冲电压下会产生电致化学发光信号响应,从而实现对TB目标链的检测。所构建的电致化学发光TB传感器对于人工合成的TB目标链的检测限可达到6.7×10-15mol/L,该检测限优于文献报道的其它基于金纳米探针的结核分枝杆菌基因诊断方法。该TB传感器稳定性好且具有良好的选择性,其它致病菌如大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA对于目标物的测定几乎不产生影响。此外,该TB传感器成功被用于结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取的基因组DNA的检测,对于结核分枝杆菌实际临床基因诊断具有重要的应用潜力。2.采用鲁米诺发光功能化纳米金标记适配体构建了发光功能化纳米适配体探针,利用适配体探针识别目标物所引起的氯化血红素/G-四联体DNA酶构型的转变,以及氯化血红素/G-四联体DNA酶对鲁米诺功能化纳米金的化学发光增强作用,提出了均相分析策略,发展出一种用于结核病诊断相关的干扰素.-gamma检测的化学发光适配体传感器。传感器的构建过程如下：我们将氯化血红素/G-四联体DNA酶中的G-四联体链对称地劈裂成两部分,并将这两部分连接到干扰素-gamma适配体(记作P1链)的互补序列的两端从而形成P2链。端基生物素化的P1链与P2链杂交形成稳定的双链结构,同时,通过生物素-链霉亲和素之间的特异性相互作用组装到链霉亲和素包裹的鲁米诺发光功能化纳米金上,从而成功构建了鲁米诺发光功能化纳米金传感平台。与鲁米诺发光功能化纳米金传感平台中的干扰素-gamma适配体识别目标物干扰素-gamma时,释放P2链到溶液中。处于自由状态的P2链可以自组装形成稳定的G-四联体结构,并与随后加入的氯化血红素反应形成氯化血红素/G-四联体DNA酶,有效催化鲁米诺发光功能化的纳米金与过氧化氢之间的化学发光反应,从而实现对干扰素-gamma特异性的定量检测。所构建的适配体传感器用于检测目标干扰素-gamma时,展现出较宽的线性范围0.5～100nmol/L和低的检测限0.4nmol/L。这一检测限与之前文献报道的多数异相的干扰素-gamma检测适配体传感器的检测限基本相当,但更为简便、快速和实用。此外,该适配体传感器显示出良好的精确度、稳定性和重现性,不被复杂的人血清基质所影响,在生理介质中显现出的较强的适用性,在结核病临床诊断中具有重要的实际应用潜力。3.报道了一种简单便捷的碳点合成方法,通过使用氨基酸作为前驱体,经由酸/碱辅助的一步微波法制备碳点。借助高分辨透射电子显微镜(HRTEM)、X射线粉末衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、紫外-可见吸收光谱(Uv-vis)、傅里叶红外光谱(FT-IR)和荧光光谱等仪器分析手段,对所合成的碳点的形貌结构、表面状态和光学性质进行了详细研究。结果表明,所合成的碳点大小均一,粒径在1-4nm之间。表现出强烈的荧光性质和优良上转换发光特性,量子产率高于目前文献报道的绝大多数碳点,是目前量子产率最高的碳点之一。此外,该碳点还能够有效增强高碘酸钠-过氧化氢体系的超微弱化学发光。本章工作所作研究与所获结果为碳点光学性质的研究提供了新视点,并且对于拓宽碳点这种新材料在分析领域的应用具有一定的重要意义,在光电器件、生化分析、生物医学和生物成像等领域有重要的应用前景。
李红霞[6]2007年在《结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究》文中研究指明结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，据世界卫生组织(WHO)统计，当前全球约有1／3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国结核杆菌感染率为44.5％，活动性肺结核患者451万，每年死亡人数达13万。结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。对结核分枝杆菌的研究再度成为了全球研究的热点。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法。