关键词：磷酸化；Ⅱ型糖尿病；蛋白质组学；定量标记；能量代谢
Abstract：Phosphorylation is one of the most widely studied post-translational modifications of proteins. It regulates many biological processes through cell signal transduction and regulation of gene expression.The protein with abnormal phosphorylation may lead to disease directly. In this study, we constructed type II diabetic mouse model by feeding leptin receptor-deficient mice with high fat. Aiming to compare phosphoproteome differences between normal and diabetic mice，we extracted and trypsin digested liver proteins，dimethyl labeled peptides， enriched and fractionationed phosphopeptides, and detected by mass spectrometry. Overall，we identified 214 phosphoproteins and 356 non-redundant phosphosites. With further analysis， we found that in the development of diabetes in C57BL/6 mice, some proteins involved in energy metabolism have undergone phosphorylation differences, suggesting that these pathway changes may be associated with the development of diabetic disease in mice.
Key words：Phosphorylation；type II diabetes；proteomics；quantitative labeling；energy metabolism
0前言
高等动物体内，绝大多数的蛋白质功能是受翻译后修饰调节的[1]，而磷酸化是目前研究最为广泛的一种修饰。在哺乳动物的生命周期中约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰，磷酸化修饰是在蛋白激酶的作用下完成的，而许多激酶本身的活性也是通过磷酸化激活的[2]，激酶活化后启动磷酸化级联反应，通过细胞信号转导、调节基因表达来调控着生物体的生长、发育等众多生物学进程，异常的蛋白磷酸化可能会直接导致疾病的产生，例如免疫缺陷等等[3]。本研究通过比较正常小鼠与糖尿病模型小鼠肝脏蛋白的磷酸化变化，有助于找出在糖尿病的产生发展过程中，参与相关信号通路的蛋白表达水平变化或者修饰水平变化，以及通路蛋白的相互作用。糖尿病是由遗传以及环境因素共同作用引起的一种常见病，根据发病机制不同可以分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病是由于胰岛素分泌不足或者不分泌导致的葡萄糖代谢途径受阻；Ⅱ型糖尿病则是由于胰岛素抵抗即对胰岛素不敏感造成，95%以上的糖尿病患者都属于此型。糖尿病会诱发一系列并发症，例如心血管疾病、糖尿病足病、肾病、视网膜病变和神经细胞病变等等。