马相如[1]2004年在《伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆、表达及其结构分析》文中研究指明α疱疹病毒在感染细胞过程中，普遍产生对细胞内大分子合成的显著抑制作用，从而引起宿主细胞蛋白质合成的快速关闭。进一步研究发现单纯疱疹病毒1型中UL41基因编码的磷酸化蛋白与宿主细胞核糖核蛋白体的关闭和mRNA降解有关，该蛋白质被命名为病毒宿主关闭蛋白(virion host shutoff protein，VHS)，是构成病毒颗粒的次要结构组分——间质蛋白。在病毒感染裂解期，VHS蛋白进入细胞后立即触发宿主细胞蛋白质合成的快速关闭和所有mRNA(包括宿主细胞及病毒)的降解，使细胞内蛋白质翻译从宿主mRNA转向病毒mRNA，并推动不同时期(立即早期α、早期β、晚期γ)病毒基因的有序表达。病毒感染后期，病毒结构蛋白VP16(由UL48基因编码)可以抑制VHS蛋白的活性，并将VHS蛋白包装进病毒颗粒。此外，许多研究表明VHS蛋白还是一个重要的毒力因子，通过干扰IFN-α/β介导的抗病毒免疫反应、降低宿主细胞MHC Ⅰ和Ⅱ类分子的表达、减少免疫系统中病毒抗原的提呈以及抑制宿主先天免疫反应等在α疱疹病毒的发病机理和免疫逃避过程中发挥重要作用。 然而，目前关于伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)中VHS蛋白的研究却很少，尚不清楚其是否具有与其它α疱疹病毒VHS相似的生物学活性。因此，克隆并研究PRV的VHS蛋白基因不仅可以鉴定PRV中VHS蛋白的生物学特性，而且对于阐明PRV的基因表达与调控、发病机理及潜伏感染机制等都具有重要意义，并为今后开发VHS基因缺失疫苗奠定基础。 本研究通过PCR从伪狂犬病病毒Ea株基因组中扩增到UL41全基因，序列测定发现扩增片段全长为1174bp，包含编码VHS蛋白365个氨基酸的完整编码区。序列比较分析发现VHS蛋白具有4个保守区，并且第叁个保守区与核酸内切酶结构域FEN-1(1A76)高度同源．用PROSPECT软件预测的伪狂犬病病毒VHS蛋白叁维结构中含有10个α螺旋和22个β折叠，与单纯疱疹病毒Ⅰ型的VHS蛋白叁维结构十分相似。说明PRV的VHS蛋白可能也是一个核酸酶，具有mRNA降解活性。 将UL41全基因克隆到表达载体pGEX-KG中GST下游，构建了原核表达质粒pGEX-UL41，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了GST-VHS融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE结果显示，表达的融合蛋白质分子量为66 KDa。将原核表达质粒pGEX-UL41和pGEX-UL48分别转化大肠杆菌，大量诱导表达融合蛋白VHS和VP16。提取包涵体，复性和纯化后免疫家兔，分别制备了抗VHS和VP16蛋白的高免血清。 本研究还将UL41与UL48全基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)和pCI-neo中，构建了单基因真核表达质粒pcDNA-UL41，pCI-UL41和pCI-UL48，以及UL41与UL48双基因共表达质粒pcDNA-UL41-UL48。为进一步深入研究VHS蛋白的功能，确定其是否可以与VP16蛋白相互作用奠定了基础。
马相如, 胡勤芹, 肖少波, 方六荣, 刘正飞[2]2005年在《伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆及结构分析》文中研究指明为研究伪狂犬病病毒 (pseudorabiesvires ,PRV)UL4 1基因编码的病毒宿主关闭蛋白 (VHS)的结构与功能 ,通过PCR扩增得到含UL4 1基因完整编码区的 1174bp片段 ,将该片段克隆到表达载体pGEX KG中GST下游 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中实现了GST VHS融合蛋白的高效表达 .序列分析发现VHS蛋白具有 4个保守区 ,并且第 3个保守区与核酸内切酶结构域FEN 1(1A76 )高度同源 .PROSPECT软件预测的伪狂犬病病毒VHS蛋白叁维结构中含有 10个α螺旋和 2 2个β折叠 ,与单纯疱疹病毒Ⅰ型的VHS蛋白叁维结构十分相似 .
