陈玮, 邵传森, 沈建根, 鲍建芳, 潘建平[1]2002年在《鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达》文中研究指明目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载体 ,使两个目的基因均受各自的启动子 CMV控制 ,构建成 m IL - 12双亚基共表达质粒 p Cm IL -12 ,并进行体内外表达。结果 :p Cm IL - 12在体外转染 COS- 7细胞后 ,经 EL ISA证实有 m IL- 12表达 ,其表达上清能在体外明显增强小鼠 NK细胞活性。小鼠皮内注射 p Cm IL - 12亦能增强小鼠 NK细胞活性。结论 :所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的 m IL- 12
陈玮[2]2001年在《mIL-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达》文中研究说明白细胞介素12（IL-12）是由B细胞、单核巨噬细胞等抗原递呈细胞分泌的一种异二聚体细胞因子。研究表明，IL-12能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用；促进巨噬细胞的活化和多种细胞因子的产生；调节Th0细胞向Th1细胞分化发育，增强细胞免疫功能。上述生物学功能提示，IL-12在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。这在多种肿瘤包括B16F10黑色素瘤、Renca肾细胞癌、Lewis肉瘤等模型中已得到证实。然而，体内直接注射IL-12蛋白所致的毒副作用限制了其临床应用。自Wolff等（1990年）提出基因治疗的新方法——裸DNA（naked DNA）直接注射以来，为解决该问题提供了新思路。质粒DNA注入体内可在局部细胞表达分泌，使局部组织积聚高浓度的IL-12，改善肿瘤的微环境，激发抗肿瘤免疫应答，且血清中的IL-12较低，避免全身性的毒副作用。实验目的 利用双CMV启动子构建小鼠IL-12（mIL-12）双亚基共表达的真核表达质粒pCmIL-12。并将pCmIL-12在体内外进行表达，观察其在体外能否表达有生物学活性的mIL-12以及体内增强NK细胞活性的潜能，为进行mIL-12肿瘤基因治疗研究奠定基础。实验方法 将 mIL一2p35和 p40全长编码 cDNA分别从 pBluescript SK／mp35和pBluescript SK／mp40质粒中切下，分别构建到 pcDNA3．l（＋）（以下均简称为pCDNA3且）载体中，即 pC35和 pC40。再把 p35的表达单元（CMV－p35－BGHPA）从pC35中切下，插人pC40载体中，使两个目的基因均受各自的启动子CMV控制，构建成mIL－12双亚基共表达质粒pCmIL－12。 将 pCmILJ 2体外转染 COS－7细胞，收集培养上清，检测其中 mIL－12的含量以及对小鼠NK细胞活性的影响。并进一步在小鼠皮内注射该质粒，观察其在体内对小鼠NK细胞活性的影响。实验结果 对 pCmIL－12进行酶切鉴定和序列分析，结果与预期的一致。 pCmlL－12、pC35＋pC40、pcDNA3l叁组质粒分别转染COS－7细胞进行瞬时表达。表达上清与小鼠脾细胞共孵育后，前两组的NK细胞活性分别达42．9土3．78％和28．6士3．820，与pCDNA3．l表达上清（ZI．4土3．89％）相比均有显着差别（P＜0．05）。而且 pC＜IL－12表达上清的活性明显强于 pC35和 pC40同时转染的上清（P＜0刀5）。对表达上清中的ml＊－12中7o）的测定结果显示：扯ml＊－12的表达上清中含mIL－12蛋白270－350pg／ml，而pcDAN3＊的表达上清中不含ffiILIZ。 叁组不同的质粒分别作小鼠皮内注射后发现，注射PCmIL12的小鼠NK细胞活性高达52石士5石％，而皮内注射pC35＋pC40及pCDNA3．l’J’鼠NK活性分别为20刀士8．8％及18．4士5．4％，前一组和后两组间有显着差异（P＜0刀1）。实验结论 1、我们构建的pCmIL刁 质粒在体外能够表达mIL－12，其表达上清能明显增强NK细胞活性，而且作用强于pC35和 pC40同时转染细胞的表达上清。 2、pCmIL1 质粒在小鼠体内表达后亦能显着增强NK细胞的活性，而且其活性高于体外的表达上清。pC3s和 pC40在体内却不能表达有活性的 IL＊。 二 3小CmIL1 质粒在体内外均能表达有生物学活性的mIL1，可用于几＊基因治疗的研究。
李菁华[3]2006年在《转染IL-12的骨髓间充质干细胞治疗胶质瘤的研究》文中研究表明胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤,其较高的复发率使之成为临床治疗的难题。基因治疗是脑肿瘤治疗的重要手段,而基因治疗肿瘤的疗效主要决定于目的基因和载体系统的选择。目前干细胞已用于多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体,如神经干细胞,但面临着伦理、来源等问题。骨髓间充质干细胞(BMSCs),有多向分化的潜能,且取材容易,能迅速培养扩增,通过自体移植又可避免免疫排斥反应,具有更广阔的应用前景。本研究旨在体外分离培养BMSCs,将IL-12,一种强效抗肿瘤作用的细胞因子,通过逆转录病毒导入BMSCs,利用BMSCs能够迁移追踪肿瘤细胞,并能整合于宿主细胞,长期、稳定表达外源基因的特点,将其作为脑肿瘤基因治疗的载体,通过体外及体内实验观察对胶质瘤的作用,干细胞的存活和分化情况,并对其抗肿瘤作用机制进行了研究。结果表明分离鉴定得到的具有多向分化潜能的大鼠BMSCs,作为IL-12基因治疗的载体移植入胶质瘤模型体内,可以存活并可抑制胶质瘤的生长;IL-12抗肿瘤作用的机制并不是IL-12直接抑制肿瘤细胞的生长,而是通过刺激CD4~+和CD8~+的T淋巴细胞浸润起抗肿瘤作用。该研究为BMSCs作为载体对肿瘤进行基因治疗提供了实验依据。