高血糖是产生这些组织损伤的直接原因。高血糖会使机体的每个组织的各个细胞都浸浴其中，但并不会每种组织都发生损伤病变，这是因为有些组织能够降低葡萄糖的转运率，保持细胞内稳定的葡萄糖含量。这也提示了糖尿病诱发的组织病变是发生在细胞内而非胞外[4]。近年来，蛋白质组学飞速发展，兴起了运用蛋白质组学方法研究糖尿病及其并发症的热潮，例如对糖尿病足细胞[5]、胰岛细胞[6]和视网膜细胞[7]的蛋白质组学研究等。也有对糖尿病原位组织的研究，例如Deng等通过研究糖尿病小鼠肝脏线粒体的磷酸化和羟基化蛋白质组学，发现与正常小鼠相比，糖尿病小鼠中与能量代谢相关的生命活动频率增加，例如三羧酸循环、氧化磷酸化、β-氧化等等，提示小鼠肝细胞可能是通过增强能量代谢来应对机体的这种高血糖压力[8]。本研究通过高脂喂养瘦素蛋白受体缺陷小鼠（C57BL/6）三个月,建立Ⅱ型糖尿病小鼠（db/db mouse）模型，提取正常小鼠与Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏组织，进行比较磷酸化蛋白质组学研究。机体组织内虽然可能含有不同类型的细胞，但相比体外培养的细胞系而言，对于这些原位组织的研究更能反映在某个时序下细胞内的生理状态[9]。本研究就是基于此，采用 “自下而上”蛋白质组学，高通量、系统性的分析小鼠肝脏组织在糖尿病前后的蛋白磷酸化差异，并探索这些差异蛋白在糖尿病的发生发展过程所经历的信号通路变化，揭示胰岛素信号通路、糖脂代谢通路、氧化应激信号通路变化以及它们之间的联系。对于这些差异蛋白的分析可以为糖尿病及其并发症的产生机制提供一定的参考依据。
1 材料与方法
试验样本为正常小鼠和糖尿病模型小鼠。正常小鼠为C57BL/6小鼠，购买自中南大学湘雅二医院代谢综合征研究中心；糖尿病模型小鼠为LepR-/- C57BL/6小鼠，购买自南京大学动物研究中心。
1.1 肝脏组织全蛋白提取
将肝脏组织剪碎，加入1ml预冷的PBS缓冲液，4℃离心5min。将洗涤后的组织迅速转移至玻璃匀浆器，按100mg/4ml加入组织裂解缓冲液，上下研磨20~30次后将匀浆液均等转移至1.5ml干净离心管中。4℃裂解30min，离心30min，收集各管上清液（即组织裂解液）转移至50ml干净离心管中。取匀浆液1ul经稀释后，通过Bradford法测定蛋白浓度。
1.2酶解
测定浓度后，将大约含15mg蛋白的裂解液转移至干净的50ml离心管中，加入三倍体积50%乙醇、50%丙酮和0.1%乙酸，混匀后沉淀1~2h，离心20min，去上清后风干沉淀。加入DTT，40℃还原30min。冷却至室温，加入Iodoacetamide，反应30min。 Bradford法测定蛋白浓度。加入去离子水稀释蛋白溶液，加入胰酶，37℃酶解过夜。
1.3 双甲基化定量标记
酶解后的肽段利用Sep-Pak C18反相色谱柱脱盐，真空抽干，加入0.5ml 1M NaAc，吹打混匀，充分溶解。加入80ul 4%HCHO标记对照组肽段，80ul 4%DCDO标记实验组肽段，标记约30min。分别向实验组和对照组的标记溶液中加入10ul 1%NH3?H2O，而后加入80ul 5%FA以终止标记反应。
1.4 磷酸化多肽富集
定量标记的肽段进行真空冻干，加入0.5% acetic acid溶解样品，振荡混匀，待样品充分溶解，13200rpm离心5min,上清液准备Fe3+ -IMAC色谱柱富集。将50ul上清液缓慢加入Fe 3+ -IMAC色谱柱中，洗涤：加入80ul 0.1M NaCl/ 0.1% acetic acid / 25% ACN洗涤，加入 40ul 1% acetic acid洗涤，加入20ul ddH2O再次洗涤。洗脱：加入120ul 6% NH4OH洗脱层析柱吸附的磷酸化肽，收集洗脱液。离心5min，转移上清至1.5ml干净离心管中。
1.5 亲水相互作用色谱分离磷酸化肽
