范骏[1]2001年在《TTV家族新成员SEN Virus感染状况和基因序列分析》文中提出在肝炎病原学诊断过程中，有相当一部分病例无法用已经建立的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的实验室诊断方法进行病原学分型，1997年12月Nishizawa采用代表性差异分析（representational difference analysis，RDA）技术从一例非甲～非戊型输血后肝炎患者血清中成功获得500碱基长的基因克隆（N22克隆），称为输血后传播病毒（transfusion transmitted virus，TTV）。TTV广泛存在于世界各地，不仅在非甲～非戊型肝炎患者中存在，而且在各种甲～戊型肝炎患者、血液透析患者、血友病患者、静脉毒瘾者及正常人群和职业献血员中存在。TTV的基因型存在高频率变异，其基因型、病因学机理、传播途径尚不完全清楚。 2000年9月Fiordalisi等在GenBank登录SEN Virus（SENV）基因全序列，同年Umemura等报道SEN Virus与输血后感染肝炎有关；随后Tanaka等发现其核苷酸和核苷酸编码的氨基酸序列与TTV家族具有同源性，证实SENV是TTV家族的新成员，其核苷酸序列存在高度变异。Bowden和Allain报道SEN Virus可能是潜在的非甲～非戊型肝炎的致病病毒，但是尚无有力的证据证明。国内尚无有关SEN Virus的报道。 为了了解SEN病毒感染的临床意义，探索TTV家族新成员SEN病毒基因变异的多样性，为免疫诊断、预防、治疗非甲～非戊型肝炎提供理论依据，我们对495份不同人群的血清标本（44例非甲～非戊型肝炎患者、150例甲～戊型肝炎患者、ZI例 ALT升高的婴幼儿、86例血透患者、35例静脉毒痫者、引例正常体检人群和 108例健康助血．员），－采用巢式PCR方法，以扩增TTV原型片段为对照，研究SENV在上述人群中的感染状况；对其中的阳性＊＊R片段进行纯化、汝接及转化，获取重组质粒，进行＊＊A序列分析。 实验结果菜明，TTV PCR出现人小为 196hp片段，与预计 PCR产物人小一致。SENV PCR出现预FJJ 360hp片段，同时也出现比 360hp长的片段。 在本文研究的不同人群中的检出如卜 TTV和 SENV的检山率分别为7．5％和门．9％；TTV在患病者（非甲～非戊江仰‘炎患者、甲～戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿、血透患者、静脉毒痫者、）和健康人群（助血．员。止常体检人群）中的检出率分别为 15．8％、10．l％，两者无显着性差异。而SENV的检出率分别为门刀％、0刀％，两者有显柠性差异；SENV利 TTV在健康人群中的检出率分别为0．0％和10．1％，两者有显着性差异；SENV和TTV在患病者中检出率分别为11．0％和15．8％，同时川性的检出率为3．8％，两者有显着性差异。SENV在ALT升高患者（非甲～非戊型肝炎患者、甲～戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿）和在川。T上常的患者（包括血．透患者、静脉毒痛者）中的检出率为14．0％、5．8％，两者有显着性差异；而TTV的检出率分别为 17．7＊、12．4％，两者无显柠性差异。将I！II性 PCR”TV片段、SEN VK片段、短片段被克隆至pGEM－T－Easy载体之中，分别命名为pGEM－TTV、PGEM－SENVL、PGEM－SENVS，选取经酶切鉴定的重组质粒，进行DNA序列分析。川 DNA Toolss．1和 DNAStar软件处理、分析数据。TTV DNA片段序列与 TTV1、A278原地（AB008394）卜较芬析的序列同源性为97．4％。叁个PGEM－SENV长片段和两个短片段进行测序，与SENV的序列（AX025667）比较分析，同源性分别为 87．7％、76．1％、88．2％、72．7％＄11 78．8％。 以上研究表明：首次发现我国存在 SEN VirSS散发感染，并且有与 TTV合并感染存在。SENV可能是一种重要病原体，临床检测SENV可能更有 2意义。我国存在不同于 SEN Virus（AX025667）的变异株；同一患者存在两种SEN V变异株的复合感染；SENV变异株其氨基酸序列与TTV家族成员有一定程度的同源性。
李喜升[2]2016年在《核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析》文中进行了进一步梳理柞蚕(Antheraea pernyi Guerin-Meneville,1855)属大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,是一种重要的经济昆虫,同时也是重要的模式昆虫。柞蚕幼虫全龄在野外柞园中饲养,其幼虫生长发育极易受到野外环境条件包括柞树叶质、气候环境因素以及多种病原微生物等影响,导致柞蚕病害的发生。研究表明,因柞蚕因病害造成的减产在20%-30%,柞蚕病害已成为制约柞蚕产业发展的主要影响因素之一。其中,柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害,其病原为柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyi nucleopolyhedro-virus, ApNPV),该病在世界养蚕业国家常有爆发,传染性极强,不易控制,在生产上危害最为严重,常造成巨大的经济损失。ApNPV感染既取决于自身的表型差异,又与宿主本身生理状况有关,是病原与宿主相互作用的过程。ApNPV入侵宿主体内后,利用宿主体内内环境中的营养物质完成自身的复制、增殖并释放。而柞蚕体内存在的免疫屏障面对病毒的入侵,会开启防御机制,通过细胞内的特异性变化来抵御病毒的增殖,这种变化首先体现在基因水平上,因此研究ApNPV感染后宿主基因的表达差异,可以从分子水平了解ApNPV侵染后宿主生理反应的分子生物学机制,对于阐明柞蚕被ApNPV感染后体内免疫相关基因的表达及调控模式具有重要意义,为进一步利用柞蚕免疫相关基因资源及利用分子生物学方法辅助抗病育种等奠定了基础。研究结果如下：1.柞蚕感染ApNPV后中肠转录组分析结果采用4.05×106多角体/mL的ApNPV对柞蚕3龄幼虫经口添食,提取经显微镜下确认ApNPV感染柞蚕幼虫中肠组织进行转录组分析,建立了ApNPV感染柞蚕的转录组数据库,为分析ApNPV感染后柞蚕基因表达规律提供了基础数据库。总共在ApNPV感染的柞蚕中肠中得到5,172个差异表达基因,包括2,183个上调基因和2,989个下调基因。