何雁南[3]2007年在《口蹄疫新型疫苗研究》文中研究指明口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)引起的,偶蹄动物共患的烈性、急性、接触性传染病。尽管该病的死亡率低,但由于该病传染性极强,能迅速形成大范围流行,而导致发病地区、乃至该国的畜产品出口贸易停止,从而造成巨大的经济损失。免疫接种是预防和控制该病的主要措施,目前用于预防FMD的主要疫苗是传统的弱毒苗和灭活苗,虽然这些传统疫苗能够提供较好的保护,但存在制备费用高、潜在的散毒危险等缺点,使得这两种疫苗的使用一直都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。鉴于此,本研究对FMDV新型疫苗设计进行了新的探索,以构建了伪狂犬病毒(PRV)为载体的重组PRV-FMDV新型基因工程疫苗,以西门利克森林病毒(SFV)为复制子的“自杀性”DNA疫苗和以杆状病毒为载体的重组病毒疫苗,并对构建的叁种候选疫苗进行了免疫效力研究;克隆并表达了猪源髓细胞分化因子MyD88,并探讨了其作为分子佐剂在小鼠体内对FMDV DNA疫苗免疫效果的影响。主要研究内容如下:1、共表达0型口蹄疫衣壳前体蛋白P1及其多抗原合成表位FHG的重组伪狂犬病毒FHG/P1/PRV的构建和免疫原性研究根据已公布的O型口蹄疫抗原表位设计合成了多抗原表位肽基因fhg,将其插入到中间转移载体pIECMV中,获得重组中间转移质粒pIEFHG,将pIEFHG与本室构建的口蹄疫-伪狂犬重组病毒TK~-/gG~-/P1~+基因组共转染猪肾细胞IBRS-2,通过空斑纯化得到了新型口蹄疫重组伪狂犬病毒株FHG/P1/PRV。结果表明,此重组病毒能同时表达具有生物学活性的O型口蹄疫衣壳前体蛋白P1以及多抗原合成表位肽FHG,并且伪狂犬病毒基因组上的多点插入表达并不影响其在宿主细胞上的增殖。将此疫苗免疫40日龄的仔猪,结果表明,重组病毒FHG/P1/PRV较之亲本株TK~-/gG~-/P1~+,能够诱导较好的体液免疫和细胞免疫。并且由于FHG/P1/PRV病毒基因组中的gE基因被插入失活,因此该疫苗能够与国际通用的PRV鉴别诊断方法配合使用,这为此疫苗的推广奠定了基础。2、FMDV DNA疫苗的构建和免疫效果分别以pcDNA3.1+和pSCA1为载体,构建了表达O型FMDV空衣壳蛋白的常规DNA疫苗表达质粒pceCAP和“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCAI-eCAP,转染BHK-21细胞,Western blot检测证实两种表达质粒均能正确表达FMDV空衣壳蛋白VP0,VP3,和VP1。将pceCAP和pSCAI-eCAP分别以100μg/只免疫Balb/c小鼠,并对这两种疫苗的免疫效果进行了比较,发现“自杀性”DNA疫苗组产生的ELISA抗体和中和抗体明显高于常规DNA疫苗组的,且“自杀性”DNA疫苗能诱导更强的细胞免疫。捕狙⒔峁砻鳌白陨毙浴盌NA疫苗pSCAI-eCAP能完全保护小鼠抵抗FMDV同型强毒的攻击。是一种极具潜力的FMDV候选DNA疫苗。3、杆状病毒介导的表达FMDV空衣壳蛋白的重组病毒疫苗的构建以及免疫原性的研究杆状病毒不能感染哺乳动物细胞,但可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,在本研究中利用水泡性口炎病毒G蛋白修饰杆状病毒。将含有CMV启动子驱动的编码FMDV空衣壳蛋白的整个读码框表达的基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-VSV-G中,构建重组病毒Ac-V-eCAP。体外转导试验表明,构建的重组病毒均能高效转导哺乳动物细胞.将重组病毒分别以不同的剂量(10~9PFU,10~8PFU,10~7PFU)肌肉注射免疫小鼠,试验结果表明,无论是从体液免疫水平还是细胞免疫水平来比较,重组杆状病毒Ac-V-eCAP以10~9PFU的剂量免疫小鼠时,能够诱导最高的体液免疫水平和细胞免疫水平,具有较好的免疫效果。病毒血症结果表明,Ac-V-eCAP当以10~9PFU的剂量免疫小鼠时能够针对FMDV同型强毒株的攻击提供较好的保护(4/5),但是还是略要低于灭活苗(5/5)。4、猪源髓细胞分化因子MyD88作为分子佐剂在小鼠体内对FMDV DNA疫苗免疫效果的影响通过cross-over PCR的方法从猪外周全血中克隆髓细胞分化因子MyD88,并对其序列进行分析。结果获得了髓细胞分化因子MyD88,全长882bp,序列测定及同源性分析表明其与GenBank中报道的牛以及人的髓细胞分化因子基因同源性较高,同源性分别为89%和87%;与人,鼠对应功能域的氨基酸序列的分析结果表明,death区,猪源MyD88与人、鼠源MyD88同源性分别为77.3%,72.7%。