1998年结核分枝杆菌基因组破译成功，运用基因组杂交技术对结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)的基因组序列进行比较，发现卡介苗(BCG)相比于结核分枝杆菌，有16个基因差异的区域(Region of Difference，RD)，包括RD1-16，其中的RD1区是仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10、ESAT6和PPE68的编码基因均存在于RD1区，且具有强烈的免疫原性，因此可将ESAT6、CFP10和PPE68作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂。由于单一蛋白在诊断上灵敏度不理想，目前有很多学者认为两个或多个特异性蛋白的联合，有利于提高检测的灵敏度。本研究构建了原核重组质粒pGcfp10、pGesat6、pGcfp10-esat6以及pGesat6-ppe68，经IPTG诱导后在大肠杆菌中高效表达，通过纯化试剂盒获得纯化的重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68，将三种纯化蛋白免疫动物，获得了高效价的多克隆抗体血清。以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为参考，在建立PPD-ELISA的基础上，建立了以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法，旨在为临床结核病的诊断提供敏感性、特异性和实用性都比较理想的诊断试剂，为我国结核病的防治提供技术支持。为了能进一步诊断病人是否为现症感染，本实验建立了以多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，为结核病的早确诊、早治疗提供了一种新的技术思路。本研究共分五部分进行：第一部分，以结核分枝杆菌H37Rv国际标准株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出303 bp的cfp10基因和288 bp的esat6基因，随后将其分别定向连接入原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10和pGesat6，经IPTG诱导，约36kDa的GST-CFP10和约32kDa的GST-ESAT6融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，并将GST-ESAT6融合蛋白通过谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。第二部分，用重叠区扩增基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因，并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6，IPTG诱导表达约42 kDa带GST标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第三部分，采用重叠区扩增基因拼接(GeneSOEing)法实现了结核分枝杆菌esat6及ppe68基因融合，融合基因esat6-ppe68被克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中，构建了原核表达重组质粒pGesat6-ppe68，并使约69 kDa的GST-ESAT6-PPE68融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第四部分，将构建的原核表达重组质粒pGesat6、pGcfp10-esat6、pGesat6-ppe68分别在大肠杆菌中经IPTG诱导后大量表达带GST标签的融合蛋白，采用谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒获得大量高度纯化的融合蛋白，并将部分纯化蛋白免疫动物，制备高效价的多克隆抗体血清。第五部分，以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。通过与PPD-ELISA进行比较，认为三种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断上显示了更高的特异性，将特异性抗体ELISA检测方法用于复检PPD-ELISA阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较三种特异性抗体ELISA检测方法的特异性与灵敏度，认为两融合蛋白-ELISA的敏感性高于单一蛋白ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISAZ间的敏感性无差异，但CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于ESAT6-PPE68-ELISA，三种特异性抗体ELISA检测方法以CFP10-ESAT6-ELISA效果最好，PPE68也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。