生物信息学分析表明,筛选到参与柞蚕免疫反应的差异基因主要分为以下几类：与细胞凋亡相关的基因、热激蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶和细胞色素P450。对这些基因的分析为进一步探究宿主应对病毒感染的免疫分子机制提供了理论基础。2.柞蚕免疫相关基因—鸟苷叁磷酸酶基因(ApGTPase)的克隆与表达在柞蚕感染ApNPV的转录组数据库中筛选到了表达量上调的柞蚕鸟苷叁磷酸酶基因,利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术检测了鸟苷叁磷酸酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱,通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)、柞蚕链球菌(Streptococcus pernyi)3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,鸟苷叁磷酸酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势,结果表明：柞蚕鸟苷叁磷酸酶基因(ApGTPase)开放阅读框ORF长度1194 bp,编码397个氨基酸,推测其蛋白的等电点(pI)6.64,蛋白分子量(Mw)为44.6 kDa。与家蚕(Bombyx mori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、柑橘凤蝶(Papilio xuthus)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的鸟苷叁磷酸酶氨基酸序列相似度分别为95%,93%,93%,78%,表明该基因与同样来自鳞翅目昆虫的家蚕、棉铃虫和柑橘凤蝶的同源相似度较高,而与双翅目的黑腹果蝇相似度较低。在不同病原物诱导后的柞蚕中肠组织中鸟苷叁磷酸酶基因的相对表达量有不同程度的升高,并普遍高于对照组(无菌水处理组)的相对表达水平,表明鸟苷叁磷酸酶可能参与了柞蚕的免疫防御反应,可以作为柞蚕免疫基因资源利用。3.柞蚕免疫相关基因—脂肪酶基因(Aplipase)的克隆与表达分析根据柞蚕感染核型多角体病毒的转录组数据库,设计特异引物,克隆得到柞蚕脂肪酶基因(Aplipase),对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术构建了脂肪酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱；通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫、柞蚕链球菌3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,柞蚕脂肪酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势。结果表明克隆得到柞蚕脂肪酶基因(Aplipase)的cDNA序列,已知其开放阅读框ORF长度为1527bp,编码508个氨基酸。BLASTp比对可知,柞蚕脂肪酶基因与鳞翅目昆虫家蚕、大红斑蝶(Danaus plexippus)、柑橘凤蝶的脂肪酶基因同源序列相似度为79%左右。半定量PCR结果显示,脂肪酶基因在柞蚕5龄幼虫的脂肪体组织的表达水平较高；不同病原物经口添食柞蚕4龄幼虫,实时荧光定量PCR技术检测添毒后72 h内脂肪体中脂肪酶转录水平变化,柞蚕脂肪酶基因在柞蚕核型多角体病毒和白僵菌诱导条件下,转录水平变化趋势最显着,说明柞蚕脂肪酶基因在外源病原物的诱导下高表达,推测该基因产物与柞蚕的免疫防御有光,可以利用该基因或基因产物进行柞蚕免疫方面的研究。以上研究结果为深入理解ApNPV感染柞蚕后分子水平所发生的变化,揭示柞蚕-ApNPV之间的互作机制奠定了理论基础；对于更进一步研究柞蚕对不同病原物的免疫机制具有重要意义,参考免疫相关基因的表达水平可为抗性品种的选育提供理论指导。
徐丹雯[3]2016年在《H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究》文中研究说明禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类的病毒性传染病。H9N2亚型禽流感病毒是最常见的低致病性禽流感病毒,最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到,此后相继在世界其他地方被发现,并呈广泛流行的态势,危害持久不易控制,给养禽业造成严重的经济损失。值得注意的是,H9N2亚型禽流感病毒在家禽中偶尔会传播到哺乳动物中,包括人类和猪,也是97年香港禽流感感染人的H5N1禽流感病毒的内部基因的供体。因此,具有潜在导致新型流感的大流行。本试验从2011年起至2014年在本校附属动物医院以及活禽市场定期采集病料,对所采集的病料进行分离鉴定,并从每年所鉴定出的H9N2亚型禽流感病毒中各选取2株H9N2亚型禽流感病毒毒株,研究不同年间H9N2亚型禽流感病毒株之间抗原差异性以及生物学特性。1.H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定本试验在扬州大学动物医院以及江苏省扬州市活禽市场定期采集病料,对所采集的病料进行分离鉴定,对鉴定的H9亚型病毒,按照分离的年代,选择每年2株病毒制作鸡源高免血清和EIDso检测,测定分离株之间的交叉HI效价,分析分离株之间的抗原性关系。分离株与Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株多抗血清的H1检测结果显示,2011年至2014年的分离株大多与Ck/GD/SS/94和Ck/SH/F/98株的多抗血清的有较好的反应,表明大部分分离株的抗原性与Ck/GD/SS/94或Ck/SH/F/98的抗原性差异性不大；而分离株Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13与Ck/GD/SS/94株的多抗血清的HI效价小于8：分离株Ck/SD/C9QH/11株与Ck/SH/F/98株的多抗血清的HI效价小于8：表明Ck/HB/11、 Ck/JS/TM58/13和Ck/JS/JT95/13与Ck/GD/SS/94株、Ck/SD/C9QH/11与Ck/SH/F/98株的抗原性有显着差异；此外,交叉血凝抑制实验结果发现,大部分分离株与Ck/SD/C9QH/11和Ck/JS/JT95/13的血清不反应,而与2013-2014年分离株的多抗血清有较好的HI效价,表明近几年分离株的血清能够抑制早期的分离株,分离株的抗原性随着时间推移发生了变异。