（1.广东省深圳市南山区人民医院血液科 广东 深圳 518052）
（2.华中科技大学同济医学院协和医院干细胞研究与应用中心 湖北 武汉 430022）
【摘 要】目的：本研究探讨桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞HL60的诱导分化作用及其机制。 方法：以低浓度桂皮醛作用于体外培养的HL60细胞，流式细胞术(Flow cytometry，FCM) 检测细胞周期、细胞表面抗原表达，免疫印迹法检测 HL60细胞细胞周期相关蛋白CDC6蛋白表达，激光共聚焦技术检测HL60细胞CDC6蛋白细胞定位。结果：低浓度桂皮醛作用后HL60细胞表面粒细胞分化抗原CD11b表达增加，而CDC6蛋白表达下降，核内部分下降尤为明显。结论：低浓度桂皮醛诱导HL60细胞向成熟粒细胞分化。低浓度桂皮醛诱导HL60分化与细胞周期受阻，细胞周期相关蛋白CDC6表达下降有关。
【关键词】桂皮醛；HL60；分化；CDC6
【中图分类号】R379.4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0249-01
食用香料肉桂提取物的主要活性成分桂皮醛又称为反式桂皮醛，可对多种恶性肿瘤调亡发挥抑制增殖、诱导凋亡的效应[1-3]。我们前期研究显示：桂皮醛不仅可诱导白血病细胞凋亡，而且还可诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562向单核细胞分化[3-5]，有很好的应用前景。但是，桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞的分化研究尚未见报道。本实验观察桂皮醛诱导HL60细胞分化改变及探讨相关机制，以进一步研究桂皮醛抗白血病的机制。
1 材料和方法
1.1 实验对象与主要试剂 HL60细胞来自华中科技大学同济医学院协和医院干细胞研究与应用中心保存。桂皮醛（分子式C9H8O，分子量132.16，纯度大于95%，购自上海国药集团化学试剂有限公司）溶于二甲基亚砜，配成浓度为200 mmol/L贮存液，-20℃保存。藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）标记的抗人CD11b单克隆抗体（CD11b-PE）和异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocynate，FITC）标记的抗人CD14抗体（CD14- FITC）购自美国BD公司。四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethylrhodamineisothiocyanate, TRITC) 标记的抗人CDC6抗体(CDC6-TRITC)、兔抗人抗体CDC6单克隆抗体和兔抗人GAPDH多克隆抗体购自Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司。
1.2 细胞培养与分组 HL60细胞用RMPI 1640完全培养液在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞以2×105 /ml密度接种（台盼兰检测细胞活性大于98%）。实验组加入桂皮醛使终浓度为20 μmol/L，空白对照组加入等体积含二甲基亚砜的RPMI 1640(二甲基亚砜浓度与实验组相同，均<0.1%)，继续培养，用于以下实验。
1.3 细胞分化检测 细胞培养72h，收集各组细胞，CD14- FITC和CD11b-PE分别标记细胞，流式细胞仪检测。数据经CellQuest软件进行分析。
1.4 细胞周期检测 细胞培养72h，收集各组细胞，70%乙醇固定过夜。细胞周期染液（含PI 30μg/L, Rnase 5mg/L）重悬，4℃避光过夜，次日上流式细胞仪检测细胞周期分布。数据经CellQuest软件进行分析。
1.5 Western blot检测 细胞培养72h，收集各组细胞，提取细胞总蛋白。凝胶分离，转膜后加一抗4℃孵育过夜。一抗分别为兔抗人CDC6抗体和兔抗GAPDH抗体（释度均为1:1000），充分漂洗后，加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（，稀释度为1:1000），37℃孵育1h。充分漂洗后在化学放光试剂中反应5分钟，曝光，扫描胶片，输入计算机。
1.7 激光共聚焦检测 细胞培养72h，收集各组细胞，滴片，室温干燥，4%多聚甲醛固定 。0.5% Triton X-100 室温下破膜 10 min，洗片后加 CDC6-TRITC 抗体(稀释度 1:50)，4℃ 避光孵育 2 -3 h。洗片 ，甘油封片。激光共聚焦显微镜检测。
1.8 统计学分析 所有实验重复3次，实验数据以均数±标准差(x±sd ) 表示，采用SPSS 18.0软件包进行数据分析并t检验。认为P < 0.05时具有统计学意义。
2 结果
2.1 桂皮醛诱导HL60细胞分化抗原表达 用20μmol/L桂皮醛处理HL60细胞72h后，HL60细胞表面CD11b抗原表达增加，为（47.21±3.27）%，与对照组（3.55±1.52）%相比，差异有显著性（P < 0.01）。HL60细胞用桂皮醛处理前后细胞表面CD14抗原表达无明显改变。
