高琨[1]2001年在《雌、孕激素对卵巢癌细胞株体外生长的影响及其机制研究》文中指出目的 探讨17-β雌二醇、孕酮对卵巢癌细胞株体外生长、细胞周期及细胞凋亡的影响，了解雌、孕激素作用后卵巢癌细胞雌、孕激素受体的表达以及TGF-α表达的变化。方法1采用MTT比色法、细胞记数及流式细胞术，观察卵巢癌细胞株HO8910、PE04和PE014在加入不同浓度雌、孕激素作用后细胞生长及细胞周期的变化；2采用免疫组化方法、RT-PCR测定卵巢癌细胞在雌、孕激素作用前后雌、孕激素受体蛋白和mRNA表达的改变；3采用流式细胞术、DNA琼脂糖电泳及TUNEL法分析雌、孕激素对卵巢癌细胞凋亡的影响；4采用Western Blot方法检测雌、孕激素作用后卵巢癌细胞TGF-α蛋白表达的变化。结果1、17-β雌二醇作用24小时后，对叁种卵巢癌细胞株未发现明显的增殖影响。48小时后浓度为1×10~(-6)～1×10~(-5)mol／L对卵巢癌细胞株HO-8910增殖有抑制，抑制率分别为25％和35％，与对照组比较差异有显着性P<0.05～0.01。72小时后，雌激素对卵巢癌细胞株HO-8910增殖作用较稳定，显示明显的剂量-效应依赖关系，当17-β雌二醇浓度为1×10~(-6)～1×10~(-5)mol／L对肿瘤细胞增殖的抑制率分别为15％和40％，与对照组比较差异有显着性P<0.05-0.01。2、孕酮对叁株卵巢癌细胞有抑制作用。对卵巢癌细胞株HO-8910生长48小时后，影响较大，在浓度1×10~(-10) m一旧一 IX 10人IX 10－5 nlfLlfL，细胞受到抑制，抑制率分别为 N、 IB7． PA 1648K、IH和268sK，与对照组比较差异有显着性，P＜0刀sic．of， 继续作用至72小时，抑制率没有增加。孕激素对PE04和PEOI4有抑制 作用，聊制率随孕酮鞭增加而升高，与对照组比较差异有显着性意 义，在5xl沪moVL浓度时，抑制率分别为85．75％和m．2％，P＜ 0刀5－0．of；3、17小雌二醇与孕酮昭对卵髓细腑Hry8910 生长 的作用，48小时后，影响较大，在浓度 IX 10“ 11milL、！X 10AilX 10－5 mow，细胞受到抑制，抑制串分别为27．26％d．58％J4．刀％和26．STh， 与对照组比较差异有显着性，P＜0．05to．of，继续作用至R小时，抑制 率没有增加；4、My法检测雌、·孕激素对卵巢癌HO8910细胞生长ZI 天的影响在浓度为10－’mow时出现明显的抑制，最终抑制率达到” 71．51椰68．04％，P＜0．of，雌、孕激素鹏作用在浓度为10’mow时 出现明显的抑制，最终抑制率达到66．77O／，P＜0刀卜5、细胞直接计数 法检测雌、孕激素对卵巢癌 PE04和 PE014细胞生长 20天的影响，17－ p雌二醇刺激PE则细胞生长，在5xl炉＿W 17小雌二醇刺汲生长的 作用最强，且呈剂量－效应依赖关系。17F雌二醇16 xl沪＿W时分 别刺激＊＊M细胞增长了2m瓜和39．6％，P＜o．05；不同浓度17．p雌二醇 轻度抑制PEO 14细胞生长，与对照组比较无显着性差异，P＞0．05。不同 浓度孕酮抑制PE04和PEOI4细胞生长，且呈剂量－效应依赖关系。在5 X 105 mow孕酮抑制生长的作用最强，与对照组比较有显着性差异， P＜0．05。孕酮 l－5 X 10’mow时对 PE04细胞抑制率分别为 19．3蛐 35．4％，P＜005，对PE 014细胞抑制率分别为28．引《和37．6％，P＜005； 6、17．