（四川省成都市龙泉驿区疾病预防控制中心 四川 成都 610100）
【摘要】目的：建立TaqManTM实时荧光pcr检测副溶血性弧菌的快速检测方法，为食物中毒快速准确的定性检测及食品中副溶血性弧菌染菌率的调查提供手段。方法：通过分析，最终选择tlh基因作为目的基因，在Genebank进行中查找多条TLH基因序列，并利用DNAssist软件进行同源性分析，选取相对保守区段，用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针，并利用核酸提取试剂盒煮沸法制备基因组DNA，通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化，初步建立副溶血性弧菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法。结果：选取的tlh基因同源性达到98.9%以上（13/1234），同源性好。通过对各实验条件的优化，得到副溶血性弧菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件，初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速检验方法。结论：TaqManTM实时荧光PCR检测灵敏度高、特异性好，而且检测周期短，能提高副溶血性弧菌的检出率和检测准确性。
【关键词】副溶血性弧菌；TaqManTM探针；实时荧光PCR；快速检测
【中图分类号】R378.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）18-0091-02
【Abstract】Objective To establish a rapid TaqManTM real-time PCR assay for the qualitative detection of Vibrio parahaemolyticus, an alternative method for the rapid detection of Vibrio parahaemolyticus caused food borne disease. Conclusion TaqManTM real-time assay is rapid, sensitive and specific. It could be applied to the rapid diagnosis of Vibrio parahaemolyticus caused food poisoning.
【Keywords】 Vibrio parahaemolyticus; TaqManTM probe; Real- time PCR; Rapid detection
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是革兰阴性嗜盐性细菌，隶属弧菌科弧菌属，它是一种人畜共患病菌。其毒力因子主要包括不耐热溶血毒素(TLH)、耐热直接溶血毒素(TDH)等几种，这种病菌的感染性较强，这些因子中编码TLH的基因tlh位于染色体上，其毒性相对弱一些。相关实验研究结果表明副溶血弧菌的临床和环境分离株中都可以检测到tlh基因，而其它菌中则没有检测出。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1试剂 Taq酶、dNTPs、核酸提取液均购于Takara公司；引物和探针由专业公司合成。
1.1.2仪器 Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪
1.1.3菌种 本实验所用标准菌株为四川省疾病预防控制中心惠赠。
1.2 实验方法
1.2.1引物和探针设计 选取tlh基因保守序列，用引物和探针设计软件Beacon Designer 7.91版设计引物和探针。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆上游引物：5‘—gaagagccaaccttatcac—’3，下游引物：5‘—ccaccagtagccgtcaat—’3，探针：5‘—gttcgctgttggtatcgc—’3，探针5’端标记报告荧光染料为HEX，3’端标记淬灭荧光染料为BQ1。
1.2.2样品基因组DNA模板的提取 副溶血弧菌ATCC17802经1.0%氯化钠营养肉汤增菌液37℃增菌培养12h，取1ml菌液120000r/min，2min离心沉淀，菌沉淀用核酸提取试剂盒提取基因组，并按其操作说明进行。
1.2.3实时荧光PCR反应条件优化 在等浓度等体积DNA模板提取物和荧光定量PCR反应体积为25μl时，循环条件为：第一阶段：95℃，2min；第二阶段：95℃，15s，60℃，30s，在60℃时采集荧光信号，共40个循环，每次实验均设阴性对照，分别对实时荧光PCR的各反应条件进行优化。
1.2.4灵敏度分析 选取副溶血弧菌ATCC17802作为灵敏度分析的代表株。取一环于1.0%氯化钠营养肉汤增菌肉汤中，37℃培养后，当菌液A600约为0.5～1.0时，连续的10倍系列稀释，每个稀释度取1mL菌液进行菌落总数计数，平行双样。同时每个稀释度用用1mL菌液120000r/m in，2min离心沉淀后，将上清液去除之后，向其中加入100μl核酸提取液重悬菌沉淀，然后提取出核酸，接着进行PCR反应。
1.2.5特异性实验 取少许副溶血弧菌临床分离株SD1100302、D群某一株沙门氏菌、蒙得维的亚沙门氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、痢疾志贺氏菌Ⅰ型、大肠杆菌O157：H7、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC6538、单增李斯特菌ATCC54004、产毒大肠杆菌ATCC44824、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌ATCC8099、得比沙门氏菌ATCC50719、福氏志贺氏菌ATCC57571在浓度为1%氯化钠营养肉汤重进行培养，在放置二十四小时之后，进行离心分离，离心转速为120000r/min，分离之后去除上清，然后在其中加入100μl核酸提取液重悬菌沉淀，依据相关操作步骤提取出核酸，取1μl上清液进行TaqManTM定量PCR反应。
2.结果与分析
2.1 同源性比较
在Genebank进行中查找4条tlh基因序列，结果同源性＞98.9%（13/1234），同源性好。
2.2 实时荧光PCR反应条件优化结果
最终优化出来的25μl反应体系为：3.0μmol/LMg2+浓度、1.2倍PCR缓冲液、0.4μmol/L上下游引物浓度、0.20μmol/L探针浓度、0.15μmol/L dNTP和0.025U/μl Taq DNA聚合酶。
2.3 灵敏度结果
计数终点时A600=0.532，菌落总数计数结果为1.8×107cfu/mL，本检测体系的灵敏度为18cfu/反应体系。
2.4 特异性实验结果
用上述的TaqManTM定量PCR反应体系对14种不同细菌进行检测，结果显示：副溶血弧菌ATCC17802和临床分离株SD1100302均检出tlh基因，其余菌株均未检出tlh基因，说明本实验特异性好！
3.讨论
本实验的重点是目的基因的选取以及引物探针的设计。Taniguchi等[1]于1986年曾报道说副溶血弧菌无论是临床分离株还是环境分离株都含有tlh基因，而其它菌则不存在tlh基因性。黄晓蓉等[2]73株副溶血弧菌环境分离株进行检测，结果发现其中全部含有tlh基因，这和Taniguchi等人所得的结论基本一致，据此可以判断tlh基因是副溶血弧菌的特异基因，以tlh基因为待扩增序列对此种病菌进行检测可以得到所需的效果。在这些分离株中，没有检出tdh和trh基因，从而可以推断这两类基因很少出现在副溶血弧菌环境分离株中。
【参考文献】
[1] Taniguchi H，H Hirano，S Kubomura，et a1.Comparison of the nucleotide sequences of the genes for the thermolabile hemolysin from Vibrio parahaemolyticus Microb[J].Pathogenesis，1986，(1)：425-432.
[2]黄晓蓉,吕海沧,郑晶.副溶血弧菌的多重PCR检测[J].食品科学，2006.27（10）445-446.
论文作者:滕毅
论文发表刊物:《医药前沿》2017年6月第18期
论文发表时间:2017/7/20
标签：弧菌论文; 基因论文; 引物论文; 荧光论文; 探针论文; 浓度论文; 实时论文; 《医药前沿》2017年6月第18期论文;