资兴市食品药品工商质量监督管理检验检测中心 423400
【摘 要】目的：探索分析沙门菌定性检验方法的关键环节。方法：选取相关计划中提供的样品，当做此次研究的对象，对原始标本做第一次增菌和二次增菌。对三种增菌液做分离培养。实施荧光PCR试验，比较第一次增菌和二次增菌效果。结果：15个分离培养方法的样品中，有12件检查出沙门菌。实时荧光PCR方法的样品中，有14件检查出该种细菌。结论：检测沙门菌方法优化后，开展大规模样本的筛查和检测时，运用直接检测增菌方法或者使用SC二次增菌鉴定的分离培养方法，有助于将工作量减少，避免了资源浪费，具有推广应用价值。
【关键词】沙门菌；定性检验；关键环节
全球范围内，食源性的疾病逐渐增多，此种背景下，人们更加关注食品问题，对于食品中一些细菌的检验工作，变得更加重视，在众多病菌中，沙门菌是引起疾病的食源性病菌[1]，其检测的灵敏性，对于食品细菌检测工作有着积极意义。下面就沙门菌定性检验方法的关键环节的相关试验，做详细报道：
1.资料与方法
1.1基础资料
选用样品：将相关鉴定计划提供的考核样品为研究对象，一共有十五件，状态是冻干状，白色微球，直径大约是3mm左右。
仪器和试剂：荧光定量PCR仪器；VITEK 生化试剂、科玛嘉沙门显色琼脂、亚硫酸铋、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、诊断血清、三糖铁琼脂、木糖赖氨酸胆酸盐琼脂、四硫酸钠煌绿增菌液、缓冲戴白胨水。
1.2方法
分离细菌的培养鉴定：以PT为指导要求，操作原则为国际标准法，然后实施检验工作。第一，第一次增菌：操作要在无菌条件下，选择计量是1ml的BPW，等到其将样品全部溶解，向其加入10ml的BPW，培养环境的温度要保证为36℃±1℃，培养时间为8h-18h。第二，开始增菌，对上述培养样品进行轻轻地晃动，然后选择其的1ml。放到10ml的TTB里面，培养环境的温度保持在42℃±1℃，培养时间在18h-24h之间。同一时间，选取第一步中样品1ml，放到10ml的SC里面培养环境的温度保持在36℃±1℃，培养时间在18h-24h之内。第三，分离，分别从上面地方两种增菌液取出1环，依次放到三种试验板上，包括CAS显色板、XLD琼脂板、BS琼脂板，分别将其放置在温度是36℃±1℃的环境中，继续培养，时间保证18h-24h。观察出现菌落的具体情况，包括菌落形态和生长情况。第四，生化试验，选择出多于两个的可疑菌落和典型的菌落，分别把这些菌落接种到三糖铁琼脂中，以斜面划线为基础，对其底层穿刺。对于接种针，也不需要直接灭菌，然后将这些接种到营养琼脂的平板，培养环境的温度保持在36℃±1℃，继续培养，具体时间是18h*24h。在营养琼脂平板基础上，选择出一些疑似的菌落，然后按照VITEK2 Compact 中具体内容继续操作，实施试验活动，判定试验结果。如果结果达到生化三塘初筛标准，就可以用到VITEK系统，去鉴定生化结果。然后实施沙门多价血清凝集的试验，去判定最终的结果。
实时荧光PCR方法：第一，DNA模板制作出来，分别选取每种菌液，计量为1ml，具体指标是8000rpm/min，以5分钟的时间做离心，将上清清除干净，使用1ml的DEPC加入其中，将其洗涤并沉淀。再次将指标设定为8000rpm/min，以5分钟的时间做离心，将上清清除干净，使用100DEPC和水加入，将其放置在沸水下，保持加热10分钟。将指标设定为12000rpm/min，以10分钟为离心，将上清清除干净，准备以后使用。第二，荧光PCR反应，25的反应体系范围中包含了12.52 PCR的反应混合物，上游和下游引物标准是0.2，DNA模板是2。进行PCR反应具体条件：温度确保在95℃之下，反应时间保证有10分钟；然后95℃之下保证有15秒；60℃之下保证有1分钟，以这样的顺序循环40次。各个样本呈现出了一定扩增曲线，为s型，Ct值增加，菌液浓度却减小，并且Ct值范围在10-35之间，这样结果就是说诊断是阳性，如果不是这样，结果则是诊断是阴性[2]。