8雌H醇、孕酮作用前后免疫组化方法测定卵巢癌细胞HO8910 雌、孕激素受体表达无明显改变，RT－PCR测定卵巢癌细胞PE04和PE014 的 ER a、ERp及 PR InRNA表达无明显改变；7、流式细胞仪检测结果 3 显示，孕酮导致PE04和PE014在S期滞留，而17－p雌H醇不会导致 pE04和 PE014在 S期滞留；8、高浓度 5 X 10’mowl7小雌H＄作用 下可以诱导 PE014细胞凋亡出现，细胞凋亡率为 14．STh；与对照（．55％） 相比较，差异有显着性，P＜0．of。不同浓度孕团作用下PE04和PE014 细胞锨以发蝴亡，高浓度的孕酮作用下PE04和PE014细胞凋亡率 分别为 28．smp 29．sl．，与对照组比较差异有显着性，P＜0．05。DNA 琼脂糖电泳分析法及TU’NEL检测均未发现雌、孕澈素可以诱导卵巢癌 细胞HO8910产溯亡；9、Ww B呐 的方法检测外源住 I7 P雌Hgn以增加PE04细胞株中TGF－a蛋白表达，但是不影响PEO！4 细胞株中 TGF a蛋白表达；外源性孕酮可以降调节 PE04和 PE014细 胞中TGFd蛋自表达。结论1雌激素对卵巢癌细胞的作用与细胞的病 理类型及激素受体有关；2雌、孕汲素联合对卵巢癌细胞有抑制生长的 作用；3孕激素可以影叼卵巢癌PE04、PEO 14的细胞周期，产生S期滞
张媛, 杨元先[2]2003年在《雌、孕激素对卵巢癌细胞株体外生长的影响》文中认为目的 观察 17β 雌二醇 (E2 )、E2 与黄体酮 (P)联合应用对人上皮性卵巢癌细胞株A2 780体外生长的影响。方法 分对照组和实验组 ,用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法计算细胞生存率 ,用流式细胞术测定细胞周期。结果 ①浓度为 0 1～ 5 0nmol/L的E2 可抑制卵巢癌细胞株的生长 ;加入浓度为 5 0nmol/L的P后这种抑制作用增强。②浓度为 0 1～ 5 0nmol/L的E2 对卵巢癌细胞株细胞周期有影响 ;G0 /G1期细胞由 5 7 11%增加到 71 99% ,S期细胞由 32 39%减少到 2 0 5 5 % ,加入浓度为 5 0nmol/L的P后 ,细胞周期进一步发生变化 ,G0 /G1期细胞由5 7 11%增加到 77 39% ,S期细胞由 32 39%减少到 15 80 %。结论 雌激素对卵巢癌细胞株A2 780的增殖具有抑制作用 ,并呈现剂量 效应关系。雌、孕激素联合应用可增强这种抑制作用
谢玉莲, 韩克, 唐琛, 盛慧娟[3]2014年在《雌、孕激素和促性腺激素对卵巢癌细胞存活率、Bcl-2和Bax表达的影响》文中研究表明目的:研究雌(E)、孕激素(P)及人绒毛膜促性腺激素(HCG)对卵巢癌细胞存活率以及Bcl-2、Bax表达的影响。方法:采集卵巢癌患者术中切除的组织标本进行细胞培养,按药物作用不同分为3组:雌激素组(E组)、孕激素组(P组)、人绒毛膜促性腺激素组(HCG组)。MTT法和流式细胞技术检测细胞凋亡率与细胞周期;药物作用48h后,荧光定量PCR法进行相对定量,检测雌、孕激素对癌细胞Bcl-2、Bax表达的影响。结果:(1)高浓度(10-4mol/L)雌、孕激素能降低癌细胞的存活率,呈时间-剂量依赖性(P<0.001);低浓度(<10-8mol/L)雌激素能提高卵巢癌细胞的存活率。低浓度(50U)HCG对卵巢癌细胞存活率的影响不明显。150U/ml和200U/ml HCG作用72h后,对卵巢癌细胞存活率的影响显着(P<0.05)。(2)高浓度(10-4mol/L)雌、孕激素能促进卵巢癌细胞凋亡(P<0.001),但当雌激素浓度为10-8mol/L时,却抑制细胞凋亡(P<0.001);HCG对卵巢癌细胞凋亡率的影响无显着差异。雌、孕激素和HCG对卵巢癌的细胞周期均无显着影响。(3)高浓度雌、孕激素(10-4mol/L)能抑制卵巢癌细胞Bcl-2的表达(P<0.05),促进Bax的表达(P<0.001);低浓度E(10-8mol/L)上调Bcl-2的表达(P<0.001),下调Bax的表达(P<0.001)。结论:高浓度雌激素与孕激素对体外培养的卵巢癌细胞有促进凋亡、降低存活率的作用,这可能与下调Bcl-2的表达和促进Bax的表达有关。
