【摘要】目的：观察胞外高浓度ATP情况下神经细胞的存活状态，探讨ATP对脑细胞活性的影响。方法：培养神经细胞按照加入ATP浓度对实验进行分组。用台盼蓝方法检测细胞的生存率，倒置显微观察细胞的形态，免疫荧光显微镜对视野内的细胞进行拍照。结果：于对照组相比不同浓度（3、6、9、12、15mmol/L）的ATP作用三小时均使神经细胞存活率明显降低，且成剂量依赖性。结论：胞外高浓度ATP能够诱导神经细胞凋亡，随着ATP浓度的升高细胞存活率明显降低。
【关键词】?腺苷三磷酸；神经细胞；细胞存活率
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）17-0350-02
1.材料与方法
实验对象：神经细胞
主要仪器及试剂：
1.1 主要仪器
无菌操作台、CO2恒温培养箱、离心机、倒置显微镜、免疫荧光显微镜、超净工作台、恒温水浴槽、精密电子天平、微量移液器、常用冰箱、深低温冰箱、计算机、细胞培养皿、细胞培养板（6孔）。
1.2 主要试剂
ATP、胚牛血清、双抗、胰酶、DMEM培养基、DMSO细胞冻存液、台盼蓝。
1.3 主要工作液体的配制
1.3.1胚牛血清：分装在四支试管中，每支10ml共40ml，其余放回零下20℃按需拿取，避免反复冻融。
1.3.2 DMSO细胞冻存液：DMEM完全培养基中加入20%的胚牛血清及10%DMSO，4℃保存。
1.3.3完全培养基：2%双抗+10%血清+90%基础培养基，等量分装两个50ml的离心管，4℃冰箱保存，短期内用完。
1.3.4 0.125%胰蛋白酶溶液的配制：胰蛋白干粉0.125克加入PBS100ml，轻轻摇晃至完全溶解，-20℃保存。
1.3.5 ATP溶液的配制：取ATP干粉1克融入2ml无菌三蒸水中配制成浓度为1mol/l，避光保存于-20℃。然后将其稀释成浓度为3、6、9、12、15mmol/L。
2.神经细胞的体外培养
神经细胞接种于培养箱，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。完全培养基为含浓度为20ng/ml的BFGF和EGF、2%B27、1%双抗、1%L—谷氨酰胺DMEM/F12(1:1)神经干细胞培养基。隔天30%换液，大部分神经丘直径100um左右以1:5进行传代。
3.研究方法
3.1?神经细胞的培养、传代。
3.2?细胞的培养
将细胞放在DMEM培养基的培养皿中放置在37℃、饱和湿度、体积分数5%的CO2条件下培养，2～3d传代一次实验均取对数生长期细胞。
3.3?细胞传代
弃去培养瓶内原有的培养液，用生理盐水冲洗培养瓶，洗去旧溶液加入0.125%的胰蛋白酶2ml溶解消化两分钟，两分钟后培养瓶放在倒置显微镜下观察细胞间隙表达并且观察到细胞松动并有裂纹，然后除去消化液加入少许完全培养基，适当吹打至细胞完全脱落，将细胞吸入到离心管中，然后用生理盐水反复吹打之后吸入到离心管中，将离心管中放入离心机800rpm离心八分钟，弃去上清液，加入新的培养液吹打，加入培养瓶中补足培养基，放在CO2培养箱中培养。
4.实验步骤
4.1 实验分组???
将细胞分为对照组、ATP组。对照组含4.356×104细胞，培养基中不含ATP；ATP组含正常密度细胞，培养基中ATP的浓度分别为3、6、9、12、15mmol/L。
4.2 台盼蓝检测细胞存活率
（1）台盼蓝染色实验原理
台盼蓝（Trepan?Blue)?是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。分子式：C34H24N6O14S4Na4，分子量：960.82，可溶于水（10mg/ml)。
实验原理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。?
（2）检测步骤
用移液枪移取10μl的上述细胞重悬液，加入EP管中，再加入10μl的台盼蓝溶液，用移液管混匀，平铺在玻片上，将玻片插入仪器里，用计算机观察细胞活性。
5.实验结果
ATP对神经细胞存活率的影响
台盼蓝法检测细胞存活率，设对照组细胞存活率为100%，3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L、15mmol/LATP组细胞存活率分别为72.13%、68.24%、62.75%、59.15%、48.33%，即随着ATP浓度增加，细胞存活率逐渐下降，都明显低于对照组，均有统计学意义。
ATP对成熟大鼠脑细胞存活率的影响
6.项目特色与创新点
6.1 实验条件下创造离体的损伤的神经细胞，主要是用ATP去诱导神经细胞损伤，建立了大脑神经细胞受损的模型，
6.2 已知BBG对脑细胞损伤作用的原理，运用自身对照和相互对照的实验方法去探索ATP对脑细胞损伤的作用。
7.小结
本实验成功制备了ATP损伤模型，观察了在不同的ATP浓度下外源性三磷酸腺苷对神经细胞的损伤作用，检测了细胞存活状态、细胞存活率，可以得出的结论是：高浓度的ATP可使培养的神经细胞活性降低，存活状态降低。
【参考文献】
[1]马洁，王娇娇，王璐，李新娟，王国红。H2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放《中国病理生理杂志》，2016，32（8）：1408-1412.
[2]沈慧，尹雅玲，等.外源性ATP诱导PC12细胞穿孔的行成[J].中国病理生理学杂志.2014，11（6）：705-721.
[3]王国红，郭直岳，尹雅玲，等.三磷酸腺苷对神经细胞的损伤作用及其机制[J].中国病理学杂志,2012,28(9):1597-1604.
论文作者:张远,罗文豪,王身吾,仝朋飞,刘瑜,郭美霞
论文发表刊物:《心理医生》2018年17期
论文发表时间:2018/7/19
标签：细胞论文; 神经细胞论文; 存活率论文; 培养基论文; 浓度论文; 损伤论文; 血清论文; 《心理医生》2018年17期论文;