刘宏亮[1]2004年在《激肽释放酶的仿生亲和纯化研究》文中研究说明激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶家族的一员，可水解由精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸形成的肽键。生物体内激肽释放酶分为两类：血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。激肽释放酶在体内可特异性水解血浆或组织中的激肽原(或前激肽)产生缓激肽，后者则与细胞上的缓激肽B1、B2受体结合，释放第二信使cGMP、NO等来激活其他一系列的生理生化反应，如肌肉收缩、血管渗漏、嗜中性粒细胞趋化、疼痛炎症级联反应、血细胞生长等。临床的一些研究发现高血压和糖尿病的发病常伴随着体内激肽释放酶水平的降低，而激肽释放酶水平偏高可能与哮喘、关节炎等的发病有关。 激肽释放酶所具有的多种生理功能，使它成为了一种重要的临床用药。目前主要用于微循坏障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病，周围神经病，视网膜病，眼底病及缺血性脑血管病，以及高血压病的辅助治疗。近年来随着糖尿病患者的增多，对激肽释放酶的需求量也同益增加。市场上现有的激肽释放酶产品主要为猪胰激肽释放酶，也有少量为人尿激肽释放酶。尽管已有实验室报道成功构建了人组织激肽释放酶的真核表达系统和原核表达系统，但由于存在着表达量低、产物活性低等缺点，自今尚未见用作工业生产的报道。而猪胰脏因其具有来源丰富，价格低廉等优点，目前仍是临床用药的主要来源。而当前所用的纯化工艺多为离子交换法或固定化底物(approtinin)亲和层析法，存在着回收率低、使用寿命短等缺点。因此，进行激肽释放酶纯化新二工艺研究具有重要理论意义和经济意义。 本实验是以脱脂的猪胰酶粗粉为原料，根据激肽释放酶的空间结构和其对底物的结合特点，以激肽释放酶的最佳底物——Phe—Arg二肽为模型，设计并合成了六种以叁氮嗪为母核的小分子染料配基来对激肽释放酶进行仿生亲和纯化，并从中筛选出了一种结合力较强，特异性较高的配基——Trp介质。在将上样、沈脱条件优化(pH8，电导为3.5ms上样；pH8.5，电导10ms沈脱)后，单独使用该介质可一步从猪胰丙酮粗粉中纯化出比活性为350KU／mg的激肤释放酶样品，比原样比活提高了290倍，回收率为68%。而将该柱和DEAE一FF一SePharose联用，所得洗脱液中激肤释放酶比活可达1 300KU/mg，比原样(丙酮粗粉)比活提高了1300多倍，回收率达63%。同时进行的介质稳定性实验、吸附容量测定、放大实验也取得了较为理想的结果。本工艺和现有其它工艺相比，具有步骤简单、回收率高、介质寿命长等优点，因此本介质及其工艺具有较强的市场应用前景。
赵佳[2]2008年在《动物源胰激肽释放酶的纯化》文中研究说明激肽释放酶是目前一种重要的临床用药,广泛应用于治疗心脑血管、男性不育、微循环障碍等疾病,受到医药工业的高度重视。用于临床的激肽释放酶药品主要是从猪胰脏中提取的,也有少量为人尿激肽释放酶。从猪胰脏中提取激肽释放酶已经有几十年的历史,但是要寻找得率高、操作简便、操作周期短的分离方法还值得进一步的研究。研究表明,牛胰激肽释放酶也具有降血压,调节血液循环的作用。因此,牛胰激肽释放酶的纯化研究同样具有重要的经济价值以及应用价值。猪胰激肽释放酶的原料为新鲜胰脏,纯化工艺为:新鲜胰脏——丙酮粗提——硫酸铵盐析——层析。实验中分别用了凝胶过滤、疏水层析以及阴离子交换层析叁种方法纯化猪胰激肽释放酶。