（2武汉市儿童医院检验科 湖北 武汉 430072）
【摘要】 目的：调查武汉地区腹泻儿童腺病毒感染情况及所感腺病毒分子遗传特点分析。方法：收集武汉市儿童医院2015年9月至12月腹泻儿童粪便样本，使用PCR方法扩增腺病毒hexon基因片段。结果：82例样本中腺病毒检出24例，检出率29.3%。利用hexon基因段序列对其中7例阳性株构建进化树分析，发现Ad41占42.9%（3/7），Ad31占28.6%（2/7）,Ad1和Ad3各占14.3%（1/7）。结论：腺病毒是造成武汉地区2015年9月至12月儿童腹泻的主要病原体之一，血清型以41型为主，同时有31型等多个血清型散发，应加强对非肠道腺病毒感染的监测。
【关键词】 腹泻；腺病毒；血清型
【中图分类号】R725.7 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）29-0050-03
Investigation the infection status of human adenovirus in children with diarrhea in Wuhan from September to December 2015
Cui Jin1,Xiang Yun2,AiHongWu2, Liu YingLe1, Liu Fang1, Wu JianGuo1
1.College of Life Science, Wuhan University, Hubei Province, Wuhan 430072, China;
2.Department of Clinical Laboratory, Children’s Hospital of Wuhan City, Hubei Province, Wuhan 430072, China
【Abstract】Objective To analyze the human adenovirus infection status among children with diarrhea in Wuhan. Methods Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the hexon gene of human adenovirus in the feces collected from the children with diarrhea in children’s hospital between September and December 2015 in Wuhan. Results 24 samples was tested positive for human adenovirus among 82 samples, positive rate is 29.3%. The phylogenetic tree was constructed according to 7 hexon gene sequences. Serotype 41 is the main epidemic serotype, accounting for 42.9%（3/7）,serotype 31 account for 28.6%（2/7）, and serotype 1 and 3 each accounts for14.3%（1/7）. Conclusion Human adenovirus is one of the major pathogens of the infant and children suffered with acute diarrhea in Wuhan. Serotype 41 is the most epidemic serotype, followed by serotype 31. Nonenteric adenovirus should be monitored as well.
【Key words】Diarrhea; Human adenovirus; Serotype
腹泻是婴幼儿好发疾病，超过70%的感染性腹泻由病毒引起[1-2]。腺病毒感染是引发婴幼儿腹泻的原因之一。据报道，腺病毒目前已有60多个血清型，分属7个亚组A-G，不同血清型感染不同人体组织，引发不同疾病，其中F亚组40、41型被称为肠道腺病毒(EADV)，是引发腹泻的主要血清型[3-5]。为了解武汉地区腹泻患儿中腺病毒感染情况，本研究对武汉市儿童医院2015年9月至12月份共82份腹泻儿童粪便样本进行检测，调查腺病毒感染引发腹泻的流行情况并对其分子遗传特点进行分析。
1.材料与方法
1.1 样品背景
采集2015年9月至2015年12月武汉市儿童医院腹泻儿童粪便样本共82份，患者被诊断有急性腹泻、急性胃肠炎或呕吐等症状。
1.2 标本处理
在生物安全柜中，取1.5ml离心管，做好标记；在每管中加入约900μl的PBS缓冲液，将每一份粪便标本取100μl（固体取小豌豆大小），加入已标记好的离心管中，用漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次10s，静置10min，8000rpm离心5min；取上清即得10%便悬液。