1.4统计方法
采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析，表示计量资料的方法为，采用t检验，（n）表示计数资料中的例数、（%）表示百分数，采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1分析分离培养方法下检测的结果
经过BPW的第一增菌，全部试验液全部呈现出不种程度浑浊状态，表示有菌落存在。经过了SC以及TTB的二次增菌，实验结果与第一次相比，并没有差异，不具有统计学意义。第一次增菌方法下，全部样品中有12件样品出现了典型菌落，数据见表1。
表1 样品种菌落的分布
3、讨论
沙门菌常见的一种食源性的能够导致疾病的细菌，现今对于其的检测方法是国际标准检测方法，需要耗费的时间比较长，通常情况下，会需要4天到5天的时间，并且必须要满足两种增菌液与两个不同培养温度的条件，这样就需要花费更多的物力和人力以及材料。
此次研究中使用了相关计划中准备的15件样品，将其做为试验对象，样品来源非常可靠，初始浓度确定后，提供出了可以对增菌条件进行评价的不同浓度样品。另外此次研究。用到了荧光PCR检测的方法，达到了有效评价两种不同增菌液的实际增菌效果，以精确地检测出细菌DNA定量为实际基础，可以正确反映出增殖效率和菌液浓度，表明了这种方法有着明显特异性，灵敏度较高，可靠性好，同传统模式的分离培养方法比较，在增菌效果区分上，显示出一定优势。以文献[3]中提到的判断结果有着一致性。
在一般试验中，必须要注意食品样品具有的物理性质，本身具有致病菌，并且受到其他细菌影响，一不小心试验结果就会出现偏差，检测正确率受到一定影响[4]。但是在BTW之下，能够对于样品做富集的增菌培养，对于增菌液的PH值可以做适当调整，使其降低或者升高，对其他杂菌生产繁殖进行控制，为靶向菌的增殖提供良好环境条件。但依然存在缺陷，那就是当样品受到了辐射或者冷伤等物理损伤时，这种效果也不够明显，因此需要二次增菌，像SC、TTB，才能使得样品的达到沙门菌平板灵敏度的要求。
综上所述，有良好增菌是提升该菌检测灵敏度的重要环节，对于食品中该病菌来说，运用何种检测方法能够提升检测的实用性和科学性是非常重要的，因为此次研究中的样本数据有限，因此需要更多试验和研究人员，对沙门菌定性检验方法关键环节做深入分析。
参考文献：
[1]曲梅，张新，吕冰，等. 沙门菌定性检验方法关键环节评价[J]. 中国卫生检验杂志，2014（19）：2743-2745..
[2]肖剑，陈娟丽，张彬彬，等. 沙门氏菌快速检测板在食品检测中的应用研究[J]. 食品安全质量检测学报，2016，7（11）：4667-4671.
[3]王杰，陈颖钰，彭清洁，等. 沙门菌检测方法研究进展[J]. 动物医学进展，2016，37（4）：94-98.
[4]韦宏珍. 预防性健康体检中沙门菌检验方法的探导[J]. 检验医学与临床，2017，14（A01）：117-118.
论文作者:邵雪全
论文发表刊物:《中国蒙医药》2018年第6期
论文发表时间:2018/8/17
标签：沙门论文; 样品论文; 菌落论文; 琼脂论文; 方法论文; 细菌论文; 时间论文; 《中国蒙医药》2018年第6期论文;