从病毒在MDCK细胞的TCID50的结果来看,大部分分离株与Ck/SH/F/98毒株的TCID50相似,而Ck/JS/ZJ618/12、Ck/YZ640/12和Ck/AH/WB/14毒株感染细胞的能力较弱,其机制有待进一步研究。2.分离株HA基因及部分分离株全基因序列分析为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化规律,本试验对分离的29株H9亚型禽流感病毒的HA基因进行测序和分析,同时选择其中的8株病毒进行全基因序列的测定测序。序列分析结果显示,29株分离株的HA基因都属于Ck/JS/1/00-like分支亚系,即Beijing/94-like分支；但又与Beijing/94-like存在一定的差异性,同时也能看出大部分浙江、山东、江苏来源的分离株都属于同一分支。分离株血凝素裂解位点335-338位的氨基酸序列大部分是R-S-S-R, Ck/JS/YZ150/12、Ck/JS/YZ667/12、Ck/HLJ/DD/11、Ck/HB/11 Ck/JS/JT12/11株的氨基酸序列为K-S-S-R,即为典型的低致病性禽流感病毒特征性序列；29株分离株大部分在HA蛋白含有8个潜在糖基化位点；与Ck/SH/F/98株的HA基因比较,近几年分离株在220位发生氨基酸了T→1或者T→V的变化：分离株HA基因的受体结合位点的7个关键性氨基酸残基中的190位氨基酸残基的变异频繁。本试验中所有分离株的234位氨基酸残基都是与Neu5Aca2-6Gal的受体结合特性有关的Leu。8个代表株中有7株的NA基因基本来自Beijing/94-like分支,并且NA基因氨基酸位点大部分高度保守,仅近年的分离株NA基因多了2个潜在糖基化位点。分离株的NP、NS、PB1基因属于Ck/SH/F/98-like亚系。M基因属于Qa/HK/G1/97-like亚系。PB2与PA基因属于G9/97-like亚系。Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/JS/TM71/14株的NP基因与Ck/JS/SC537/13(H7N9)株的同源性非常高,表明目前鸡源H9N2亚型禽流感病毒是G9-like、F/98-like和G1-like的重组体,并且是H7N9禽流感病毒内部基因的供体。3.分离株致病特性及其传播特性研究本实验拟将选择的8株H9N2亚型禽流感病毒毒株(Ck/SD/C9QH/11、Ck/JS/JT12/11、 Ck/JS/ZJ618/12、Ck/JS/YZ640/12、Ck/JS/TM58/13、Ck/JS/JT95/13、Ck/AH/WB/14 Ck/JS/TM71/14)和经典毒株Ck/SH/F/98进行致病性和传播特性研究。将120只3周龄的SPF鸡分为10大组,每组12只；其中一组为空白对照组,不接种任何病毒；其余9大组分别进行一株H9N2亚型禽流感病毒的致病性和传播特性的研究；每组中6只鸡,接种病毒作为攻毒组,3只鸡与攻毒鸡同笼饲养作为直接接触组,3只鸡置于距离攻毒鸡50 cm处的另一笼子饲养作为气溶胶传播组,不接种病毒；在攻毒组攻毒后第3、5天,对攻毒组、直接接触组和气溶胶传播组分别采集实验鸡的气管和泄殖腔棉拭子以分离病毒,同时对攻毒组鸡每次扑杀3只攻毒,取其气管和肺进行组织病理学的观察；结果发现,所选择的代表株对鸡都有气溶胶传播的特性；分离株在鸡气管中的复制能力都强于在肺组织中的复制能力,其中Ck/JS/ZJ618/12株比其余毒株在肺组织中的复制能力强；显微病理变化结果显示,2013年和2014年分离株感染鸡第5d比第3d的气管病理变化严重,而2011-2012年分离株感染鸡第5d比第3d的肺组织病理变化严重。结果表明,2011-2014年分离株对鸡都具有气溶胶传播特性；近3年分离株在气管中的复制和致病能力都强于在肺组织中的复制和致病能力,其分子机制还有待进一步研究。
梁丹洁[4]2014年在《广西猪嵴病毒的感染状况调查与基因序列分析》文中进行了进一步梳理本研究采用RT-PCR方法对从广西9个地市采集的猪肠样以及猪粪便样品进行了猪嵴病毒(PKV)的检测,从498份样品中检测出159份阳性,阳性率为31.9%,从阳性病料中挑选21株猪嵴病毒毒株进行完整的ORF基因测序分析。在这21株毒株中有14株毒株ORF全长7467bp,编码2488个氨基酸;有7株毒株在2B基因位置连续缺失90个碱基,ORF全长7377bp,编码2458个氨基酸。广西毒株的多聚蛋白的预测剪切位点与PKV标准毒株S-1一致。广西毒株的完整ORF框与猪嵴病毒的参考毒株进行同源性比对,发现这些毒株的核苷酸同源性为86.5%-90.3%,氨基酸同源性为93.0%-97.2%；与其他动物源性的嵴病毒相比,同源性最高的是羊源,核昔酸同源性为73.2%-74.1%,氨基酸同源性为77.0%-78.2%；而同源性最低的是人源,核苷酸和氨基酸同源性分别为57.9%-59.0%和60.6%-61.5%。分析猪嵴病毒各个基因片段,发现21株毒株与猪嵴病毒参考毒株核苷酸变异最大的是VP0,同源性仅为79.8%-89.7%,而突变最小的为3D,同源性高达91%-94%；氨基酸方面,氨基酸变化最大的是VP1,同源性为85%-98.4%,氨基酸变化最小的是2C,同源性为97%-100%。对21株猪嵴病毒关键位点的分析发现,位于3D区域3个关键氨基酸模体KDELR、YGDD和FLKR高度保守；2A区域I-box/NC氨基酸基序HWAL和NCTHFV以及2C编码的第131-138位的小RNA病毒解旋酶核酸结合区GPPGTGKS也未发生突变;3C蛋白氨基酸中组成H-D-C的小RNA病毒的催化叁联体的第43、86位和145位上的氨基酸以及参与胰蛋白样蛋白酶的基质结合过程的第163位氨基酸都高度保守。分析VP1基因的遗传进化关系,可以将猪嵴病毒分为4个群,广西毒株位于其中的3个群：日本、泰国毒株为主的Ⅰ群；匈牙利毒株为主的Ⅱ群；一些中国毒株为主的Ⅳ群。分析广西毒株的基因片段来源,发现GXPKV-7的VP1、3D和2B基因分别与参考毒株K-4、WB-1、XX株亲缘关系较近,而这些毒株分属于Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅳ群,表明GXPKV-7可能发生重组。