TIR区,猪源MyD88与人、鼠源MyD88同源性分别为97.8%,91%。结合分子建模的结果,预测了猪源MyD88蛋白death区位于40-105aa.,TIR区位于158-291aa.。将表达猪源MyD88基因的表达盒插入FMDV DNA疫苗pceCAP中,获得共表达质粒pcMyD88-eCAP,将pcMyD88-eCAP和pceCAP分别以100μg/只免疫Balb/c小鼠,并对这两种疫苗的免疫效果进行了比较,结果无论体液免疫还是细胞免疫,共表达质粒pcMyD88-eCAP较之普通质粒无显着免疫增强效应。这说明猪源MyD88蛋白可能在小鼠体内活性极低,不能激发天然免疫反应。
林旭埜[4]2009年在《猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用》文中研究指明猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的猪的一种危害严重的烈性传染病。本研究培育了猪睾丸传代细胞(Swine Testis Cell,ST细胞)应用于猪瘟活疫苗,建立了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准,批量生产猪瘟活疫苗,并在我国八省30余个猪场推广应用,获得良好效果。为猪瘟疫病的防控奠定了坚实的基础。ST细胞培育：选用ST细胞系作为繁殖猪瘟兔化弱毒病毒液的细胞基质,将ST细胞传3代增殖至适量建立基础细胞库；将基础细胞传4代增殖至适量建立工作细胞库,对基础细胞库和工作细胞库细胞进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验,确认无任何污染。对ST细胞进行了细胞使用最高代次的研究,工作细胞库复苏的细胞传25代仍能生长良好,并保持细胞的纯净性和良好的病毒增殖能力。将基础细胞库的第3代细胞、最高限制代次细胞(工作细胞库复苏传至20代)和超过最高代次5代细胞(工作细胞库复苏传至25代细胞)进行细胞软琼脂集落试验、裸鼠肿瘤形成试验、染色体数检查等试验,未发现异常。没有致瘤、致癌、致畸性,符合弱毒活疫苗生产用细胞的各项特性,该细胞可用于猪瘟疫苗的生产。猪瘟种毒：对猪瘟兔化弱毒进行纯净性、安全性、免疫原性等多项检验,建立的生产用细胞毒种种子批经全面鉴定结果均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中相关标准。疫苗研制：应用生物反应器进行了猪睾丸传代细胞的高密度培养和猪瘟病毒的高密度培养。对不同代次细胞产毒情况、不同接毒量、接毒后不同时间收获、病毒液于不同温度保存期等工艺进行研究和比较试验。结果显示,当脾毒种病毒含量≥105RID/ml时,接种含0..2-0.3%脾毒种的维持液,当细胞毒种病毒含量≥5×105RID/ml时,接种含3-5%的细胞毒种的维持液,于接种后5天作第1次收获换液,以后每隔4天收获换液1次最为合适,此时收获的病毒液病毒滴度最高且稳定；收获的病毒液在-15℃以下保存3个月,病毒液效价基本保持不变。建立了应用生物反应器培养猪瘟活疫苗的生产工艺；制定了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准。安全与效力检验：ST传代细胞源猪瘟活疫苗每头份的病毒含量比原代牛睾丸细胞苗的规程标准高了10倍,安全和效力检验试验结果证明：传代细胞源猪瘟活疫苗(7500RID/头份)30头份接种猪,3批实验室疫苗的安检猪均未出现任何不良反应,对猪安全。以1/7500头份接种家兔,所有效力指标合格；以1/5000头份接种猪,攻毒后均100%保护。疫苗对猪能产生良好免疫保护力。与同类产品的比较：参照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)猪瘟活疫苗(细胞源)成品检验方法检验,将研制开发的的用ST传代细胞生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源)与同类产品用牛睾丸原代细胞生产的猪瘟活疫苗(细胞源)的各项指标的比较试验表明用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗1/5000头份免疫猪能100%产生免疫保护；1/7500头份接种家兔均能符合规程兔体反应热的要求,全部合格。比较疫苗的病毒含量、效力和安全检验结果,该疫苗的病毒滴度和免疫保护效力高于现有BT原代细胞活疫苗规程标准的10倍,用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗以30倍剂量进行安全检验,全部合格。