张建云[1]2004年在《α-淀粉酶原因的体外定向进化研究》文中提出α–淀粉酶是最重要的一类工业酶类之一，它在淀粉加工、酿酒、乙醇生产、纺织和其它工业部门上都有广泛的应用，并且也是酶学研究中最活跃的领域。本研究采用5-溴脱氧尿苷叁磷酸（5-BrdUTP）部分取代脱氧胸苷叁磷酸(dTTP)，对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变。本试验采用基因体外定向进化策略中PCR基因诱变技术，使用碱基类似物5-溴脱氧尿苷叁磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Taq聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，突变库的筛选用锥虫蓝淀粉（LBSP）鉴别培养基。经过多轮诱变，得到五个具有高酶活的诱变基因，并在Genebank上注册，序列号为AY645667,AY645668,AY645669,AY645670,AY645671。利用生物学软件DNAman和出发基因序列进行比较，分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果表明突变多发生在第300-360个氨基酸之间（即在保守区4区以及其下游区域）。这说明酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的，而不是由启动子的变化引起的。进一步的分析还发现：5-BrdUTP不仅能够代替T掺入DNA产生A.T—G.C的转换，代替C掺入DNA产生G.C—A.T的转换，而且也能够产生颠换。碱基类似物掺入诱变简便，快捷，成为基因体外定向进化的又一新策略。本试验的工作进一步验证了这一方法的可行性，并为研究α-淀粉酶基因突变位点和酶功能的关系提供了材料，从而为进一步研究α-淀粉酶基因进化过程打下了基础。
柯涛[2]2003年在《α-淀粉酶基因体外定向进化的研究》文中进行了进一步梳理引导蛋白质功能进化常用的方法是模拟和加速蛋白质基因自然重组的进程，即在蛋白质的基因中引进随机突变。因此，蛋白质基因体外随机突变的方法影响着引导蛋白质功能进化的效果。本研究采用5-溴脱氧尿苷叁磷酸(5-BdU)部分取代脱氧胸苷叁磷酸(dTTP)，在PCR的过程中对克隆的野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变，诱变结果表明：5-BdU浓度越高，诱变越强；浓度越低，诱变越弱。当5-BdU浓度为dTTP的0.1％时，可以得到最多的正诱变结果。本研究用LBSP鉴别培养基直接筛选技术，仅一个循环就获得了大量无酶活的重组质粒和酶活提高了20倍的突变基因。进行第二个循环后筛选得到酶活提高40倍的突变基因。分别挑选出无酶功能的、酶活是野生型基因1/4的、和酶活是野生型的40倍的叁个突变基因和野生型基因进行测序和同源性分析，结果显示：此淀粉酶基因的DNA序列全长1808bp，由DNA推测的α-淀粉酶前体蛋白由475个氨基酸组成，前体α-淀粉酶的N-端为信号肽序列，长度为35个氨基酸，具有典型的信号肽序列的特征。与嗜水气单胞菌(Aeomonas hydrophila)的α-淀粉酶氨基酸序列有70％同源性。叁个突变基因的突变位点共13个，转换、颠换、添加和缺失四种突变类型都有。其中，无酶功能基因突变位点最多，导致全长编码区内5个氨基酸突变，低酶活和高酶活基因各两个突变位点。其中低酶活基因编码区内一突变位点导致氨基酸序列的提前终止。高酶活编码区位点突变导致C-端序列变化和终止子的后移 本诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题，为基因的诱变找到了一条新途经。