王静林[5]2010年在《云南省（中缅佬）边境地区虫媒病毒调查及病毒分子特征研究》文中认为本研究在我国云南省(中缅佬)边境地区开展连续两年的虫媒病毒调查,在采集到的蚊虫标本中分离到多株虫媒病毒,并利用血清学,分子生物学及生物信息学等理论与方法对本次调查中分离的病毒和在云南省分离的其他虫媒病毒进行了鉴定及分子特征研究,结果报告如下。1云南省(中缅佬)边境地区蚊虫种类及蚊传病毒调查本研究于2005年和2006年连续两年的夏季在中缅佬边境地区叁个自然村开展蚊虫媒介及虫媒病毒调查。在该地区共采集到4属(库蚊属、Lufzia蚊属、按蚊属和阿蚊属)17种蚊虫。各采集点优势蚊种分析显示,叁带喙库蚊是曼夕村(62.71%／1838／2931)和曼恩村(90.98%／5924／6511)的优势蚊种,中华按蚊是曼国村(67.11%／3544／5281)的优势蚊种。对采集到的14723只蚊虫标本分为152批常规处理,接种组织培养细胞(C6／36和BHK-21细胞)分离病毒。在当地采集的叁带喙库蚊标本中共分离到14株病毒(其他蚊虫未分离到病毒),分别隶属于4病毒科5病毒属6种病毒。病毒包括,披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)辛德毕斯病毒(Sindbis virus)(1株),黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)乙脑病毒(Japanese Encephalitis virus)(2株),呼肠孤病毒科(Reoviridae)东南亚12节段双链RNA病毒属(Seadornavirus)新东南亚12节段双链RNA病毒(Novel Seadornavirus)(1株)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)云南环状病毒(Yunnan orbivirus)(6株)和新环状病毒(Novel orbivirus)(1株)及细小病毒科(Parvoviridae)浓核病毒属(Densovirus)病毒淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens Densovirus)(3株)。在当地采集的不明原因发热和病毒性脑炎患者急性期血清标本中检测到乙脑病毒,辛德毕斯病毒,云南环状病毒,新环状病毒和新东南亚12节段双链RNA病毒IgM抗体,抗体总阳性率为36.1%(178／493),提示当地存在以上病毒的急性期感染。其中辛德毕斯病毒,云南环状病毒,新环状病毒和新东南亚12节段双链RNA病毒IgM抗体阳性均是在当地首次报道。提示在云南省(中缅佬)边境地区地区存在多种虫媒病毒,并可能是当地传染病致病病原体或潜在病原体。2.云南省新分离病毒分子生物学鉴定及分子特征研究利用分子生物学方法对20世纪80年代以来从云南省多种蚊虫、蝙蝠和病人标本中分离到的26株病毒分离物进行分子生物学鉴定。结果显示19株分离物为乙脑病毒,其中17株属基因Ⅲ型乙脑病毒,2株属基因Ⅰ型乙脑病毒；3株分离物为4型登革病毒,进一步分析表明这3株病毒均为基因Ⅰ型登革病毒；1株分离物为科萨努尔森林病病毒；其余3株病毒为泰勒病毒。3.我国蝙蝠分离乙脑病毒全基因组分子特征研究对分离自云南省蝙蝠的两株乙脑病毒进行了全基因组序列测定与分析,结果显示两株病毒全基因组全长均为10977nt,编码3432氨基酸。两株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性均高于99.9%。与国际基因库(GenBank)55株乙脑病毒全基因序列进行比较发现蝙蝠分离株与其他宿主来源分离株核苷酸序列同源性在88.6%(KV1899) -99.3%(Nakayama)之间,氨基酸同源性在97%(K94P05)-99.7%(JaGAr01)之间。分析还显示蝙蝠分离株与云南当地乙脑病例标本分离株Liyujie (1979)和蚊虫分离株BN19株(1982)处在同一进化簇,提示蝙蝠分离的乙脑病毒可能是当地乙脑病毒的保存宿主并参与当地流行性乙型脑炎的流行有关。这是国际上首次进行的蝙蝠分离乙脑病毒全基因组序列分析。4.云南省辛德毕斯病毒(MX10)株全基因组分子特征研究MX10病毒是在云南省中缅佬边境地区开展虫媒病毒调查时分离的病毒,经鉴定为辛德毕斯病毒。此后在实验室经病毒噬斑纯化得到噬斑形态具有明显区别的两个病毒株,分别命名为MX10-LP和MX10-SP。两病毒株在生物学及分子生学存在较大差异。MX10-SP病毒对BHK-21细胞感染能力比MX10-LP病毒低4倍；MX10-SP病毒在C6／36细胞上出现CPE时间比MX10-LP快48h。两株病毒接种1日龄乳鼠后,MX10-LP和MX10-SP病毒致死时间分别为4d和6d。病毒全基因组序列分析显示两株病毒全基因组(不包括5‘帽子结构和3’多聚A)均为11700nt,核苷酸同源性为99.9%。大小斑病毒基因组间存在7个核苷酸差异(5个氨基酸差异)。MX10-LP和MX10-SP与马来西亚原型株MRE16病毒全基因核苷酸同源性仅为91.3%,氨基酸同源性为98.1%。NS3基因分析结果显示,与Paleoarctic/Ethiopian和western/Australian genotype辛德毕斯病毒相比,Oriental/Australian genotype辛德毕斯病毒MRE16株在NS3基因插入了57个核苷酸,而MX10-LP和MX10-SP病毒则63个核苷酸。以上研究结果提示中国分离的辛德毕斯病毒(MX10)为澳大利亚东方型辛德毕斯病毒(Oriental/Australian genotype)与该基因型原型株(MRE16)相比在病毒生物学表型和分子生物特征均存在较大差异,表明Oriental/Australian genotype基因型辛德毕斯病毒可能存在多种分子差异的变异株。这是在我国首次发现的该基因型辛德毕斯病毒。5.云南省蝙蝠分离病毒的鉴定及其与疾病关系的研究对叁株分离自蝙蝠脑组织的病毒分离物(B90-121-125、B90-126-130和B8613)采用非序列依赖扩增(SISPA)和RT-PCR的方法进行分子生物学研究。初步鉴定结果显示叁株分离自蝙蝠的病毒与泰勒病毒DA株核苷酸同源性最高为94.7%,提示为泰勒病毒。B90-126-130病毒株全基因组须列分析,结果显示B90-126-130病毒基因组长8094 nt,编码2301 aa。与GenBank中46株脑心肌炎属病毒比较,B90-126-130病毒与泰勒病毒DA分离株全基因组序列同源性最高,核苷酸同源性均为90.3%,氨基酸同源性为96.4%,与其他8株泰勒病毒核苷酸同源性在86.9%-88%之间,氨基酸同源性在94.3%-96.3%之间。病毒脑内接种1日龄乳鼠,5天乳鼠发病死亡,B90-126-130病毒对乳鼠LD50为7.38。B90-126-130病毒不引起BHK-21、C6/36、Vero、MDCK和Tubli细等胞产生细胞病变,但在Tubli细胞第3代培养上清中病毒核酸检测阳性,其余4种细胞核酸检测阴性。