通过对ST、BT细胞疫苗毒株E2基因所编码的gp55抗原蛋白的核甘酸、氨基酸序列比较及抗原结构和中和抗原决定簇上的差异分析,发现猪瘟兔化弱毒疫苗株在经ST和BT细胞培养后,其保护性抗原基因E2并没有明显的变化,所研究的猪瘟细胞疫苗毒在遗传上表现高度的稳定性。推广应用：在获得农业部猪瘟活疫苗(传代细胞源)生产许可后,严格按照农业部发布的猪瘟活疫苗(传代细胞源)制造及检验暂行规程、暂行质量标准的规定组织生产和检验,2008年共生产猪瘟活疫苗(传代细胞源)5批,517万头份。2009年生产了22批,经检验合格20批,2462万头份。至2009年7月31日为止,在规定的8省共销售使用了猪瘟活疫苗(传代细胞源)7批733万头份,参照各猪场免疫程序对仔猪、保育猪、育肥猪和种猪进行免疫接种,未有不良反应以及免疫猪发生猪瘟临床感染和亚临床感染的反馈。在规定的广东、湖南、河南、四川、江苏、山东、辽宁和福建等8省选择了30多个规范化猪场使用,按照猪瘟活疫苗(传代细胞源)规定的使用说明,结合各场的免疫程序进行免疫接种,并进行临床应用安全性观察、田间免疫效果等情况的跟踪调查工作,经过7批次389万头份疫苗使用观察,对经产母猪、种公猪、后备种猪、商品肉猪一次与多次免疫接种,未见任何不良反应,安全性好,免疫效果确切。
张德庆[5]2011年在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究说明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸(DNA)疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物(猪、鼠、鸡、鸭)间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪(哺乳动物)C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭(禽类动物)C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28(29).n(n=2、4、6)多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28(29)对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物(猪、鼠)的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物(鸡、鸭)C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物(猪、鼠)和禽类(鸡、鸭)的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物(猪、鼠)与禽类(鸡、鸭)C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28(29)至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28(29).n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28(29).n中p28(29).n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 (29).n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28(29)多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n)。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28(29).n PRRSV GP5核酸疫苗(pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).2.4.6)及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28(29).n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28(29)2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体(pcDNA3.1)和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着(P<0.05),其中以pcDNA3.1-GP5-p28(29).6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28(29).n(n=2,4,6)相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着(P<0.05)。