栗宝华[4]2003年在《叁苯氧胺与甲孕酮对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP生长的影响》文中研究指明卵巢癌是妇科叁大恶性肿瘤之一，起病隐匿、恶性度高，完善的肿瘤细胞减灭术和术后辅以铂类为主的一线化疗是当前治疗卵巢癌的主要手段。但由于一线化疗后顺铂耐药的存在造成卵巢癌患者五年生存率较低，仅为30％左右。对铂类耐药的卵巢癌治疗是当前研究的热点。近些年来，流行病学、实验研究已证实卵巢癌是激素依赖性肿瘤，激素在卵巢癌的病因和辅助治疗中发挥重要作用；又有研究发现高浓度的雌、孕激素在体外可抑制卵巢癌耐药细胞株OVCAR-3细胞生长，并增加阿霉素对癌细胞的杀灭作用，但激素对耐药的卵巢癌细胞作用机制如何，目前国内外报道较少。叁苯氧胺(tamoxifen，TAM)为雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂，可通过与雌激素竞争受体抑制肿瘤细胞增殖；甲孕酮(medroxyprogesterone，MPA)为合成类孕激素，可通过孕激素受体(progesterone receptor，PR)抑制雌激素受体、孕激素受体阳性的卵巢癌细胞株生长。本文旨在：1．研究叁苯氧胺和甲孕酮单独、联合及序贯用药对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP生长的影响，并探讨其作用机制，以期为临床顺铂耐药患者提供新的辅助治疗方案。2．因SKOV-3/DDP细胞株存在雌激素受体变异，对其研究以探讨激素对存在受体变异的卵巢癌细胞株的作用机制。 方法 1．用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析法测定细胞增殖情况，2．用电子显微镜观察细胞超微结构的形态学变化，3．用流式细胞仪测定细胞周期分布及凋亡率变化情况。以比较不同浓度的TAM和MPA单独、联合及序贯用药对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP生长的影响。 结果 1．用不同浓度(1×10~(-10)～1×10~(-4)mol/L)的TAM作用于SKOV-3/DDP细胞48小时后，低浓度(1×10~(-10)～1×10~(-7)mol/L)时细胞生长未受影响，高浓度(1×10~(-6)～1×10~(-4)mol/L)时，TAM可使G_0/G_1期细胞增加，S+G_2/M期细胞减少，而抑制肿瘤细胞增殖，且随着浓度增加，在抑制细胞增殖的同时，诱导细胞凋亡，与对照组及组间比较，差异均有显着性(P<0.01)。2.不同浓度(1 xl护0-1 xl少mo比)的MPA作用SKOV一3月ODP细胞48小时后，各浓度对细胞生长均无影响，与对照组比较，无显着性差异(P>0.05)。3.不同浓度(l x10-’0~1 x 10闷m。比)的TAM和N田A联合用药，低浓度(l x 10-10-1 xlo一b。比)时对细胞生长也无影响，高浓度(1 xlo气1 xl丫m。比)时可抑制细胞生长，且其抑制细胞生长能力较单用TAM组为强，组间比较，差异有显着性(P<0 .05)。4.1 x 10)山。比的TAM作用24h后再序贯使用各浓度的NJA，高浓度(l x 10一s一1 x 10闷m。比)时抑制肿瘤细胞生长，且其抑制细胞生长能力可被孕激素受体拮抗剂米非司酮拮抗。 结论提示: 1.TAM对卵巢癌耐药细胞株SKOV一3心DP是通过受体外机制发挥抗癌作用。 2.N[PA对卵巢癌细胞生长的影响需要功能性ER、PR的共存。 3.TAM和N田A联合及序贯用药对SKOV一3心DP生长的影响可能是通过抗UER和P用R系统而发挥作用。 4.1人M和N田A联合及序贯用药对顺铂耐药的卵巢癌细胞株生长有抑制作用，且因其较小的副作用及肯定的临床意义有可能成为卵巢癌患者化疗有效的辅助用药。