柯涛[3]2006年在《α-淀粉酶的分子定向进化及其突变体结构与功能研究》文中提出近年来,定向进化技术的迅猛发展,给基因工程带来新的革命,由于其中最重要的一步必须有极大多样性的突变体库的建立,使核苷酸类似物这一研究工具在这一新生领域中又发挥了不可缺少的重要作用。本课题从核苷酸类似物这一独特的视角出发,首次应用核苷酸类似物5-BrdUTP作为PCR体外随机突变的诱变剂的方法,在原有的实验基础上,对核苷酸类似物5-BrdUTP的突变机理进行了进一步的探讨和研究。5-BrdUTP在体外可以代替dTTP,并可低效率的代替dCTP,与腺嘌呤和鸟嘌呤的错配,造成突变。实验结果表明,5-BrdUTP可以产生12种可能的单碱基替换突变类型中的8种(A:T, A:G, A:C, T:C, G:A, G:C, C:A, C:T)。包括4种转换类型和4种颠换类型。主要突变类型为A:T→G:C (72.9%)。同时还包括碱基插入和缺失突变类型,其中还包括大片段的缺失。本文报道的关于5-BrdUTP致突变的新结论主要为以下几点:(1)以野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)野生型淀粉酶基因为模板的体外突变中存在突变热点;(2)突变频率可以通过改变5-BrdUTP加入PCR反应体系中的浓度来控制;(3) 5-BrdUTP突变谱有一定的偏倚性,但产生的突变类型多样,其中即包括转换,也包括颠换。因此本诱变方法是一种有效的构建多样性的突变体库的方法。从上述方法构建的α-淀粉酶基因突变体库中筛选到一个截短突变体酶Xa-S2。从Xa-S2基因DNA序列推导的氨基酸序列有167个残基,只有野生型α-淀粉酶Xa-WT(475个残基)大小的35%,二级结构预测的结果显示Xa-S2无法折迭成完整的(β/α)8桶状催化结构域,并且失去了野生型淀粉酶的3个催化活性位点,但仍然具有淀粉酶的水解活性。将Xa-S2和野生型淀粉酶基因分别构建到大肠杆菌表达载体pET30a(+),得到重组质粒pXAS2和pXAWT,并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),用IPTG诱导表达,得到纯化的Xa-S2和Xa-WT蛋白后,对两个酶的酶学性质进行了研究。结果表明Xa-S2的Km值为32 mg/mL,最适pH为6.2,最适反应温度为30℃。而野生型酶Xa-WT的Km值为8 mg/mL,最适反应pH范围为5.9~6.2,最适温度范围为45~50℃。高效液相色谱(HPLC)分析其对淀粉的最终水解产物类型均包含葡萄糖和麦芽糖,并以葡萄糖为主。但Xa-S2与Xa-WT相比,在保留时间为8.0min位置多出一个产物峰。预示着两种酶作用于底物的方式有所不同。二级结构和叁级结构预测的结果表明,野生型淀粉酶具有完整、典型的淀粉酶13家族的(β/α)8桶状催化结构域,3个催化残基和4个典型保守区域,而Xa-S2只包含桶状结构的部分结构单元,即N-端的βαβαβ单元。因此,Xa-S2为首次发现的只包含小于半桶状结构的结构单元组成的有酶活性的蛋白,这对于(β/α)8桶状结构家族的结构与进化关系的研究意义重大。将黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖淀粉酶GA-I的SBD结构域序列与野生型淀粉酶基因用PCR的方法融合,得到融合酶基因XAGsbd,构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K,得到重组质粒pPICXAGsbd,转化毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115后,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的重组菌株GS115(XAGsbd),对获得的融合蛋白进行酶学性质研究和生淀粉水解能力的研究结果表明,其最适反应条件分别为pH5.9~6.2和45~50℃,水解生淀粉的速率可以最高达到21% (30h)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明融合蛋白被高度糖基化。