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着(P<0.05),与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着(P<0.01),但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
刘文波[6]2005年在《表达ILTV gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgY重链恒定区基因重组鸡痘病毒免疫效力的研究》文中研究表明传染性喉气管炎(Infectious laryngotractheitis，ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病。该病分布于世界各地，被OIE列为B类传染病。上世纪60年代，我国也发现本病。此后，相继在许多省市流行，给我国养禽业造成了严重的经济损失。目前国内外主要使用弱毒疫苗预防本病，但它们都存在着疫苗株毒力偏强、潜伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株无法鉴别的缺点，从而不利于ILT的根除。随着分子生物学的发展，利用基因工程疫苗预防ILT已成为人们的共识。禽痘病毒载体是继痘苗病毒以后发展起来的又一动物病毒载体。由于禽痘病毒具有宿主范围窄，可插入较大的外源基因，在动物体内能产生一过性感染，却能诱发保护性免疫应答，易于工业化生产等优点，使其从众多的活病毒载体中脱颖而出，成为当前重组病毒载体疫苗研究的热点，并且在人和许多动物重要传染病重组疫苗的研制中得到广泛应用。本研究利用鸡痘病毒弱毒疫苗株282 E4株为载体，构建了表达ILTV烟台株gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgY重链恒定区基因的重组鸡痘病毒，并检测了其对鸡抵抗ILTV强毒株攻击的免疫保护作用。研究主要包括以下几个方面： 1．传染性喉气管炎病毒烟台株TK基因的序列测定及TK蛋白结构功能初步分析 根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)美国632株TK基因序列设计并合成1对引物，以烟台分离株为模板扩增了TK基因并对其进行了序列测定。结果表明，该基因包括1个1089 bp的完整开放阅读框架，可编码363个氨基酸组成的多肽。核苷酸序列比较分析发现，不同ILTV毒株之间TK基因相对保守，但与其他疱疹病毒之间同源性则比较低。氨基酸序列分析还发现，尽管与其他疱疹病毒的TK蛋白同源性较低，但ILTV TK蛋白也具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列：-DGXXGXGK-(ATP结合结构域)和-DRH-(核苷酸结合结构域)，以及5个保守的Cys残基。这些Cys残基可能是通过形成二硫键来维持TK蛋白氨基酸的功能构象，使ATP结合结构域与核苷酸结合结构域在空间上相互重迭，并与底物靠近发生反应，从而发挥TK蛋白的功能。 2．传染性喉气管炎病毒烟台株gE基因的序列测定及gE蛋白结构功能初步分析 根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)美国标准攻毒毒株gE基因序列设计并合成1对引物，以烟台株为模板，PCR法扩增出1条1.5 kb的gE基因片段，并将其克隆至
时乐[7]2012年在《猪细小病毒YL株全基因组序列分析及其VP2基因原核表达》文中提出猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）可以引起猪细小病毒疾病，该病是一种以母猪，特别是怀孕母猪发生不孕、流产、产出死胎、畸形胎、木乃伊胎以及病弱仔猪为特征的繁殖障碍性疾病。该病广泛存在于世界各地，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。目前，有关PPV全基因组的研究很少，GenBank中收录的完整PPV全基因组序列只有两条（Accession no. U44978和NC001718）。为了进一步分析PPV的基因结构特点和PPV的遗传变异情况，以及其在临床诊断中的应用，本研究首先以实验室分离的猪细小病毒YL株为材料，对其整个编码区序列进行测定，以分析猪细小病毒YL株基因组的分子特征，并对PPVYL株结构蛋白VP2的主要抗原表位区域进行原核表达，对其抗原活性进行评价。