此外,使用重组原核表达B90-126-130病毒VP1、3D和3ABC叁个基因蛋白,建立ELISA检测方法检测病人和蝙蝠血清中病毒抗体。结果显示在云南省西双版纳和德宏州地区采集的461份发热脑炎病人血清中,17.14%标本(79／461)为B90-126-130病毒IgM抗体阳性,43.82%(202／461)标本为IgG抗体阳性。同时在云南省德宏州采集的32份蝙蝠血清中有7份标本B90-126-130抗体检测阳性。本研究结果明确了在云南省蝙蝠中分离的叁株病毒均为泰勒病毒,该病毒仅能在蝙蝠来源的Tubli细胞复制和对乳鼠具有较强的神经毒力。此外还提示当地人群和蝙蝠中存在泰勒病毒感染,该病毒可能是引起当地不明原因发热和脑炎的病原体或潜在的病原体。本研究创新点及意义本研究首次在云南省边境(中缅佬)地区进行蚊虫媒介、虫媒病毒分布以及人群感染情况的综合性调查,在当地分离到大量虫媒病毒(其中多株为我国首次分离)并证明当地存在病毒感染,研究结果对于解释当地发热甚至病毒性脑炎的病因提供了重要的基础数据,具有重要的公共卫生意义。对当地多年来分离自多种蚊虫、蝙蝠和病人标本的26余株病毒分离物进行了分子生物学研究,明确了这些病毒在病毒学的分类地位及其与疾病的关系。以上结果极大地丰富了我国虫媒病毒的背景信息,为云南省及我国虫媒病毒病预防和控制以至于对虫媒病毒病的国际联防等均具有重要意义。
白娟[6]2012年在《靶向脑心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重组体构建与体内外抑制病毒复制作用》文中研究指明脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,可以感染昆虫、爬行动物、啮齿类动物和灵长类动物等。本病毒可引起仔猪的致命性心肌炎和母猪的繁殖障碍,对世界养猪业造成了较大经济损失。目前,我国猪群已经存在该病毒感染,但其流行状况尚不十分清楚,也无有效预防和治疗方法。本研究从我国中东地区患病猪群分离获得EMCV NJ08毒株,人工感染试验证实我国存在该病,并完成该病毒全基因序列分析,阐明我国EMCV流行毒株分子特征；同时,设计构建了表达靶向EMCV不同基因shRNA表达质粒,发现其在体外和体内可以有效抑制EMCV复制及其机制,并利用腺病毒介导shRNA技术探讨该病防治新策略,为该病防治提供了新手段。1.猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定本研究采集临床发病仔猪心脏组织,匀浆处理后接种BHK-21细胞,盲传3代出现细胞病变,分离获得一株病毒,病毒传代至第15-25代,病毒滴度稳定,TCID50为10-100～10-10-25/mL;采用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光；EMCV VP1基因RT-PCR检测为阳性,扩增产物基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因同源性为85.7%-99.8%；纯化病毒粒子负染电镜观察,大小约25-28nm,证明该分离病毒为EMCV,命名为EMCV NJ08株。该分离株接种MARC-145、HEK-293A和ST细胞系均出现明显CPE,病毒于56℃作用15min,感染滴度显着降低。将NJ08株接种BALB/c小鼠,可引起小鼠出现明显临床症状和心肌变性与脑炎等病变,免疫组织化学试验检测结果证明,脑组织含有EMCV抗原；商品仔猪人工感染NJ08株后未出现明显的临床症状及病理变化,但血清中出现EMCV特异性中和抗体,证明该分离株对小鼠具有较强的致病作用,表明我国猪群存在EMCV感染。2.猪脑心肌炎病毒NJ08分离株基因组序列测定与分析本研究根据EMCV基因序列,设计合成7对PCR引物,采用RT-PCR方法从EMCV NJ08分离株扩增获得5个基因片段,大小为1002-1580bp,同时,应用RACE方法,从该病毒株扩增获得其3’和5’基因末端两个基因,扩增产物经凝胶纯化后分别克隆于pMD18-T载体,进行基因测序,利用片段之间的重迭碱基序列顺序将这些片段序列进行拼接,获得EMCV NJ08株全基因组cDNA序列,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与GenBank中登录的国内外参考病毒株进行同源性比较及系统进化分析。结果为：EMCV NJ08分离株基因组全长7724bp；属于Ⅰa亚群；与GXLC、 GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上；EMCV流行株的非结构蛋白中3D最为保守,2A变异最大,结构蛋白中VP2最为保守,VP1变异最大,从而丰富了我国EMCV分子流行病学资料。3.脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立本研究分别针对EMCV NJ08株的1D和3AB基因设计合成了特异性的引物,通过反应条件的优化,利用SYBR Green Ⅰ染料建立了快速定量检测脑心肌炎病毒的实时PCR方法。通过检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV和FMDV的基因检测及融解曲线检测分析,结果表明两对引物实时PCR反应的熔解曲线具有唯一的尖峰,证明其具有较好的特异性。采用EMCV cDNA产物进行梯度稀释后作为模板进行检测,结果为：该方法对EMCV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50,敏感性比普通RT-PCR高100倍,并具有较好重复性。分别采用该法和普通RT-PCR方法检测10份EMCV人工感染的小鼠心肌、脑组织、5份EMCV人工感染仔猪血清样品及3份健康小鼠心脑组织和2份健康仔猪血清样品检测,其符合率为100%。表明该方法具有较高特异性和敏感性,同时具有更快速、准确、低污染等优点,可用于定量检测EMCV和该病诊断。4.靶向EMCV1D和3AB基因shRNA重组质粒构建及其体内外抑制EMCV复制作用本研究根据EMCV NJ08株基因序列(GenBank HM641897),采用计算机软件设计针对1D和3AB基因的4个siRNA靶序列,按pSUPER载体要求,合成了4对互补的寡核苷酸,分别体外退火形成双链,克隆至pSUPER载体,经Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定和基因测序,证明构建获得4个shRNA (short hairpin RNA)重组质粒(pSUPER-1D-1, pSUPER-1D-2, pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2).