1.3 核酸提取
将处理好的样本从冰箱中取出化冻，8000rpm 离心5min，取200ul上清，使用Geneaid 公司Virus DNA/RNA Extraction Kit II VR100试剂盒提取核酸，核酸用30ulDEPC水溶解，立即使用或存于-80冰箱。
1.4 腺病毒hexon基因片段特异性扩增
引物对F：TTCCCCATGGCICAYAACAC/R：CCCTGGTAKCCRATRTTGTA;25ul反应体系：2x tsingke Master MIX 12.5ul，F（33μM）:0.2ul，R（33μM）0.2ul，病毒；核酸5ul，ddH2O 7.1ul；PCR反应参数：94℃预变性5min，40个循环（94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），72℃终延伸7min，4℃终止反应。阳性样本获得482bp条带，PCR产物直接送擎科生物科技有限公司测序。
1.5 数据分析
测序结果使用NCBI blast在线比对，使用Clustalx和mega6.0软件进行同源性分析并绘制系统进化树。统计学数据使用SPSS13.0进行分析，P<0.05为有显著性差异。
本研究使用参考株GenBank号：KF303071.1, AB728839.1, KF303070.1, KP274041.1, KP662358, AB330112.1, KF268119.1, KP662346.1, KC632705.1, JQ764730.1
2.结果
2.1 腺病毒检测情况
2015年9月和12月共82份粪便样本中，共检测出了24例腺病毒，检出率为29.3%。82例样本中，性别分布为男63例，女19例，其中男性腺病毒检测阳性数18例，占28.6%(18/63)；女性腺病毒检测阳性数6例，占31.6%（6/19）。男女不同性别腺病毒阳性检出率无显著性差异（χ2= 0.064，P>0.05）。将样本按年龄划分为6月以下、7月以上、1岁以上和2岁以上4个年龄组，各年龄组均有阳性检出，其中7月以上和1岁以上两个年龄段检出率较高（图1），经统计学分析，各年龄组间阳性检出率无显著性差异(χ2= 6.83，P>0.05)。
表 各年龄组腺病毒检出情况
2.2核酸序列分析和进化树构建
测序共获得7份hexon基因片段序列，结果经BLAST在线比对并构建系统进化树进行分析。其中41型3例（42.9%），31型2例（28.6%），1型和3型各1例。3例41型组内同源性99.7%～100%，其中WH201511-6和WH201512-19两例同源性更近。2例31型同源性100%，与湖北襄阳分离株KP662346.1亲缘性较近。3型与广州JQ764730.1参考株同源性较近，1型与泰国参考株KC632705同源性较近。Hexon基因片段系统进化树见图2。
图 腺病毒hexon基因系统进化树
3.讨论
病毒是造成感染性腹泻的主要病原体，包括轮状病毒、杯状病毒、腺病毒和星状病毒[2]。腺病毒感染造成腹泻的发生率仅次于轮状病毒和诺如病毒[6]。目前腺病毒已发现有60多个血清型[3-5]，除肠道腺病毒41和40型外，其他多个血清型也可以造成腹泻[7-8]。深圳福田区2013至2014两年，1188列腹泻样本中肠道腺病毒总体阳性率为2.53%，主要流行41型[9]。广州地区2012年11月至2013年5月病毒性腹泻腺病毒检出率15.5%[10]。杭州地区2012～2013 浙江省儿童医院5岁以下儿童腹泻粪便样本检测肠道腺病毒3.91%[11]。河南地区2011～2014年5岁以下腹泻儿童肠道腺病毒检出率6.32%，未发现明显季节性高发[12]。
近年来，许多报道只检测了肠道腺病毒，而其它血清型常被忽视[9-12]，本研究调查了2015年9月至2015年12月武汉市儿童医院共82份腹泻儿童粪便样本，总腺病毒检出率为29.3%，说明腺病毒是造成腹泻的主要病原体之一，其中EADV占42.9%(3/7)，全部为41型，未检测到40型。同时检测到31，1和3等多个血清型，说明武汉地区除41型为主之外，同时伴有多个血清型散发，尤其有较多的31型，与湖北襄阳地区调查结果一致，应加强对该型的关注[13]。
综上所述，本研究发现武汉地区腹泻患儿所感染腺病毒除41型为主外，有较多的31型，非肠道腺病毒引发腹泻亦应受到重视和监测。
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基金项目： 国家重大科技专项课题（2012ZX10004207）
论文作者:崔进1,向赟2,艾洪武2,刘映乐1,刘芳1,吴建国
论文发表刊物:《医药前沿》2016年10月第29期
论文发表时间:2016/10/27
标签：腺病毒论文; 检出论文; 儿童医院论文; 样本论文; 肠道论文; 地区论文; 阳性论文; 《医药前沿》2016年10月第29期论文;