用生淀粉吸附的纯化方法纯化后,并用2%β-环糊精溶液洗脱可得到纯化的蛋白。将一个编码的淀粉酶活性提高的突变基因,克隆到由rDNA序列介导的酵母整合型表达载体pHBM368上,得到重组质粒pHBM368XA,转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScI后,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的酵母重组菌株S.cerevisiae INVScIXA01。对选择的3个工程菌α-淀粉酶表达的稳定性进行了检测,结果表明在完全培养基中连续培养80代,淀粉酶的酶活性仍然保持稳定。在淀粉酶自身信号肽引导下,胞外分泌效率可达50%。
王宇凡[4]2012年在《红色亚栖热菌海藻糖合酶结构与功能的关系及定向进化的研究》文中进行了进一步梳理海藻糖是一种应用广泛的非还原性双糖，在医学、化妆品行业、制药学、食品加工业以及农业等领域都有十分诱人的应用前景。而利用酶法制备海藻糖是现今生产海藻糖的主要手段。在可制备海藻糖的各种酶类中，海藻糖合酶可以利用麦芽糖为底物通过一步反应生产海藻糖，整个过程简单可控，原料成本低廉，因此引起了人们越来越多的关注。然而目前天然的海藻糖合酶其结构与功能之间的关系还未被人们所了解，并且存在着催化效率较低，反应产生的副产物葡萄糖较多等问题，所以急需对该酶的结构功能进行研究，并且建立适合于海藻糖合酶定向进化的方法，对该酶进行改造。我们前期已经克隆得到来源于红色亚栖热菌的海藻糖合酶基因，并成功地将其在大肠杆菌中进行异源表达。该酶具有良好的嗜热性以及稳定性，因此具有工业应用潜力。但是如果将该酶直接用于工业生产，那么它的活性还不是很高，有进一步提升的空间。同时对该酶的结构、作用机理以及热稳定性机制也还不清楚，有必要进行研究，为进一步提升酶的催化效率或热稳定性提供理论依据。在本研究中，首先构建了红色亚栖热菌N端缺失突变子与C端缺失突变子两种缺失突变蛋白。通过对二者活性及二级结构分析发现，仅含C端结构域的蛋白与全长蛋白的二级结构相似，均为α/β型，这也是α淀粉酶家族的典型结构。、缺失C端而仅含有N端结构域的蛋白二级结构发生了变化，说明红色亚栖热菌海藻糖合酶的C端区域对维持蛋白结构稳定性有重要作用。通过构建一系列长度递减的C端片段缺失蛋白，我们发现C端缺失44个氨基酸后，蛋白依然具有活性，而且最适反应温度依然保持在50℃，但在60℃保温1h后残余酶活低于全长蛋白，说明红色亚栖热菌海藻糖合酶的C端能够影响蛋白的热稳定性。而C端缺失44个氨基酸的截短蛋白对底物选择性也发生了改变，它对麦芽糖的亲和力更高，说明红色亚栖热菌海藻糖合酶C端结构域可能对酶与底物的结合有影响。而当C端缺失68个或者更多氨基酸残基时，异源表达的蛋白无法正确折迭为可溶性蛋白，即使经过蛋白质复性后依然没有活性，说明从C末端第68个氨基酸开始的C端片段能够影响蛋白结构与功能。其次，构建了红色亚栖热菌海藻糖合酶与嗜热栖热菌海藻糖合酶C端与N端互换的杂合蛋白TSTtMr与TSMrTt。通过对两种杂合蛋白的表达纯化，测定酶学动力学常数以及温度耐受性等酶学性质，发现拥有相同N端结构域的蛋白，其酶学动力学常数也大致相似，而且有相同的最适反应温度与类似的温度耐受性，说明海藻糖合酶的N端结构域与催化活性密切相关，同时影响酶的嗜热性和热稳定性。