将其分别转染BHK-21细胞,观察其抑制EMCV NJ08复制及其机制,并以pSUPER-mN3(shRNA序列长度相同)为对照质粒,结果为：pSUPER-1D-1, pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2均能明显减轻EMCV引起的细胞病变(CPE). pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2转染细胞中EMCV>商度降低100-1000倍,pSUPER-1D-2或pSUPER-1D-1组病毒滴度降低10-100倍,EMCV VP1蛋白和3AB mRNA转录水平均明显降低(p<0.05)。选取90只4周龄BALB/c小鼠,随机分为6组,每组15只。第1-4组分别脑内接种重组质粒pSUPER-1D-1、pSUPER-3AB-1、pSUPER-3AB-2和pSUPER-mN3,第5组脑内接种ddH2O作为阴性对照,第6组为空白对照组。第1-5组接种后6h、12h和24h,分别每组随机选择5只小鼠,采用EMCV进行攻击,观察临床症状和死亡鼠病变,并于攻毒后14d,对存活小鼠全部剖杀,进行病理学观察,并用实时PCR方法检测小鼠脑组织中EMCV含量。结果为：与pSUPER-mN3组和攻毒对照组相比,pSUPER-VP1-1、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2组小鼠临床症状、脑和心脏组织病变程度明显减轻,病死率明显降低,表明靶向EMCV1D和3AB基因的shRNA可以有效减低EMCV靶基因转录、表达和病毒复制,降低EMCV对小鼠致病作用。5.靶向EMCV1D和3AB基因shRNA的重组腺病毒的构建与鉴定本研究以shRNA重组质粒pSUPER-1D-1、pSUPER-1D-2、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2为模板,利用RT-PCR扩增获得4个PH1-shRNA表达框,分别克隆至重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,然后与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,再将重组质粒经转染HEK-293A细胞,获得表达针对EMCV1D或3AB基因的shRNA重组腺病毒,命名为rAd-1D-1、rAd-1D-2、rAd-3AB-1和rAd-3AB-2,重组腺病毒接种HEK-293A细胞后,出现明显CPE,呈变圆和脱落,同时在荧光显微镜下出现特异性荧光。提取HEK-293A细胞中的病毒DNA,利用PCR和基因序列分析,证明重组腺病毒基因组内PH1-shRNA表达框内基因序列正确,证明构建获得靶向EMCV1D或3AB shRNA的重组腺病毒,为EMCV感染防治研究奠定了基础。6.腺病毒介导的靶向EMCV1D和3AB基因shRNA体内外抑制EMCV复制作用本研究将4个靶向EMCV1D (rAd-1D-1和rAd-1D-2)和3AB (rAd-3AB-1和rAd-3AB-2) shRNA重组腺病毒(rAd5)分别接种MARC-145细胞,并以rAd-G1重组腺病毒为对照,观察其对EMCV复制作用,结果为：与对照组相比,该4个rAd5可以明显抑制EMCV靶基因mRNA转录和蛋白表达水平及病毒复制滴度,而且这种抗病毒抑制作用至少能持续72h,并有剂量依赖性。rAd5接种已经感染EMCV的MARC-145细胞,可以部分抑制EMCV复制。选取96只6周龄BALB/c小鼠,随机分为6组,每组16只。第1-4组腹腔接种rAd-1D-2、rAd-3AB-1、rAd-3AB-2和rAd-G1(阴性对照),其中8只小鼠接种剂量为107.0efu/mouse,另8只小鼠接种剂量为108.0efu/mouse,12h后在每只小鼠腹腔注射200TCID50的EMCV NJ08株病毒液,第5组作为EMCV攻毒对照组,第6组只注射PBS作为正常对照组。攻毒后观察临床症状和病理变化,第21d,对存活的小鼠全部剖杀,观察病变,并用实时PCR方法检测小鼠脑组织中EMCV含量。结果为：第1-5组小鼠均表现出不同程度临床症状和肉眼病变,与rAdG1阴性对照组和攻毒对照组相比,rAd-1D-2、rAd-3AB-1和rAd-3AB-2接种组临床症状明显减轻,且出现时间大大推迟,其中,rAd-1D-2(1080efu/mouse)接种组小鼠存活率为87.5%,而对照组小鼠全部死亡；脑组织中病毒病毒含量明显降低。该结果表明,由重组腺病毒介导的shRNA能在体内外有效抑制EMCV的复制,并有效提供小鼠对EMCV攻击,从而为该病防控提供了新策略。
王俊亚[7]2013年在《河南省猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究》文中研究说明猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)为单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科A型流感病毒。A、B和C3型的流感病毒都可以感染猪，引起猪流感(Swine influenza,SI)的发生。目前世界各地流行的SIV主要有3种血清型，即古典H1N1，类禽H1N1，类人H3N2。由于猪体内呼吸道上皮细胞上同时存在唾液酸α2,3半乳糖(SAα2,3Gal)和唾液酸α2,6半乳糖(SAα2,6Gal)两种连接类型的受体，降低了猪的种间屏障，使得猪具有被禽流感病毒和人流感病毒感染的能力，从而成为禽和人流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重组或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株的孵育器。猪已经成为越来越多不同亚型流感病毒的“中间宿主”。多种不同亚型的流感病毒在我国猪群中长期共存，为产生重排病毒创造了条件，这将对养猪业以及人类公共卫生都具有潜在的威胁。这就赋予了SI在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有举足轻重的地位。国际学术界已普遍认为，通过猪可以产生在人群中有流行潜力的病毒株。因此猪流感的影响不仅在于其显而易见的兽医传染病学的意义，更在于其深远的公共卫生意义。本研究从河南省不同地区采集疑似猪流感的病猪鼻拭子，通过鸡胚传代分离病毒，经过血凝、血凝抑制试验及全基因序列测定最终分离到2株猪流感病毒，一株为H3N2亚型，另一株为H1N1亚型。