唐琛[5]2012年在《性激素与促性腺激素对卵巢癌SKOV3、OVCAR-3细胞体外生长的调控及其机制的研究》文中提出目的：卵巢癌的发病机制尚不明确,生殖激素对卵巢癌发生发展的影响一直存在争议,本实验研究生殖激素对卵巢癌细胞株的作用及可能机制,为探讨生殖激素在临床对卵巢癌的发生发展和对预后的影响、内分泌辅助治疗提供理论依据。方法：将不同浓度雌激素(E)、孕激素(P)、人绒毛促性腺激素(HCG)作用于卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR-3,采用不同的实验方法观察细胞株的生长状况：(1)细胞增殖实验：利用四甲基偶氮唑兰(MTT)比色法检测细胞在24、48、72h的增殖情况；(2)流式细胞术检测用药后细胞早期凋亡率及细胞周期的改变；(3)实时荧光定量PCR检测两细胞株雌激素受体(ERα、ERβ)、孕激素受体(PRA、PRB)、人绒毛促性腺激素受体(LHCG) mRNA表达的差异,及用药后各组细胞EGFR、Bcl-2、Bax mRNA的表达情况。结果：(1)各浓度的P和浓度为10-4mol/L的E对卵巢癌SKOV3、OVCAR-3细胞增殖均有抑制作用,且该抑制作用呈现时间、剂量依赖性,各浓度的HCG和浓度≤10-6mol/L的E对细胞增殖有促进作用,促进作用呈时间依赖性；(2)流式细胞术检测细胞周期发现：10-4mol/L P作用SKOV3细胞72h后大量细胞阻滞在G0/G1期,10-4mol/L的E作用SKOV3细胞72h后细胞周期分布以S期为主,浓度为750U/ml的HCG和10-6mol/L的E作用细胞72h细胞周期分布G2/M期略增多；(3)流式细胞术检测细胞凋亡发现：浓度为10-4mol/LP和10-4mol/L的E可促进SKOV3细胞凋亡,与对照组相比差异显着(P<0.05),用药48h凋亡率分别为20%和50%；(4)ERa高农达的细胞株SKOV3对各浓度E的作用效果比低表达的OVCAR-3细胞更明显,PRB/PRA的比值高的细胞株OVCAR-3对各浓度P的作用效果较比值低的SKOV3细胞表现更显着,LHCGR高表达的和低表达的SKOV3用各浓度HCG48h后与对照组相比增殖显着,OVCAR-3增殖更显着(P<0.01),刚药72h两细胞株均增殖显着(P<0.01),且两细胞株存活率无明显差异；浓度为10-4mol/L的P和10-4mol/L的E作用SKOV3细胞72h,其EGFR、Bcl-2mRNA表达量与对照组相比显着下调(P<0.01),Bax mRNA上调无统计学意义；浓度为750U/ml的HCG和10-6mol/L的E作用细胞72h其EGFR、Bcl-2mRNA表达量均上调显着(P<0.05),BaxmRNA上调无统计学意义。结论：P和高浓度的E能抑制卵巢癌细胞的增殖,其机制可能是通过将细胞阻分别阻滞于G0/G1期、S期,下调EGFR和Bcl-2的表达而诱导细胞凋亡来实现的。HCG和低浓度的E能刺激卵巢癌细胞的增殖,其机制可能是通过上调EGFR和Bcl-2的表达而抑制细胞凋亡来实现的。ERα可能为E作用于卵巢癌细胞的主要受体；P可能主要通过PRB来发挥其抑制卵巢癌细胞生长的作用；LHCG除了通过LHCGR作用于卵巢癌细胞外还可能通过其他途径。