最后根据纯化效果以及工业应用前景筛选出了一种经济实用的纯化介质—QAE-Sephadex阴离子介质,单独使用该介质可一步纯化出比活为342.5U/mg的激肽释放酶,比丙酮粗粉比活提高了34.52倍,活性回收率为60.8%。牛胰激肽释放酶的原料为盐析后产物,纯化工艺为:透析——层析。实验中分别用了凝胶过滤、疏水层析、阴离子交换层析以及阳离子交换层析四种方法纯化牛胰激肽释放酶。同样,根据纯化效果以及工业应用前景确定了一条较优的生产工艺——将CM-Sepharose CL-6B阳离子柱与Butyl-Sepharose 4FF疏水柱联用。两种介质联用后,可以得到比活为667.0U/mg的牛胰激肽释放酶,比粗粉比活提高了8.52倍,回收率为51.6%。
邹鑫[3]2013年在《胰激肽释放酶的分离纯化》文中进行了进一步梳理激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶,分为组织激肽释放酶和血浆激肽释放酶两类。组织激肽释放酶中又以胰激肽释放酶应用最为广泛,它具有调节血压、改善血液循环的功效,在临床上有着重要作用,被用于治疗高血压、动脉粥样硬化等疾病,受到了医药行业的广泛关注。我国具有丰富的脏器资源,成本低廉,而胰脏中富含胰激肽释放酶,因此利用胰脏作为原料,将胰激肽释放酶进行分离纯化对医药行业有着巨大的经济利益。国内虽已有几十年的研究历史,但回收率高、工艺简便、周期短的方法仍欠缺,值得进一步探究。本文对激肽释放酶分离纯化过程中盐析、超滤、离子交换层析等方法中各项参数进行了详细研究,并建立了一套检测手段,且经过长时间的稳定性验证,下研究结果总结如下：1、研究了胰蛋白酶抑制剂对激肽释放酶活性检测的影响,结果表明在检测时加入过量的胰蛋白酶抑制剂能有效的抑制粗酶中的胰蛋白酶与底物N-苯甲酰-L精氨酸乙酯(BAEE)的反应,从而使测定结果更加准确可靠。2、研究了硫酸铵浓度对激肽释放酶活性检测的影响,设计分别加入0-0.5M的硫酸铵梯度进行检测,结果发现,即使是0.5M硫酸铵的加入对检测结果的影响也很微小,可以忽略盐析过程中硫酸铵对检测结果造成的影响。3、研究了盐析沉淀时间对效果的影响,对加入硫酸铵后静置30 min、60min、 90 min、120 min后上清液中的激肽释放酶进行检测,结果发现,90 min时已沉淀完全,此时能取得最佳效果。4、研究了盐析沉淀范围,分别设计20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%等6个不同沉淀范围进行研究,结果发现在20%-70%的盐析范围内均有不同程度激肽释放酶析出,综合考虑总活力及比活,确定盐析范围为20%-70%。5、研究了盐析后的超滤参数,利用10 KD的超滤膜分别对2×、4×、8×超滤浓缩后的效果进行考查,结果表明2×超滤浓缩的回收率最高,酶活的损失最小,因此确定超滤浓缩为2×。6、通过单因素试验对离子交换层析中的上样条件进行研究,研究内容包括吸附pH的选择、吸附盐离子浓度选择及洗脱盐浓度等。确定了最佳上样条件：平衡液采用0.02M pH 5.5的NaAc-HAc缓冲溶液,洗脱液采用含0.36M NaCl的0.02M pH 5.5的NaAc-HAc缓冲溶液。7、利用得到的最佳上样条件对样品进行DEAE-Sepharose FF层析,并收集到一个洗脱峰,检测发现纯度较高,比活达到403.62 U/mg,活性回收率为73.19%,纯化倍数达到29.77倍。
参考文献：
[1]. 激肽释放酶的仿生亲和纯化研究[D]. 刘宏亮. 华中师范大学. 2004
[2]. 动物源胰激肽释放酶的纯化[D]. 赵佳. 浙江大学. 2008
[3]. 胰激肽释放酶的分离纯化[D]. 邹鑫. 福建农林大学. 2013