富集后磷酸化肽真空冻干，加入100ul 1% phosphoric acid，充分溶解真空冻干。加入20ul去离子水，缓慢加入80ul 100% ACN，吹打混匀。打开高效液相色谱仪Agilent 1200 HPLC，手动进样器联入亲水相互作用层析柱TSK-GEL Amide-80（2mm ID × 15cm，5μm particle size），进行60min梯度洗脱后手动加入200ul Buffer A溶液，作为空白对照。将准备好的样品手动加入层析柱，梯度洗脱并收集各个组分洗脱液，分别真空冻干。
1.6 质谱检测
采用串联质谱分析（qTOF），将QSTAR ELITE（AppliedBiosystems）质谱仪串联在线Tempo nano MDLC（Eksigent）液相色谱进行质谱检测。一级质谱扫描范围400~1800 amu，而后紧跟5个二级质谱分析。二级质谱质量偏差设置为50 mDa，90秒内排除相同M/Z离子。
1.7 质谱数据分析
将检测数据进行搜库，采用两种数据搜索软件：ProteinPilot 3.0和MASCOT Daemon（version 2.2.2），本实验中两者均采用SwissProt鼠源数据库。搜库后的数据以dat文件格式被导入Scaffold中进行进一步整合、分析，可根据分析需要将相应的分析结果以Microsoft Excel形式输出。打开DAVID网站行相应分析。打开STRING网站进行相应分析。
2 结果
2.1 Fe3+-IMAC 富集磷酸化肽效率测定
Fe3+-IMAC 富集磷酸化肽是磷酸化蛋白质组学研究中很关键的一步，因此对于Fe3+-NTA富集柱的制备、富集前样品的准备、上样洗涤洗脱条件的选择等都有严格的要求，操作过程要求严谨细致。本实验先采用预实验进行磷酸化肽段富集效率测试，提取小鼠肝脏全蛋白，以5mg蛋白为起始量进行富集，取1/3富集的磷酸化肽（约1ug）进行质谱检测，若效率达到70%以上则可进行后续正式样品实验。下图为此次磷酸化肽段富集效率图。
图2.1 IMAC富集磷酸化肽效果图
经过Protein Pilot3.0搜库后，共鉴定出148个多肽，其中含有142个磷酸化多肽，富集效率为96%，已达到富集标准效率，可进行后续正式样品实验。
2.2质谱检测数据分析
将富集的磷酸化肽段经分离后导入液质联用系统，通过质谱分析后，原始数据经过MASCOT Daemon提交给MASCOT和Distiller进行定性定量分析。表2.1为试验所鉴定出的蛋白情况。
表2.1 糖尿病模型小鼠的磷酸化蛋白质组数据
2.3 定性蛋白质组数据分析
经过Scaffold进一步分析处理，如表3.1所述，试验用轻同位素双甲基化标记对照组，重同位素双甲基化标记实验组，共鉴定出891个蛋白，1298个多肽，其中751个为翻译后修饰（PTMs）蛋白，包括623个磷酸化蛋白，1033个磷酸化位点；本次试验所鉴定出磷酸蛋白涵盖了小鼠肝脏细胞的各个部分，包括胞外组分、质膜、胞浆、亚细胞器膜、线粒体、内质网以及细胞核等等。这些高通量的磷酸化蛋白质组数据揭示了细胞内众多的生物学进程，例如细胞分裂、分化和凋亡，蛋白合成、修饰以及转运，机体免疫和应激反应等等。
图2.2 磷酸化蛋白所在的细胞组分
2.4 定量蛋白质组数据分析
将具有定量信息的磷酸化蛋白质组数据分别进行整合去冗余，共鉴定出475个非冗余磷酸化位点，我们定义H/L Ratio≥2（H表示重同位素双甲基化标记，L表示轻同位素双甲基化标记）的磷酸化位点为上调变化，H/L Ratio≤0.5的磷酸化位点为下调变化，按此标准，本次实验共鉴定出98个上调磷酸化位点和41个下调位点。将这些有定量信息的蛋白导入STRING网站进行全蛋白相互作用网络分析，找到了214个有定量信息的磷酸化蛋白之间潜在的相互作用，我们将提取几个密集型相互作用子网络进行具体分析。糖尿病模型小鼠在病变过程中，参与蛋白翻译的一些调节因子例如Eif4g1， Rps等都发生了磷酸化级联反应，调节着蛋白合成，其中黑色箭头标注的Rps3（ribosomal protein S3）发生了磷酸化下调变化。如图2.3所示。