梁军, 张际绯, 穆寅东, 刘瑞丰[6]2006年在《雌、孕激素对卵巢癌细胞株HO-8910体外生长的协同抑制作用》文中研究表明目的:探讨雌激素和孕激素对卵巢癌细胞是否具有协同抑制作用。方法:用光镜观察不同浓度的雌、孕激素各单独和联合作用72 h时,癌细胞的生长状况,并采用细胞凋亡检测和电镜观察。结果:雌、孕激素作用浓度分别达到1 800 ng/ml、900 ng/ml时,联合作用组与其他各组比较有显着性差异;当浓度分别是2 200 ng/ml≤E≤3 800 ng/ml、1 100 ng/ml≤P≤1 900 ng/ml时,联合作用组与其他各组比较,孕激素单独作用组与对照组比较都有显着性差异,雌激素单独作用浓度达到3 000 ng/ml≤E≤3 800 ng/ml时与对照组比较有显着性差异。结论:高浓度雌、孕激素对卵巢癌细胞株HO-8910的生长有协同抑制作用,呈剂量依赖效应。
樊明英[7]2009年在《雌激素联合顺铂对卵巢癌细胞株HO-8910体外生长的影响》文中提出目的探讨17-βE2联合顺铂对卵巢癌细胞株HO-8910体外生长、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法1.采用MTT法检测雌激素单用及合用顺铂对细胞增殖的影响。2.流式细胞仪分析不同浓度雌激素及联合顺铂对细胞周期和凋亡的影响。3.光镜、激光共聚焦显微镜观察雌激素及雌激素联合顺铂对细胞形态的影响。结果1.人卵巢癌细胞HO-8910形态学变化(1)倒置显微镜观察:对照组和雌激素组卵巢癌细胞生长状态良好,细胞伸展,呈铺路石状,随时间推移,细胞渐增多,细胞接触紧密。雌激素联合顺铂组卵巢癌细胞24h时见到细胞数目较少,但形态尚可,随时间推移,细胞浆内出现空泡,培养至72h时,细胞明显皱缩,体积变小,细胞间隙增大,培养液内可见少量细胞悬浮,部分细胞可见碎裂的细胞核,而胞浆仍完整。(2)激光共聚焦显微镜观察:对照组可见极少量凋亡细胞,顺铂组,雌激素组与对照组无明显差异。雌激素与顺铂联用组出现大量典型的凋亡细胞,细胞膜染色明显增强,荧光更为明亮,强度深浅不一。2.顺铂、17-βE2及两药联合对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖、凋亡的影响(1)17-βE2对卵巢癌细胞株HO-8910增殖的抑制作用:17-βE2作用24h后HO-8910细胞生长轻度增殖,但无显着性差异(P>0.05);48h后浓度为10×10-9～50×10-9mol/L对细胞增殖有促进作用,增殖促进率分别为22.8%和26.5%,与对照组比较有显着性差异(P<0.05);72h后17-βE2作用较稳定,各处理组与对照组比较无显着性差异(P>0.05)。(2)17-βE2联合顺铂对卵巢癌细胞HO-8910增殖的抑制作用:17-βE2联合顺铂作用24 h后HO-8910细胞生长轻度抑制, 50×10-9mol/L浓度对细胞增殖有明显的抑制作用,有显着性差异(P<0.05);48 h后5×10-9mol/L-50×10-9mol/L浓度对细胞增殖均有抑制作用, ,且随着浓度的增加,增殖抑制率升高,与对照组比较有显着性差异(P<0.05)和极显着性差异(P<0.01);72h后作用较稳定,各处理组与对照组比较均有显着性差异(P<0.05)。(3)17-βE2联合顺铂对卵巢癌细胞HO-8910增殖的增效作用:顺铂联用1×10-917-βE2表现为相加作用(0.85<q<1.15),顺铂联用5×10-9,10×10-9,50×10-9 17-βE2表现为协同作用(q>1.15)。3.