而杂合蛋白TSTtMr与麦芽糖的亲和能力较红色亚栖热菌海藻糖合酶有所提高，而能够反映催化效率的kcat/Km值是红色亚栖热菌海藻糖合酶的2倍，说明该杂合蛋白催化效率更高。第叁，为了研究影响红色亚栖热菌海藻糖合酶活性与热稳定性的具体区域或位点，本研究对该酶的叁维结构进行模拟，并对预测得到的关键位点进行定点突变研究。通过Swiss-Model同源建模，发现红色亚栖热菌海藻糖合酶N端第3位-第543位氨基酸残基属于α淀粉酶家族成员，拥有类似于β/α的结构，该模拟结构中含有一个“口袋”区域，其中含有4个α淀粉酶家族保守区及关键氨基酸残基。通过定点突变，能够确定位于保守区中的H104、D200以及第叁保守区对海藻糖合酶的活性起至关重要的作用，当将这些关键位点突变后，蛋白彻底失去活性。此外，位于口袋结构中的Y135、R388、R392位点也影响蛋白的功能，将它们突变为丙氨酸后，蛋白发生了活性丧失或下降。R392A的突变还会影响蛋白的嗜热性，使其在50℃失活，而在30℃具有活性，但与野生型蛋白相比，催化能力大大降低。说明R392位点或附近相关区域能够影响蛋白活性及嗜热性。第四，对红色亚栖热菌海藻糖合酶的定向进化进行了研究。确立了利用甲苯透性化细胞制备粗酶，经过DNS反应后在570nm处测定吸光度，以检验红色亚栖热菌海藻糖合酶活性高低的高通量筛选方法。运用易错PCR以及分段DNA改组法对红色亚栖热菌海藻糖合酶进行定向进化的初步研究，经过一轮易错PCR和一轮分段DNA改组筛选得到一株粗酶活力为野生型红色亚栖热菌海藻糖合酶1.6倍的突变株，该突变子共发生了6个氨基酸位点的突变。将突变蛋白纯化后，研究该酶的催化动力学常数，发现其对麦芽糖为底物时的Km值约是野生型的一半，表示突变子对底物的亲和能力提高了一倍，而突变子的kcat/Km值是野生型的2倍，说明该突变子的催化效率则是野生型的2倍。
杨娟[5]2007年在《胰α-淀粉酶的部分性质研究》文中研究说明本文对胰α-淀粉酶(E．C．3．2．1．1)的相关生物化学性质进行了初步研究。选用Mn~(2+)、Cd~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Pb~(2+)五种金属离子作用于胰α-淀粉酶，发现Pb~(2+)、Cd~(2+)、Ca~(2+)在2～10umol／L浓度范围能提高胰α-淀粉酶的活性，但当浓度超过9umol／L或10umol／L时，酶活急剧下降，表现为明显的抑制作用。对酶活抑制作用大小是：Pb~(2+)＞Cd~(2+)，但随着浓度的增大，Cd~(2+)对酶活性的抑制作用有增高的趋势。而Ca~(2+)在0～50umol／L浓度范围内，随着浓度的增加，酶活性逐渐提高，未发现抑制现象。Mn~(2+)、Co~(2+)对酶活抑制作用大小是：Mn~(2+)>Co~(2+)，Mn~(2+)的抑制程度最高可以达到80％，而Co~(2+)在相同浓度条件下仅抑制31.2％。研究Mn~(2+)、Cd~(2+)、Co~(2+)、Pb~(2+)对酶的紫外差光谱、荧光光谱的影响，结果表明：经这四种金属离子处理后酶的紫外差光谱均在230nm、270 nm左右处出现吸收峰，随着金属离子浓度的增加，峰值不断增大，表明酶肽链发生变化，酶分子由有序结构变成无规则卷曲。用278nm波长激发时，天然酶内源荧光在342nm处有特征荧光发射峰。Mn~(2+)、Cd~(2+)、Co~(2+)、Pb~(2+)引起酶荧光发射峰强度不同程度的降低，最大发射波长不变，说明这些金属离子对酶构象有不同程度的影响。用278nm波长激发所得的342nm处的特征荧光发射峰，是包埋于蛋白质内部Trp残基暴露后增强了荧光发射峰，酪氨酸残基的贡献很小。