研究取得如下结果：1.根据GenBank上公布的猪细小病毒全基因序列（NC001718），设计合成了覆盖PPV全部编码区的四对引物，利用PCR反应分段克隆PPV YL株的整个编码区基因片段，通过DNAStar软件对测序结果进行拼接，结果显示PPV YL株全长4302bp，且不存在碱基的插入与缺失，但碱基的突变覆盖整个基因结构。本研究结果已经被GeneBank收录，登录号为JN860197。2.猪细小病毒YL株主要基因与其它国内外分离株进行比较，发现该毒株的NS1基因和编码蛋白与NADL-2（NC001718,5075bp）、NADL-2（M38367,5034bp）和Kresse（U44978）同源性最高，均达到99.4%。对PPV YL株VP2基因和蛋白的序列比对结果表明，YL株VP2基因与Kresse毒株（U44978）和我国的分离株BQ株同源性最高（99.7%），他们编码的氨基酸完全一致，结果表明猪细小病毒具有高度保守性。VP2基因和编码氨基酸差异分析表明YL株有可能和Kresse毒株具有相同的致病性。进化树分析表明PPVYL株与Kresse毒株和BQ毒株位于一个小分支，亲缘关系最近。3.采用PCR技术利用试验中构建的含有PPV YL株VP2基因的阳性克隆质粒pGEM-YL-VP2进行VP2基因的特异性扩增，将其克隆到原核表达载体pET-32a中，构建原核表达载体pET-YL-VP2，经双酶切鉴定后将重组原核表达载体pET-YL-VP2转化到E.coli BL21，经过诱导条件的优化，目的蛋白通过IPTG诱导进行表达，SDS-PAGE结果显示，表达产物分子量为56Ku，经Western blotting检测具有良好的抗原活性。本研究结果为建立分子生物学用于诊断猪细小病毒感染及研究该病的发病机制奠定基础。
谢叁磊[8]2014年在《IHNV N和G基因在杆状病毒表达系统中的表达及抗体制备》文中研究说明本研究以某渔场病鱼组织内分离得到的传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）BJLL株为材料，进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究，在此基础上，制备了鼠抗IHNV多克隆抗体，克隆表达了IHNV的核蛋白(N)和糖蛋白(G)，并对两种蛋白进行Western-Blot和IFA检测，以表达出的IHNV N蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备抗血清，并对其进行效价测定等应用。结果如下：1、IHNV病毒的增殖纯化和多抗制备利用对IHNV敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)增殖病毒；测定了培养液中的病毒滴度和病毒在CHSE细胞中的生长曲线；采用超速离心法对收获的病毒进行了纯化；利用纯化的IHNV病毒免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA法检测表明获得的鼠抗IHNV血清效价为1:8000。2、IHNV N蛋白的表达纯化及抗原性分析参照GenBank已发表的IHNV的WRAC株N基因序列，以分离得到的IHNV毒株（BJLL株）为实验材料，提取RNA，反转录为cDNA，将N基因克隆到pGM-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定。结果表明，扩增N基因片段的长度为1176bp，所测得的基因序列与GenBank上所报道的IHNV的核蛋白序列同源性在99％以上。利用杆状病毒表达系统表达N基因，成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-N，制备了reBacmid-N，并进行PCR鉴定；reBacmid-N转染Sf9昆虫细胞，27℃培养72h～96h，收集细胞。表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果与预期蛋白大小一致，Western-blot和IFA检测表明，该表达蛋白具有良好的免疫学活性。用纯化的N蛋白免疫Balb／c小鼠，制备高免血清。以纯化病毒包被ELISA板检测N蛋白血清滴度，测得鼠抗N蛋白血清滴度为1:8000。3、IHNV G基因的表达及鉴定参照GenBank已发表的IHNV WRAC株G基因序列，以分离得到的IHNV毒株（BJLL株）为实验材料，提取RNA，反转录为cDNA，将去掉末端40个疏水性氨基酸的G基因克隆到pGM-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定。结果表明，扩增G基因片段的长度为1380bp。利用杆状病毒表达系统对G基因进行表达，成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G，制备reBacmid-G，并进行PCR鉴定；reBacmid-G转染Sf9昆虫细胞，27℃培养72h～96h，收集细胞。表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果与预期蛋白大小一致，Western-blot和IFA检测表明，该表达蛋白具有良好的反应原性。