图2.3 参与翻译磷酸化蛋白相互作用网络图
图中黑色箭头标注表示该蛋白的磷酸化下调变化。
mRNA metabolic process包括mRNA剪接与转运出核，参与此生物进程的蛋白主要有Srrm1，Ptbp2，Rbm25，Ybx1等，其中红色箭头标注的Rbmxrt即为Rbm25(RNA-binding protein 25)是一种可变剪接调节子,参与细胞凋亡抑制因子BCL2L1的可变剪接，调节细胞凋亡进程，它的上调变化可能会降低BCL2L1的mRNA含量，进而加速细胞凋亡。而黑色箭头标注的Ybx1（Nuclease-sensitive element-binding protein 1）参与众多的生物学过程，例如基因转录和蛋白合成等，而在mRNA metabolic process中参与调节mRNA可变剪接的剪接位点选择以及mRNA转运出核后的稳定性，它的下调变化提示mRNA出核后稳定性可能会减弱。下图为这些磷酸化蛋白相互作用网络图。
图2.4参与mRNA metabolic process磷酸化蛋白相互作用网络图
图中红色、黑色箭头标注分别表示该蛋白的磷酸化上调、下调变化。
这些网络图揭示了不同生物学进程中磷酸化蛋白之间潜在的相互作用，显示信息量较大，为了得到更明确的蛋白磷酸化差异变化信息，我们将数据导入DAVID网站，作进一步分析。从表2.2可以发现，在Ⅱ型糖尿病的发生发展过程中，蛋白磷酸化变化主要发生在蛋白转运、糖脂代谢、氨基酸代谢、氧化还原酶类代谢、细胞凋亡以及这些代谢通路的调节通路上，且磷酸化主要发生上行性变化。提示糖尿病模型小鼠肝脏组织的病发可能与这些代谢通路的变化存在着联系。
表2.2 可能参与糖尿病病发过程的磷酸化蛋白生物学功能分类
在这些上行性变化的磷酸化蛋白中， Aldob（Fructose-bisphosphate aldolase B）和3-磷酸甘油醛脱氢酶Gapdh(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是糖酵解途径中的催化酶类，它们均发生磷酸化上调变化。葡萄糖在胞质中被酵解最终生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系催化下形成乙酰辅酶A，而柠檬酸合成酶Acly（ATP-citrate synthase）是乙酰辅酶A进行三羧酸循环的第一个限速酶，催化乙酰辅酶-A合成为柠檬酸，它的上行性变化提示三羧酸循环增强。乙酰辅酶A羧化酶Acaca（Acetyl-CoA carboxylase 1）是脂肪酸合成的第一个限速酶，在AMPK作用下被磷酸化进而作用于乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A，参与脂肪合成代谢调节。这些关键酶蛋白在试验中均发生上调变化，推测在C57BL/6小鼠的糖尿病发生发展与这些蛋白可能存在着某种联系，有待进一步验证。
3 讨论与小结
在磷酸化肽段制备过程中，由于磷酸化蛋白丰度低、信号常处于封闭状态，不易被质谱检测到。因此，进行质谱检测前需进行磷酸化蛋白或多肽的富集。目前常用的富集策略有免疫共沉淀分离、固相金属离子色谱（IMAC）分离、二氧化钛（TiO2）分离等。本试验采用Fe3+-IMAC分离法，Fe3+与亚氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）有很强的结合力，可利用此特性来制备分离磷酸化蛋白的固相金属离子色谱柱[10]。固相金属离子色谱（immobilized metal ion affinity Chromatography, IMAC）基本原理是固定于色谱柱上带正电荷的金属离子，常为Fe3+、Ga3+，与磷酸化肽上的带负电荷的磷酸基团结合，从而将磷酸化蛋白或肽段螯合在色谱柱上，再利用碱性缓冲液将磷酸肽洗脱下来。IMAC优点主要表现在其性价比高，操作简单，洗脱产物可直接用于质谱分析，已被广泛运用于磷酸化多肽的富集。缺点在于一些酸性多肽也可非特异性结合于色谱柱上造成干扰，并且还存在着多磷酸化肽段与柱子结合过紧密造成洗脱困难的问题，因此可通过改变吸附、洗涤、解吸附的操作条件对这些问题进行改善[11,12]。