潘运龙[4]2007年在《纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖和H22肝癌血管生成的研究》文中研究说明目的：近年研究表明纳米金能够阻止具有肝素结合位点的VEGF165与其受体VEGFR-2的结合，并抑制VEGF165的信号传导。本实验利用纳米金的这种新特性，研究纳米金能否抑制血管内皮细胞增殖并抑制裸鼠肝癌血管生成。以往研究认为白介素12(IL-12)通过诱导干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)和干扰素-γ诱导单核因子(MIG)的生成，进而抑制肿瘤血管生成。然而，VEGF和Ang-2(血管生成素-2)是目前已知血管内皮细胞增殖的主要促进因子，我们推测IL-12是通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达，抑制血管内皮细胞增殖，发挥其抑制肝癌的血管生成和肝癌生长的作用。这种推测需要用实验加以证实。方法：1．用免疫印迹方法检测纳米金是否能特异性的与bFGF肝素结合位点结合；用纳米金与血管内皮细胞作用，检测细胞下游信号PLC—γ1的变化；用缺乏肝素结合位点的VEGF121作为对照，观察纳米金对血管内皮细胞增殖的影响；用AFM表征纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后形貌大小变化，以及纳米金与血管内皮细胞作用前后细胞超微结构变化。将H22肝癌接种到Balb／c裸鼠，用或不用纳米金处理作为治疗组和对照组。用免疫组化方法检测肝癌微血管密度。测量肝癌大小、重量。2．构建含小鼠白介素12(mIL-12)双亚基基因的重组腺病毒(AdvmIL-12)，检测重组腺病毒对H22肝癌细胞的感染效率。用ELISA法测定H22细胞中mIL-12蛋白的表达量；观察AdvmIL-12对H22细胞生长的影响。将AdvmIL-12转染的肝癌H22细胞作为实验组，以Adv-EGFP／H22为载体对照组和H22为空白对照组。这些细胞被分批接种到裸鼠肾包膜下，右前肢皮下。用RT-PCR法检测肝癌组织中的VEGF和Ang-2基因的表达；免疫组织化学方法测量肿瘤组织中微血管密度。测量肿瘤大小和重量。比较组间差别，P＜0.05为有显着性差异。结果：1．体外实验表明，纳米金能够与具有肝素结合位点的bFGF结合；抑制VEGF165的信号传导；明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2．裸鼠体内实验发现，用纳米金处理的实验组微血管密度为14.27±1.08，对照组微血管密度为23.52±1.36，实验组微血管密度较对照组明显减少(t=21.694，P＜0.01)。实验组肿瘤体积较小，重量较轻，与对照组比较有显着性差异，P＜0.05。3．在近生理条件下，AFM检测到纳米金与VEGF165、VEGF121作用前后血管内皮细胞超微结构变化。当血管内皮细胞处于增殖状态时，细胞表面出现许多大小约数百纳米的颗粒，细胞膜边缘明显延伸，伪足明显延长。相反地，当血管内皮细胞被纳米金抑制时，细胞表面颗粒大为减少，伪足缩短。4．在AdvmIL-12感染复数为100、感染时间为2小时情况下，重组腺病毒的转染率为96.41％。实验组细胞上清液中检测到IL-12蛋白的表达量为(89.71±22.05)ng．48h~(-1)．10~6 cells~(-1)。AdvmIL-12对H22细胞的生长无抑制作用。5．裸鼠体内实验表明，实验组肝癌组织中IL-12蛋白的表达量明显高于对照组，而实验组VEGF和Ang-2基因的表达弱于对照组。VEGF基因比值分别为：实验组0.8867±0.1924，载体对照组1.1744±0.1189，空白对照组1.1874±0.1752，P＜0.05。Ang-2基因比值分别为：实验组0.7878±0.1471，载体对照组1.0319±0.1574，空白对照组1.0361±0.1536，P＜0.05。实验组肿瘤平均重量、肿瘤体积和肿瘤微血管密度明显少于对照组，差异有显着性。结论：1．体外实验表明，纳米金能够抑制VEGF165的信号传导，明显抑制VEGF165促进血管内皮细胞增殖作用。而纳米金对缺乏肝素结合位点的VEGF121没有抑制作用。2．在裸鼠体内，纳米金通过阻止VEGF165与VEGFR-2结合，抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长。3．AFM探测结果表明，纳米金抑制了VEGF165促血管内皮细胞增殖的作用。4．AdvmIL-12高效感染H22细胞，对体外培养H22细胞的生长无抑制作用。5．在缺乏T细胞的裸鼠体内，IL-12通过抑制肝癌组织中VEGF和Ang-2基因的表达，并抑制血管内皮细胞增殖，发挥其抑制H22肝癌血管生成和肝癌生长的作用。本实验结果将有助于肝癌及其他实体肿瘤的抗血管生成治疗。
参考文献：
[1]. 鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达[J]. 陈玮, 邵传森, 沈建根, 鲍建芳, 潘建平. 浙江大学学报(医学版). 2002
[2]. mIL-12双亚基共表达质粒的构建及在体内外的表达[D]. 陈玮. 浙江大学. 2001
[3]. 转染IL-12的骨髓间充质干细胞治疗胶质瘤的研究[D]. 李菁华. 吉林大学. 2006
[4]. 纳米金或IL-12抑制血管内皮细胞增殖和H22肝癌血管生成的研究[D]. 潘运龙. 暨南大学. 2007