胡溪霞[9]2016年在《鸭肠炎病毒UL13蛋白激酶活性与核定位特性研究》文中提出鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)、α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、马立克氏病毒属(Mardivirus)的成员之一。UL13基因编码的蛋白是疱疹病毒保守性蛋白激酶(Conserved herpesvirus protein kinase, CHPK)家族成员之一。目前有关DEV UL13功能研究的资料尚很缺乏,因此作者对其进行了生物信息特征、原核表达及多克隆抗体的制备、UL13蛋白激酶活性、细胞内定位、核定位特性、功能等方面的研究,主要结果如下：1鸭肠炎病毒CHv株UL13基因生物信息特征DEV UL13基因完整ORF为1575bp,编码含524个氨基酸的肽段,整条肽链不具备信号肽和跨膜区,有潜在的糖基化位点9个和磷酸化位点34个,有两个潜在的核定位信号分别位于肽段4-7及90-96位氨基酸残基处,296-305氨基酸位点显示为潜在核输出信号。密码子分析显示UL13基因偏向使用A/T结尾的密码子,密码子使用模式与酵母的最为接近。DEV UL13蛋白的二级结构分析显示其有多个抗原决定簇,均匀分布在整条肽链中,叁级结构预测其与疱疹病毒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员高度相似,属于疱疹病毒保守性蛋白激酶家族成员之一,通过序列比对其179位氨基酸为激酶发挥最大活性所必需的保守性赖氨酸位点。2鸭肠炎病毒UL13基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备将DEV UL13基因第486-1158位碱基序列克隆至原核表达载体pET32c(+)上,将重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE)中进行融合表达,通过对表达条件进行优化,确定了30℃、IPTG浓度为0.2 mM诱导表达5h能获得最高表达量。获得了大小约44 kDa带His标签的UL13非可溶形式的包涵体蛋白。该表达蛋白能被兔抗DEV多克隆抗体特异性识别。用亲和层析的方法纯化UL13重组蛋白,复性后免疫兔子获得兔抗DEV UL13蛋白血清,能特异性识别感染细胞中的DEV。3鸭肠炎病毒UL13基因类型及转录、表达时相分析为确证鸭肠炎病毒UL13的基因类型,首先用更昔洛韦和放线菌酮分别处理感染了DEV的细胞,发现DEV UL13的表达仅对放线菌酮处理敏感,完全不依赖病毒的复制,说明DEV UL13为早期基因。通过反转录实时荧光定量PCR对DEV UL13基因的转录实相特征进行探索,结果表明UL13基因从病毒感染后2 h开始转录,24 h转录水平达到峰值,其相对宿主细胞β-actin基因转录水平从病毒感染后2 h起逐步上升,48 h达到峰值。同时用免疫印迹方法对DEV UL13蛋白表达时相进行探索,发现在病毒感染后4 h能被检测到,24 h表达水平达到峰值,UL13基因表达与转录水平的动态变化基本一致。4鸭肠炎病毒UL13蛋白激酶活性研究通过杆状病毒昆虫细胞表达系统对DEV UL13蛋白和对激酶活性发挥至关重要的保守性赖氨酸突变的DEV △UL13(K179M)蛋白进行了体外真核表达及纯化,测定及比较了DEV UL13蛋白和DEV △UL13(K179M)蛋白体外激酶活性的差异,并确定了DEV UL13在体外发挥最适酶活条件为50 mM Mg2+存在、pH7.2、37℃；同时纯化了UL13潜在底物蛋白,病毒编码的糖蛋白gE和Us3蛋白激酶,通过体外激酶反应初步确定Us3蛋白能被UL13蛋白磷酸化。为了进一步确定UL13蛋白对Us3蛋白的磷酸化能力、探索UL13蛋白激酶活性对病毒生长复制的影响,通过本实验室新构建的DEV感染性克隆平台,成功构建了UL13蛋白第179位赖氨酸突变为甲硫氨酸的点突变重组毒DEV CHv-BACAUL13(K179M)及回复突变毒DEVCHv-BAC△UL13(K179M) R。