根据流感病毒命名标准体系分别命名为A/swine/Henan/1/2010（H3N2）（SW/HN/1/10）、A/swine/Henan/405/2010（H1N1）（SW/HN/405/10）。为了了解这2株猪流感病毒分离株的分子流行特征，在全基因测序的基础上，与GeneBank上登录的相关参考毒株进行核苷酸及推导氨基酸全序列的同源性比较，并分析HA推导氨基酸蛋白裂解位点、受体结合位点、潜在糖基化位及NA推导氨基酸蛋白酶活性中心位点，二硫键位点、糖基化位点、抗原位点等的变异情况及其系统进化地位。SW/HN/1/10（H3N2）分离株共有8个片段，HA基因有1728个碱基组成，编码567个氨基酸。根据HA基因的核苷酸序列推导出其氨基酸序列，发现其裂解位点为PEKQTR↓G，不符合高致病力毒株的分子特征，提示该分离株为非高致病力毒株；SW/HN/1/10有11个潜在的糖基化位点,与A/Moscow/10/99、A/Sydney5/97、A/NewYork/333/99等经典人源谱系代表株一致。NA基因无氨基酸的插入或缺失，酶活性中心位点，二硫键位点、糖基化位点高度保守，抗原位点有变异。与GeneBank中登录的H3N2亚型人源、经典猪源和禽源SIV进行比较分析显示分离株的8个基因分别与人流感相关基因氨基酸的同源性均在98.5%以上；遗传进化分析表明：SW/HN/1/10的8个基因进化树均处于近代人源谱系Moscow/99-like亚系。由此推测，SW/HN/1/10可能来源于人源流感病毒株。SW/HN/405/10（H1N1）分离株共有8个基因片段，其中HA基因全长1701bp，编码566位氨基酸。根据HA基因的核苷酸序列推导出其氨基酸序列，发现其裂解位点为IPSIQSR↓G，与所有参考毒株的序列一致且没有碱性氨基酸存在。整个蛋白共有7个糖基化位点，其中SIV河南株与欧洲株(Sw/cd/1999)的糖基化位点完全相同，与国内广东株(Sw/gd/2001)香港株(Sw/hh/2001)及美洲株(Swlwi/1998)有叁个位点差异。NA基因全长1477Kb，共编码470个氨基酸。对SW/HN/405/10株NA基因推导的氨基酸序列进行分析发现，NA编码区没有氨基酸的丢失与插入，其酶活性中心，二硫键位点高度保守，但抗原位点有变异；NA基因共有6个潜在糖基化位点，其糖基化位点与A/swine/Hong Kong/NS62/2005、A/swine/Belgium/1/1998等类禽谱系代表株一致。与GeneBank中登录的古典的H1N1，类禽H1N1和季节性的H1N1人流感病毒进行比较分析显示分离株的8个基因分别与类禽H1N1流感相关基因氨基酸有较高的同源性（92.1％-99.4％）系统进化树分析结果表明：该分离株的的8个基因进化树均处于类禽型H1N1谱系。由此推测该分离株可能来源于类禽型H1N1猪源谱系。本研究在对分离自河南的两株不同亚型猪流感病毒全基因进行序列测定的基础上，对其遗传演化关系进行分析，从分子水平上探究该病毒的基因来源，为进一步系统的研究河南地区乃至全国SIV抗原变化积累实验数据，为我国的流感防控工作提供了科学依据。
何奇松[8]2012年在《广西马源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定与全基因组序列分析》文中提出本研究采用RT-PCR和血清学相结合的方法对从广西4个市采集的马肺组织样品和马血清进行H9N2亚型流感病毒的检测,从284份马肺组织样品接种鸡胚后收取的尿囊液中,检测出1份阳性,阳性率为0.35%；而检测的1110份马血清,H9N2亚型阳性有7份,阳性率为0.54%。应用鸡胚接种的方法分离出一株病毒,通过血凝抑制实验及对8个片段的全基因克隆及序列分析,鉴定为H9N2亚型流感病毒,将分离株命名为A/equine/Guangxi/3/2011(H9N2)(简称GX3株)对GX3株进行鸡胚半数致死量(ELD50)和1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)测定试验,其ELD50和ICPI值分别为10-643/0.2mL和0.09；经免疫效果试验证明GX3株具有较好的免疫原性；对GX3株各基因的关键位点分析发现,GX3株HA基因的氨基酸在第183、225、227及228位点处均非常保守,而在226位氨基酸为亮氨酸(Leu),具有受体SAa-2,6-Gal特异性；在HA裂解位点处含有2个碱性氨基酸,其HA1与HA2氨基酸裂解位点处的序列为RSSRGLF,具有典型的低致病性流感病毒裂解位点的氨基酸序列特征；PB2基因第627、701、714位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser),PB1-F2蛋白的第66位氨基酸为天冬酰胺(Asn),NP基因第319位氨基酸为天冬酰胺(Asn),NS1蛋白的第92位氨基酸为天冬氨酸(Asp),这些都说明GX3株为低致病性毒株。糖基化位点分析中,HA和NA基因均具有8个糖基化位点,其中HA在第313位氨基酸处比参考毒株多出一个糖基化位点,NA在第44位氨基酸位点处比参考毒株多出一个糖基化位点,而其余的糖基化位点均比较保守,没有出现明显改变。耐药性基因位点分析中,NA基因119E、151D、276E、292R、294N,表明GX3株对神经氨酸酶抑制类药物敏感；M2基因S31N,表明GX3株具有金刚烷胺类药物的抗性。通过系统进化树及核苷酸同源性分析可知GX3株各个基因片段的大体来源：PB2和M基因来源于G1-like亚系毒株,PB1、PA和NP基因来源于SH/F/98-like亚系毒株,NA基因来源于G9-like亚系毒株,HA和NS基因来源于BeiJing亚系毒株。可见,本研究的GX3毒株的基因片段来源于4个经典的H9N2毒株,组合成了一个新的基因型。