实验中的四种金属离子均使荧光强度不同程度的下降，其原因可能是由于金属离子的加入微扰了酶的活性部位，使其局部构象变化所致。选用芦丁研究其对胰a-淀粉酶的作用，结果显示芦丁对胰a-淀粉酶表现出非竞争性抑制特性。采用紫外光谱法和荧光光谱法研究了芦丁和胰a-淀粉酶的相互作用．在生理pH6.9条件下芦丁使胰胰a-淀粉酶的紫外吸收峰增强，特征荧光峰淬灭．并求得药物与胰a-淀粉酶作用的形成常数为0.44×10~5．研究了一些多羟基化合物黄原胶、甘油、蔗糖、硫酸软骨素在不同浓度、不同时间条件下对酶热稳定性的影响，筛选出最佳浓度为0.2％的黄原胶、2％的蔗糖、2％的硫酸软骨素、4％的甘油，其保护作用强弱顺序依次为：硫酸软骨素＞蔗糖＞甘油＞黄原胶。通过对部分失活对照酶和添加保护剂酶的紫外光谱和荧光光谱的研究，对照酶液的紫外吸收和荧光发射光谱都大于加保护剂酶液，这表明稳定剂的加入能阻止或减弱胰a—淀粉酶在一定程度热失活过程中立体构象的变化，使胰a—淀粉酶较好的维持天然酶的结构而发挥作用。同时也说明胰a—淀粉酶在热变性过程中其分子肽链是逐步伸展的。
曹昊[6]2013年在《多功能淀粉酶OPMA-N功能集成性的机制研究》文中研究表明糖苷水解酶家族13是一类专门作用于α糖苷键的酶，也称作α淀粉酶家族，这个家族拥有数量庞大的成员，它们具有不同类型的催化性质，包括α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键的水解和转糖苷活性。其中，糖苷水解酶家族13中的第20亚家族（新普鲁蓝酶亚家族）因为同时具有上述2种或4种催化活性，而被作为多功能淀粉酶成为研究热点。我们之前发现了一株来自于Bacillus sp.ZW2531-1菌株的嗜热多功能淀粉酶，命名为OPMA-N，它可以经水解和转糖苷反应将廉价的淀粉催化生成麦芽糖，麦芽叁糖，异麦芽叁糖和异麦芽四糖，而异麦芽低聚糖作为一种双歧因子具有较高的经济价值和药用价值。近年来，随着对蛋白质结构信息了解的加深，以及计算机软硬件技术的发展，蛋白质的合理设计技术得到了较快发展和应用。结合蛋白质工程手段对蛋白质进行改造，不光有利于得到功能更优的蛋白质（酶），还可以更深入地研究蛋白质结构和功能之间的内在关系。在本文的研究中，我们首先利用同源建模的方法得到了OPMA-N的初始结构模型，然后利用分子力学和分子动力学方法对初始模型进行了优化，多种评估软件证明了OPMA-N模型的合理性。通过对模型的分析，并结合家族基因的同源序列的比对，本文选定了两个重要的氨基酸残基（Trp358，Val328）进行定点突变，并选择了以N端结构域为核心模块的多种重组酶进行结构域重组以及模块组合的研究。本研究首先模拟构建了358位点不同氨基酸的20种3D结构模型，并把它们与底物分子进行对接，结合分子对接结果和氨基酸侧链极性、电荷、位阻等因素，将这些氨基酸分为5类，进而选取了7种突变株进行研究，它们分别是W358K，W358R，W358N，W358T，W358G，W358D，W358E。在利用分子生物学手段构建突变载体，表达纯化得到7种突变株的纯酶之后，我们通过对它们进行性质测定发现，将此位点的W突变成具有正电荷侧链的K和R之后，它们的产物以葡萄糖为主，其比例达到了83.6%和80.2%，同时伴有少量的麦芽糖，而野生型和其它突变性的催化产物是没有葡萄糖的，这个结果说明W358K和W358R已经丧失了绝大多数转糖苷活性，成为了完全的淀粉水解酶。相反，W358N/T，W358D/E的产物中低聚异麦芽糖比例有提高，说明它们的转糖苷活性得到了提高。另外一个比较明显的变化是，W358K/R的酶活力提升了近40%，其Km值较野生型下降，同时kcat值升高，这样的突变提升了酶与底物的亲和力以及酶的催化效率。