通过对DEV CHv-BACAUL13(K179M)重组毒与回复毒DEV CHv-BACAUL13(K179M) R、亲本毒DEV CHv-BAC进行体外生物学特性比较,发现UL13蛋白激酶失活毒株在病毒的复制能力及空斑形成方面不及亲本毒和回复毒株,说明UL13激酶活性对病毒的生长复制有重要影响,同时通过免疫印迹的方法确定DEVUL13蛋白在病毒感染的细胞内也能磷酸化Us3蛋白。5鸭肠炎病毒UL13基因编码蛋白的定位研究通过间接免疫荧光法探究DEV UL13蛋白在感染细胞内的定位情况,结果发现UL13蛋白在感染细胞的核、质中均有分布。为了确定主导UL13蛋白入核的功能信号,先通过重迭PCR技术构建了UL13蛋白潜在的核定位信号单/双缺失的突变子与GFP的融合表达,发现与天然UL13融合GFP重组蛋白相比,核定位信号单/双缺失的重组蛋白大量/全部在胞浆滞留,而且通过将核定位信号1或/和2与GFP融合表达,发现绿色荧光大量/几乎全部位于胞核。说明核定位信号1和2对于DEV UL13蛋白的入核不可或缺,且二者具有协同作用。同时通过药物抑制试验确定了UL13的核定位信号是通过与importin α/β形成复合物来调节UL13蛋白入核的。用相同的操作探究DEV UL13潜在的核输出信号功能,发现其缺失或添加并不能引起绿色荧光分布的任何变化,表明核输出信号是非功能性的。为了进一步探索DEV UL13蛋白入核的功能,作者通过本实验室新构建的DEV感染性克隆平台,成功构建了UL13蛋白缺失了核定位信号的重组毒DEV CHv-BAC UL13-ANLS。通过对DEV CHv-BAC UL13-△NLS与亲本毒DEV CHv-BAC进行体外生物学特性比较,发现DEV CHv-BAC UL13-△NLS重组毒在病毒的复制能力及空斑形成方面与亲本毒并无明显差异,说明UL13蛋白不入核对病毒的生长复制没有重大影响。通过免疫印迹法比较亲本毒和DEV CHv-BAC UL13-△NLS、DEV CHv-BAC△UL13(K179M)重组毒感染后Us3蛋白的磷酸化水平发现缺失了核定位信号的DEV UL13蛋白依然能磷酸化Us3蛋白,说明核定位信号的缺失不影响激酶活性。6鸭肠炎病毒UL13缺失重组毒构建及体外细胞培养特性研究为了探索DEV UL13蛋白影响病毒复制是否完全依赖其激酶活性的发挥,本章依赖细菌人工染色体DEV重组病毒拯救系统平台,通过两步Red重组系统构建了两个UL13蛋白部分缺失的感染性克隆,并成功拯救出UL13缺失的重组毒DEVCHv-BAC△UL13及部分缺失的重组毒DEV CHv-BAC△UL13-1(仅缺失UL13肽链激酶活性区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚域)和DEV CHv-BAC△UL13-2(仅缺失UL13肽链激酶活性区域Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ亚域)。经测序鉴定及RFLP分析,这叁株重组毒基因组除了人工诱发的突变外,其余与亲本无异。叁株重组毒所形成的空斑明显小于亲本毒,生长复制能力也明显弱于亲本毒,这种差异在DEV CHv-BAC△UL13-2重组毒上表现尤为明显,而DEV CHv-BAC△UL13及部分缺失的重组毒DEV CHv-BAC△UL13-1与第四章构建的点突变重组毒株DEV CHv-BAC△UL13(K179M)在空斑形成及复制能力上并无明显差异。表明DEV UL13蛋白在病毒复制周期中发挥重要作用,且其功能的发挥多半依赖其激酶活性。
参考文献：
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[4]. 猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用[D]. 林旭埜. 南京农业大学. 2009
[5]. C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学. 2011
[6]. 表达ILTV gB及gD主要抗原表位基因和鸡IgY重链恒定区基因重组鸡痘病毒免疫效力的研究[D]. 刘文波. 南京农业大学. 2005
[7]. 猪细小病毒YL株全基因组序列分析及其VP2基因原核表达[D]. 时乐. 西北农林科技大学. 2012
[8]. IHNV N和G基因在杆状病毒表达系统中的表达及抗体制备[D]. 谢叁磊. 甘肃农业大学. 2014
[9]. 鸭肠炎病毒UL13蛋白激酶活性与核定位特性研究[D]. 胡溪霞. 四川农业大学. 2016
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