本部分研究还建立了以包被多克隆抗体检测结核特异性抗原的双抗体夹心ELISA方法，经检测发现，三种方法的灵敏度均较低，分别为12％、18％、19％，但特异性很高，接近100％，认为以结核特异性抗体来检测病人血清中的结核特异性抗原的ELISA检测方法是一种诊断病人是否为结核现症感染的可行的新技术方法。综上所述，检测结核特异性抗体的ELISA方法用于结核病的检测具有敏感性较高，特异性强等优点，可望开发成诊断试剂盒，满足目前临床上结核病诊断的需要，为我国结核病的防治提供技术支持；检测结核特异性抗原的ELISA方法能区别现症感染与既往感染，也能用于结核病治疗的疗效考核，具有很高的研发价值。
蒋莹[7]2005年在《基于交流阻抗技术构建的新型电化学DNA生物传感器的应用研究》文中进行了进一步梳理随着对基因结构与功能的研究不断深入,特别是人类基因组计划(HGP)的迅速发展,基因诊断已经成为分子生物学和生物医学研究中的重要领域。对人体、病毒和细菌核酸中特定碱基序列的检测在疾病诊断、食品污染、法医鉴定和环境监测等领域都将会发挥越来越重要的作用。如此大规模的基因检测要求建立一种简便、迅速、廉价、微型化的分析装置。许多新的生物技术的开发,为发展高灵敏度、高特异性的基因分析检测方法注入了活力,其中利用DNA分子间的特异性互补配对规律发展起来的各种DNA生物传感技术,引起了国内外生物分析工作者的广泛关注。其中电化学DNA生物传感器正是顺应着简便、迅速、廉价、微型化的需要发展起来的。它具有灵敏度高、轻巧便宜、携带方便、耗能少等优点;能与现代微电子技术联用,易于实现微型化;并且检测不会受到样品混浊度和光路的限制,是一门新兴的,涉及生物化学、电化学、医学及电子学等学科的交叉领域。目前受到了研究者们的广泛关注,已成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。 交流阻抗技术能够提供有关电极界面性质的大量信息,包括电阻传递电阻,双电层电容等,是高效便捷的研究电极过程的有利工具,已被广泛地应用于研究修饰电极界面性质的各个领域。用这一技术构建的电化学DNA生物传感器,可检测杂交前后电极界面多种电化学性质的变化,具有灵敏、迅速、无需标记物和指示剂等优点。有人甚至认为交流阻抗技术比其他任何技术都更适于用来评价错配碱基对DNA电子和电子传递性质的影响。 本论文将核酸杂交技术和电化学交流阻抗技术有机地结合起来,研制具有高灵敏度高选择性的新型交流阻抗DNA电化学生物传感器,成功地应用于对特
李海燕[8]2010年在《纳米金复合探针结合基因芯片在鉴别结核分枝杆菌中的应用》文中研究表明结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,简称结核杆菌)引起的经呼吸道传播的全身性慢性传染病,其在全球广泛流行,严重危害人类健康,已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。因此,建立快速、高效、特异的检测结核分枝杆菌新方法势在必行。近几年来,核酸检测中应用纳米金颗粒替代目前通用的荧光、同位素等信号分子已比较普遍。大量实验表明,纳米金复合探针因具有稳定性高、标记密度高和杂交效率高等特点而广泛用于核酸检测。因此,本研究将纳米技术与基因芯片技术有机结合在一起,在此基础上建立了两种目视化核酸检测新方法,即基因芯片膜转印检测法与基因芯片交联放大银染检测法,为分子生物学领域提供了快速、简便、高灵敏度的检测病原细菌新方法。本实验室采用经典柠檬酸三钠还原氯金酸法制备纳米金颗粒。基于纳米金颗粒与巯基修饰的寡核苷酸共价结合作用及与蛋白分子的吸附作用,我们构建了不同种类的纳米金复合探针,并且通过透射电子显微镜(TEM)和紫外吸收光谱对纳米金颗粒及纳米金复合探针进行形貌观察和表征分析。本研究首先利用碱基互补配对原则使纳米金复合探针与靶DNA分子在芯片表面形成夹心复合结构,再用膜转印法或银染法将芯片上不易观察的结果信号转化成易检测信号,最后通过普通光学扫描仪读取信号结果或肉眼直接判读信号有无来判断靶DNA的有无。结果表明,透射电子显微镜观察所制备的纳米金颗粒,其粒径为(13±2)nm,形貌呈球形,大小均匀,分散良好；制备的纳米金复合探针形态完好,分散均匀,稳定性好。