突变体W358E的酶活力比野生型提高了近一半，而其Km值和kcat值均升高，说明这样的突变在提升酶催化效率的同时却降低了酶与底物的结合能力。W358N/T的活力、动力学数值与野生型相近，而W358G在催化效率上远低于野生型OPMA-N。W358K/R和W358D/E突变体的热稳定性要略好于野生型，可能是这些引入的带电荷且具有一定空间位阻的氨基酸残基增加了此位点与附近氨基酸残基的相互作用，从而增加了酶分子的稳定性。酶分子寡聚化的实验结果显示，不同的突变体，从单体到五聚体的比例也不相同，尤其是单体与二聚体的比例、单体与二聚体之和所占的比例有可能影响着酶分子的催化形式和性质。最后，我们试图通过研究计算机模拟分子对接结果来找到突变酶催化性质变化的分子机理，野生型中W358残基在底物结合口袋+2亚位点处形成了很强的空间位阻，这样的结构导致了OPMA-N水解和转糖苷活性的平衡，而突变体中底物结合的方向和位置都发生了改变，N/T358和D/E358与底物+3和+2位点分别形成了氢键，它们与底物以及E356的相互作用也发生了很大变化。而K/R358与底物以及催化残基E356形成了很强的相互作用网络，G358的突变则丧失了此位点的原有位阻和与周围残基的相互作用。本文选择的另一个重要氨基酸突变靶点是V328，同时根据已有的研究报道，我们想研究一下此位点氨基酸侧链位阻的大小是否决定多功能淀粉酶OPMA-N的催化类型，因此设计了叁种突变体分别是V328I，V328A和V328G。实验结果显示，此位点处过大的侧链I和过小的侧链G都会显着降低催化活性。而当V突变成大侧链的I后，产物中异麦芽低聚糖的含量明显下降，而反之V328A和V328G中其含量略有升高。另外一个比较显着的变化是，将V突变成A之后，此酶对β-CD有了一定的催化活性，产物以麦芽糖和麦芽叁糖居多。此位点突变对酶的pH、温度性质影响不大，而对酶分子的寡聚化程度有影响。分子对接结果显示，此位点对邻近的N330、受体糖结合位点E331及催化残基D327的位置和取向有一定影响，尤其是V328A突变体中N330与底物+2亚位点形成两根氢键，明显将底物拉向受体糖结合口袋方向，或许这就是它底物特异性和产物比例变化的原因。另一方面，本文围绕新普鲁兰酶亚家族的核心N端结构域构建了OPMA-NN、OPMA-TNT、OPMA-NTN克隆，加上原有的OPMA-N和OPMA-NT，我们对不同结构域重组体以及不同模块的等分子数组合进行酶学性质检测发现，它们的产物比例并不发生明显变化。模块组合的活力和组合之前基本差别不大，OPMA-TNT的活力略高于野生型。一个比较明显的结果是，具有两个N端结构域的重组体OPMA-NTN的热稳定性较野生型提高了20℃，结合OPMA-N和OPMA-NT的对比，我们发现N端结构域对酶的热稳定性有着很大贡献。综上，本文通过对多功能淀粉酶OPMA-N关键氨基酸残基的合理性定点突变实验，及以N端结构域为核心的模块重组实验，并结合计算机模拟分子对接结果，在一定程度上揭示了OPMA-N催化功能集成性的机制。同时得到了一些具有工业应用价值和潜力的突变酶如OPMA-N/W358N，OPMA-N/V328A，OPMA-NTN。
温建新[7]2008年在《极端环境微生物叁种功能基因的克隆与表达》文中研究说明极端环境微生物是各种特殊性质酶的重要来源。为寻找各种新的酶资源,本论文从北方高温堆肥分离的枯草芽孢杆菌FS321中克隆了中度耐热脂肪酶、中度耐热α-淀粉酶基因及从嗜碱芽孢杆菌OF4中克隆了α-葡萄糖苷酶基因,并分别实现在大肠杆菌中的表达。上述结果为进一步对这些酶的分子改造提供了新的基因资源,也为深入研究这些酶基因的结构与功能关系奠定了基础。主要研究内容如下:1、FS321产脂肪酶的最适培养基是M4,发酵周期为48～60h,摇瓶发酵温度为37℃,通气量为25mL/250mL锥形瓶。