从糖尿病模型小鼠肝脏的磷酸化蛋白定性研究可以表明，绝大多数蛋白质进行了翻译后修饰来行使功能，其中磷酸化修饰最为广泛。鉴定出的蛋白质涵盖了肝脏细胞的各个部分，参与了众多生物学进程，这也表明高通量、系统性的分析小鼠肝脏组织在糖尿病前后的蛋白磷酸化差异的可行性。因此，对这些数据进行定量分析，在Ⅱ型糖尿病的发生发展过程中，蛋白磷酸化变化主要发生在糖脂代谢、氨基酸代谢、氧化还原酶类代谢以及这些代谢通路的调节通路上，且磷酸化主要发生上行性变化。在糖脂代谢通路中，三羧酸循环不仅是糖、脂、蛋白质等生物大分子的最终分解获能途径，也是它们相互联系的结点，研究结果表明，柠檬酸合成酶Acly（ATP-citrate synthase）发生了磷酸化上调变化，它是三羧酸循环的第一个限速酶，催化乙酰辅酶-A合成为柠檬酸，它的上行性变化提示在小鼠糖尿病发生过程中，机体可能是通过增强能量代谢来应对高血糖压力。而持续增强的能量代谢，势必会产生过多的活性氧簇ROS（reactive oxygen species），正常情况下，ROS会被细胞内或细胞外的抗氧化系统清除，但在高血糖环境下，由于线粒体的代谢紊乱导致ROS过量，并与脂质，蛋白或DNA分子结合，从而引起一些通路变化，引起氧化应激反应。研究结果发现，Pex1也发生了上行性变化，它是合成过氧化物酶体的必需因子，而过氧化物酶体是β-氧化和脂肪酸合成等脂类代谢的主要场所[13]，Pex1可以参与蛋白质转运入过氧化物酶体，当细胞内氧浓度过高时，线粒体可能会因为产生过多的ROS而功能失调，但过氧化物酶体却因为氧浓度的增高而增大氧化活性，可使细胞免受高浓度氧的的毒性作用，因此，Pex1发生蛋白磷酸化上调变化可能有助于缓解机体持续高氧浓度压力[14,15]。这些能量代谢过程都是由胰岛素信号通路调控的，乙酰辅酶A羧化酶Acaca（Acetyl-CoA carboxylase 1）是脂肪酸合成的第一个限速酶，在胰岛素信号通路中，受AMPK激活被磷酸化进而作用于乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A，参与脂肪合成代谢调节，在糖尿病发生过程中均发生了上行性变化。
综上所述，通过构建糖尿病小鼠模型，采用稳定同位素双甲基化标记原位肝脏组织，经过 Fe3+-IMAC富集并分离的磷酸化肽被导入质谱检测，进行定性定量鉴定。通过比对实验组与对照组的肝脏磷酸化蛋白质组，最终确定了在LepR-/-（C57BL/6背景）小鼠糖尿病病发过程中的214个磷酸化蛋白以及356个磷酸化位点。利用Gene Ontology，String以及KEGG pathway等生物信息学手段对这些数据做进一步处理，对一些发生较明显变化的蛋白磷酸化位点进行分析，解析这些位点所调节的生物学功能以及参与的信号通路，找倒了一些参与胰岛素信号通路和糖脂代谢通路的差异蛋白，同时，其他的一些发生变化的磷酸化蛋白也有可能在胰岛素和糖脂代谢通路或其他的信号通路中发挥重要的功能，有待进一步探索。
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论文作者:汪茗
论文发表刊物:《中国医学人文》2019年11期
论文发表时间:2019/12/4
标签：磷酸化论文; 蛋白论文; 小鼠论文; 糖尿病论文; 蛋白质论文; 肝脏论文; 辅酶论文; 《中国医学人文》2019年11期论文;