通过紫外分光光度计在521 nm处的吸光度计算出所制备纳米金溶液的浓度为12.5 nmol／L。当纳米金颗粒表面信号探针与检测探针摩尔比为10：1,两种信号探针(T10,T40)摩尔比为9：1时,运用基因芯片膜转印检测法肉眼可检测0.23 pmol／L的结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物或1 pmol／L的合成靶DNA分子。在优化交联纳米金复合探针使用量和银染增强时间条件下,基因芯片交联放大银染检测法可肉眼检测10 fmol／L的合成靶DNA。以上实验结果显示,运用纳米金复合探针结合基因芯片技术的两种核酸检测新方法,具有操作简单,灵敏度高,特异性好和无需特殊仪器设备等特点。通过运用纳米金复合探针不仅利于杂交反应,而且通过标记不同的标记物,将基因芯片上不易检测的结果信号转化为可目视化检测的信号。因此,基因芯片膜转印检测法与基因芯片交联放大银染检测法均是较好的结核分枝杆菌检测新方法,在生物分子检测方面具有较高的应用价值。
杨华卫, 杨树德, 庄玉辉, 李国利, 李邦印[9]2000年在《两种DNA探针杂交检测结核分支杆菌方法的研究》文中进行了进一步梳理为改进结核杆菌DNA探针的特异性与实用性,研制了以生物素标记的两种对结核分支杆菌特异的DNA探针:一个5’端标记的20bp的寡核苷酸探针和一个采用PCR方法合成的188bp长链探针。两种探针分别与结核分支杆菌的全染色体DNA,以及基因组上IS6110序列的一段317bp的PCR扩增产物进行斑点杂交,以碱性磷酸酶(AP)催化的染色反应检测,测试了两个探针的敏感性和特异性。系统地比较研究了两种探针杂交检测条件:探针的浓度选择,杂交温度与洗膜温度的选择,以及杂交与洗膜温度对检测的敏感性与特异性的影响。寡核苷酸探针和188bp探针杂交检测纯化结核分支杆菌基因组DNA的敏感性分别为100ng与6ng,杂交检测PCR产物的敏感性分别是400pg与50pg。两探针的最佳杂交浓度均为40～160ng/ml,最佳杂交温度分别是42℃与68℃,最佳洗膜温度分别是60℃与60～68℃之间。两种探针均仅与结核分支杆菌及BCG有杂交信号,而与其它受试分支杆菌及非分支杆菌杂交结果都呈阴性。它们的特异性都很强,但188bp探针的敏感性约是寡核苷酸探针的7～16倍,而且188bp探针检测本底较低,是检测结核分支杆菌的较佳选择
祖燕, 闫国蕊, 张舒林[10]1999年在《DNA探针板杂交法检测临床标本中结核杆菌的应用》文中研究说明目的：在酶标板上进行ＤＮＡ探针杂交，评价其在检测临床标本中结核杆菌的应用价值。方法：收集７１份结核性标本和３２份非结核性标本，进行ＤＮＡ扩增，把扩增产物分别进行电泳和ＤＮＡ探针杂交，比较其结果。结果：７１份结核性标本电泳法阳性率为４５１％，ＤＮＡ探针法阳性率为６９０％；３２份非结核性标本二者均为阴性。结论：ＤＮＡ探针杂交可提高临床标本中结核杆菌的阳性检出率，是结核病早期诊断的一种新方法。
参考文献：
[1]. 两种DNA探针杂交在检测结核杆菌中的应用研究[D]. 杨华卫. 中国协和医科大学. 1999
[2]. 荧光纳米标记与编码技术用于几种重要病原菌检测的研究[D]. 秦迪岚. 湖南大学. 2008
[3]. 基于纳米粒子标记的化学发光DNA生物传感器的研究[D]. 钟华. 青岛科技大学. 2008
[4]. 应用膜反向斑点杂交技术快速鉴定分枝杆菌菌种和耐药结核分枝杆菌基因型[D]. 梁建琴. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2005
[5]. 发光功能化纳米材料在结核病诊断化学发光核酸传感器中的应用[D]. 蒋杰. 中国科学技术大学. 2013
[6]. 结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究[D]. 李红霞. 四川大学. 2007
[7]. 基于交流阻抗技术构建的新型电化学DNA生物传感器的应用研究[D]. 蒋莹. 华东师范大学. 2005
[8]. 纳米金复合探针结合基因芯片在鉴别结核分枝杆菌中的应用[D]. 李海燕. 华东师范大学. 2010
[9]. 两种DNA探针杂交检测结核分支杆菌方法的研究[J]. 杨华卫, 杨树德, 庄玉辉, 李国利, 李邦印. 微生物学报. 2000
[10]. DNA探针板杂交法检测临床标本中结核杆菌的应用[J]. 祖燕, 闫国蕊, 张舒林. 河南医学研究. 1999
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