2.2 桂皮醛对HL60细胞周期的影响 20μmol/L桂皮醛作用于HL60细胞72h后， G0/G1期细胞比例明显增加，达（43.16±3.63）%，与对照组（29.77±2.78）%相比，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 桂皮醛下调HL60细胞CDC6蛋白表达 HL60细胞经20μmol/L桂皮醛处理72h后，CDC6蛋白表达明显下降。（图1）
2.4 桂皮醛促使CDC6向核外转移 CDC6 在未经 TCA处理的 HL60 细胞中高表达,主位于细胞核内。而经低浓度 TCA(20 µM)处理后HL60细胞内 CDC6 表达明显下降，且主要位于细胞浆内（图2）。
3 讨论
白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤，白血病细胞增殖失控、分化障碍，停滞于细胞发育的不同时期。诱导白血病细胞凋亡和向成熟方向分化是当前白血病治疗的两个重要着力点。筛选安全有效的诱导分化剂和明确白血病细胞分化受阻机制是白血病诱导分化治疗的重要基础。
桂皮醛被美国食品药品管理局（FDA）证实为一般认为安全物质（Generally Recognized as Safe，GRAS）。既往研究发现，桂皮醛可抑制包括急性髓细胞白血病细胞株HL60在内的多种肿瘤细胞增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤特性[1-3]。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆我们前期研究发现较高桂皮醛诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562凋亡，较低浓度的桂皮醛可诱导K562细胞向单核细胞分化[4, 5]。在本研究中发现，经低浓度的桂皮醛作用后，HL60细胞表面的粒细胞分化抗原CD11b表达明显增多，而单核细胞分化抗原CD14表达无明显变化。这说明低浓度桂皮醛可诱导HL60细胞向成熟粒细胞分化。
细胞周期停滞是细胞进入分化的前提，多种分化诱导剂在诱导肿瘤细胞分化时会使肿瘤细胞周期受阻。HL60细胞经低浓度桂皮醛作用后，G0/G1期细胞比例明显增高，这说明低浓度桂皮醛诱导HL60细胞分化与细胞周期受阻有关，低浓度桂皮醛诱导的HL60细胞分化伴随着细胞周期受阻于G0/G1期。
细胞分裂周期蛋白6(CDC6) 是一个重要的细胞周期调节因子，具有原癌基因特性，与细胞的分化、凋亡和恶性侵袭性密切相关 [6-11]。包括急性髓细胞白血病细胞株HL60细胞和原代细胞在内的多种肿瘤细胞高表达CDC6。CDC6调控细胞分裂周期，对控制细胞从G1期进入S期发挥至关重要的作用，是HL60细胞分化的重要限速因子，G1期细胞阻滞与CDC6下调相关[12, 13]。我们研究发现，低浓度桂皮醛诱导HL60细胞分化，使细胞阻滞于G0/G1期的同时，可见HL60细胞CDC6表达减少，以核内减少为显著，提示CDC6由细胞核内并向细胞核外迁移。这说明TCA诱导的HL60细胞分化可下调癌基因CDC6表达，同时再次证实G1期细胞阻滞与CDC6下调相关。
综上所述，本研究中我们发现低剂量桂皮醛可诱导急性髓细胞白血病细胞发生分化，桂皮醛发挥诱导分化效应与细胞分裂周期蛋白CDC6表达下降和向核外转移相关。这为桂皮醛在血液学恶性肿瘤中的临床应用提供了新的实验依据。
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Fig.1 Cinnamaldehyde decreased the expression of in HL60 cells.
(a) HL60 cells without cinnamaldehyde treatment. (b) HL60 cells treated by 20μmol/L cinnamaldehyde for 72h.
Fig. 2 TCA leaded to decrease of CDC6 in HL60 cells.
(a) CDC6 is mainly localized within the nuclear in control sample. (b) CDC6 is mainly localized within the cytoplasm in HL60 cells with treatment by cinnamaldehyde. (c) Phase contrast of (a). (d) Phase contrast of (b).
作者简介：
刘黎琼(女，1975年生，湖北武汉人) 医学博士（内科学血液学专业），副主任医师 工作单位:深圳市南山区人民医院 血液科 518052
通讯作者：
刘黎琼，副主任医师。E-mail: llqwsp@hotmail.com
深圳市科技计划项目（项目编号：201303188）
深圳市南山区政府科技计划项目（项目编号：2010003）
论文作者:刘黎琼, 刘伟, 陈祥俊, 张佳华
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/22
标签：细胞论文; 桂皮论文; 诱导论文; 白血病论文; 周期论文; 蛋白论文; 抗体论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿论文;