高亚东[9]2007年在《鸭肠炎病毒新基因的序列测定及其序列分析》文中进行了进一步梳理本实验研究主要以蚀斑纯化株DEV Clone-03的基因组未知序列为主要对象,在试验中主要采用Targeted gene walking PCR的方法是以一段己知序列为锚定起始点,采用特异性引物与非特异性引物相结合的方法扩增己知序列周围的部分未知序列,随着序列的延伸并根据其设计新引物,从而使己知序列不断延伸。我们在原有的基础上,对扩增体系的条件进行了优化,试图获得更快的扩增效率,初步摸索了大片断扩增的方法,来增加扩增效率。通过叁个阶段的扩增,一共获得了DEV Clone-03 28 240 bp准确的基因组序列,用长ORF分析法和系统进化分析的方法首次确定了17个完整的ORF。其中UL区扩增得到24 659 bp片段,从中预测到14个基因ORF,它们编码的多肽分别与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的UL8、UL9、UL10、UL11、UL12、UL13、UL14、UL15、UL16、UL17、UL18、UL19、UL20和UL21蛋白具有同源性,将这14个基因分别命名为DEV Clone-03的UL8、UL9、UL10、UL11、UL12、UL13、UL14、UL15、UL16、UL17、UL18、UL19、UL20和UL21 HSV-1同源基因,各基因ORF大小依次为2 271 bp、2 301 bp、1 170 bp、264 bp、1 341bp、1 575 bp、1 142 bp、1 947 bp、1 089 bp、2 055 bp、912bp、4 143 bp、822 bp、1 686 bp,编码氨基酸数量依次为756、766、389、87、446、524、383、648、362、684、303、1 380、273和561。US区扩增得到3 581bp的片段,从中预测到3个基因ORF,它们编码的多肽分别与MDV-1的蛋白具有同源性,将这3个基因分别命名为DEV Clone-03的MDV-1同源基因,各基因ORF大小依次为990bp、507bp和888 bp,编码氨基酸数量依次为329、168和295。除了UL20,其余基因均符合预计大小。在疱疹病毒中尤其是α疱疹病毒中UL8～UL21基因的排列规律相对保守。我们分析发现DEV Clone-03 UL8～UL21基因的排列与HSV-1和马立克氏病病毒血清1型(Marek's disease herpesvirus 1,MDV-1)同源基因的排列顺序相似,US区段与马立克氏病病毒血清1型(Marek's disease herpesvirus 1,MDV-1)同源基因的排列顺序相似,结合陈淑红师姐扩增鸭瘟病毒的基因序列,我们发现DEV基因组UL区段基因组成可能与马立克氏病疱疹病毒基因组UL区段基因组成相似。进一步对我们获得的序列综合分析,推测鸭瘟病毒的基因组结构与马立克氏病病毒血清1型(Marek's disease herpesvirus 1,MDV-1)的结构类似。对以上17个基因进行同源性分析,结果表明:DEV Clone-03与α疱疹病毒同源性较之与β疱疹病毒和γ疱疹病毒的同源性要高。进一步分析发现,UL区段这13个基因的转录与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)相同。在氨基酸系统发育进化树中,DEV Clone-03属于α疱疹病毒亚科,就UL8、UL9、UL10、UL12、UL13、UL14、UL15、UL18、UL19和UL20基因而言,DEV Clone-03与MDV更接近。因此,就UL8～UL21和US1～SORF3基因的综合序列分析而言,DEV Clone-03归属为α疱疹病毒亚科,与MDV更接近。因此预测DEV将来有可能归类为α疱疹病毒亚科的马立克氏病病毒属。当然,对于DEV归属的深入研究还需要大量的分子生物学资料和生物信息学为基础。总之,本研究使用targeted gene walking PCR方法和长片断PCR扩增的相结合,首次获得了鸭瘟病毒17个ORF的基因,这将为病毒基因组研究奠定基础,为DEV归属和致病性的深入研究提供资料。各个基因ORF核苷酸序列对基因的鉴定、基因产物的组成和功能的阐明具有重要的意义,特别是UL15、UL16、UL17、UL18和UL19核衣壳基因组的发现为研究鸭瘟病毒核衣壳结构奠定了基础。为完善的诊断方法的建立和基因工程疫苗的研制提供分子生物学依据,从而更好地进行鸭病毒性肠炎的防制。本研究通过对区段的病毒基因组的研究应用生物统计学的方法对这一段序列从多个角度和不同层次进行了分析,从基因的角度研究鸭瘟病毒在疱疹病毒中的遗传演化关系,提供了可能,为鸭瘟病毒的分类提供依据,为鸭瘟病毒的深入研究打下坚实的基础。
戴勇, 李体远, 彭保, 黄瑞芳, 王沙燕[10]2000年在《维持性血液透析患者输血传播性病毒感染状况及其基因分析》文中进行了进一步梳理目的研究维持性血液透析患者输血传播性病毒（ＴＴＶ）感染状况，及进行其部分基因序列分析。方法设计 ＴＦＶＯＲＦ１部分基因引物，巢式 ＰＣＲ检测 ８０例血液透析患者及 １２例血液透析工作人员血清标本，将ＰＣＲ产物克隆、测序分析。结果血液透析患者ＴＴＶ感染率为３５％（２８／８０），１２名工作人员中有１例呈ＴＴＶ阳性（８．３％）。与日本株相比较，本实验分离株ＴＦＶ ＯＲＦ１部分基因同源性为９６．７％，ＴＴＶ合并ＨＢＶ感染者８例（８％），合并ＨＣＶ感染者５例（６％）；ＴＴＶ与ＨＢＶ、ＨＣＶ同时感染者２例（２％）．ＴＴＶ阳性患者中，有输血史者占５７％。结论血液透析患者中存在严重的ＴＴＶ感染，血液透析工作人员亦存在ＴＴＶ感染，ＴＴＶ可以与ＨＢＶ、ＨＣＶ重迭感染，ＴＴＶ感染者可能与输血有关，但ＴＴＶ的非血液传播同样应引起重视，
参考文献：
[1]. TTV家族新成员SEN Virus感染状况和基因序列分析[D]. 范骏. 浙江大学. 2001
[2]. 核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析[D]. 李喜升. 沈阳农业大学. 2016
[3]. H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及其生物学特性研究[D]. 徐丹雯. 扬州大学. 2016
[4]. 广西猪嵴病毒的感染状况调查与基因序列分析[D]. 梁丹洁. 广西大学. 2014
[5]. 云南省（中缅佬）边境地区虫媒病毒调查及病毒分子特征研究[D]. 王静林. 中国疾病预防控制中心. 2010
[6]. 靶向脑心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重组体构建与体内外抑制病毒复制作用[D]. 白娟. 南京农业大学. 2012
[7]. 河南省猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究[D]. 王俊亚. 河南农业大学. 2013
[8]. 广西马源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定与全基因组序列分析[D]. 何奇松. 广西大学. 2012
[9]. 鸭肠炎病毒新基因的序列测定及其序列分析[D]. 高亚东. 新疆农业大学. 2007
[10]. 维持性血液透析患者输血传播性病毒感染状况及其基因分析[J]. 戴勇, 李体远, 彭保, 黄瑞芳, 王沙燕. 中华肾脏病杂志. 2000
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