脂肪酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为9.0。为鉴定该菌株,分析该菌的细胞脂肪酸谱,克隆测序了其16SrDNA序列,系统进化树及细胞脂肪酸组分分析均表明FS321是一株Bacillus subtilis。2、利用PCR扩增获得了FS321脂肪酶基因BSL的完整阅读框,BSL全长639bp。进一步构建表达质粒pET-28a-BSL,以E.coli BL21(DE3)为宿主进行表达。SDS-PAGE检测到大小约27.5kDa的重组融合蛋白,叁丁酸甘油酯平板酶活鉴定出现透明圈,表明BSL实现了有效表达。3、用同(2)的方法成功克隆到FS321α-淀粉酶基因(BSA),BSA全长1980bp。并构建了重组质粒pET-28a-BSA,转化E.coli BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE检测出现大小约76.0kDa的重组融合蛋白,可溶性淀粉平板酶活鉴定结果表明BSA实现了有效表达。重组淀粉酶的最适反应温度为50℃和最适反应pH为7.5。4、根据嗜碱芽孢杆菌OF4基因组部分测序结果,发现其有一条基因对应的氨基酸序列与GenBmak中一些芽孢杆菌的α-1,4-葡萄糖苷酶氨基酸序列相似性达60～76%,初步判断其属于α-1,4-葡萄糖苷酶基因,命名为ABPG.。通过PCR扩增获得该基因,把该基因连接在表达质粒pET-28a(+)上,在E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达。利用表达质粒上的His融合标签进行亲和纯化,获得电泳纯融合蛋白,其大小约为68.5 kDa。该酶最适底物为麦芽糖,对其表现的最高比活为164.2U/mg,酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。在pH8.0～pH10.0的缓冲体系中4℃保存12h后,酶的残余酶活为初始酶活的56.4～73.0%。
周亚凤, 张先恩, Anthony, E, G, Cass[8]2002年在《分子酶工程学研究进展》文中认为酶工程的研究已经发展到分子水平 ,通过基因操作 ,已实现了许多酶的克隆和表达。定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段 ,并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率 ,并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。
参考文献：
[1]. α-淀粉酶原因的体外定向进化研究[D]. 张建云. 河南农业大学. 2004
[2]. α-淀粉酶基因体外定向进化的研究[D]. 柯涛. 河南农业大学. 2003
[3]. α-淀粉酶的分子定向进化及其突变体结构与功能研究[D]. 柯涛. 华中科技大学. 2006
[4]. 红色亚栖热菌海藻糖合酶结构与功能的关系及定向进化的研究[D]. 王宇凡. 南开大学. 2012
[5]. 胰α-淀粉酶的部分性质研究[D]. 杨娟. 四川大学. 2007
[6]. 多功能淀粉酶OPMA-N功能集成性的机制研究[D]. 曹昊. 吉林大学. 2013
[7]. 极端环境微生物叁种功能基因的克隆与表达[D]. 温建新. 福建师范大学. 2008
[8]. 分子酶工程学研究进展[J]. 周亚凤, 张先恩, Anthony, E, G, Cass. 生物工程学报. 2002
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