顺铂、17-βE2及两药联合对人卵巢癌细胞株HO-8910细胞周期及凋亡率的影响:(1)经流式细胞仪检测,人卵巢癌细胞HO-8910细胞周期分布发生改变,与对照组比较,雌激素组S期细胞比例上升,凋亡率下降;顺铂组G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,凋亡率上升。雌激素联合顺铂组S期细胞比例进一步下降,凋亡率明显上升,与对照组和顺铂组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)Annexin-V/PI染色法检测细胞凋亡,结果显示:①不同浓度的17-βE2作用下卵巢癌细胞HO-8910的细胞凋亡率分别为6.3%,6.0%,5.6%和5.1%与对照组(6.1%)相比较,差异无显着性,P>0.05。提示任何浓度的17-βE2均不能诱导卵巢癌细胞HO-8910产生凋亡。②顺铂作用下卵巢癌细胞HO-8910的细胞凋亡率为15.6%,与对照组(6.93%)相比较,差异有显着性,P<0.05。③不同浓度17-βE2联合顺铂作用下,卵巢癌细胞HO-8910的细胞凋亡率分别为16.8%,29.7%,31.2%,44.0%,与对照组(6.93%)相比较,差异有显着性,P<0.01。结论1.17-βE2不能诱导人卵巢癌细胞HO-8910发生凋亡,低浓度对卵巢癌细胞无作用,高浓度对细胞有明显的促进生长作用,提示在卵巢癌患者,给于低剂量激素替代治疗,不会增加卵巢癌的复发。2. 17-βE2联合顺铂可改变细胞周期的分布,使G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,协同抑制卵巢癌细胞HO-8910的增殖、促进其凋亡。提示雌激素与顺铂联用可提高顺铂的敏感性,增强化疗作用。3.卵巢癌术后病人给予低剂量雌激素可改善生命质量。
胡辉[8]2011年在《雷公藤内酯醇对耐顺铂人卵巢癌细胞体外活性影响及机制的探讨》文中进行了进一步梳理目的：进一步研究雷公藤内酯醇(TP)对耐顺铂人卵巢癌细胞株(COC1/DDP)的体外活性的影响,初步探讨TP对COC1/DDP体外活性影响的机制及COC1/DDP细胞株的耐药机制,为TP成为治疗晚期或耐顺铂卵巢癌的药物提供实验依据。方法：1.COC1/DDP细胞传代培养：COC1/DDP细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,将细胞密度调整至5×105/ml,置培养瓶中,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养。待细胞至对数生长期,吹打制成单细胞悬液,1000r/min,离心10min,弃上清液,更换培养基,按每瓶以5×10-5/ml密度补充液体容量至7ml接种到培养瓶内。2、MTT法检测顺铂(DDP)对COC1/DDP细胞增殖的影响：研究分实验组7个：分别含(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40)μg/ml DDP,并设空白对照组1个(只含COC1/DDP细胞完全培养),其分别作用COC1/DDP细胞24h、48h、72h之后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测每孔光吸收值(OD值)。结果可反映DDP对COC1/DDP细胞增殖的影响,同时计算DDP对细胞的抑制率及IC50值。3、MTT法检测TP对COC1/DDP细胞增殖的影响：研究分实验组8个(阴性对照组、顺铂组、低浓度TP组、低浓度TP+顺铂组、中浓度TP组、中浓度TP+顺铂组、高浓度TP组、高浓度TP+顺铂组)及空白对照组1个,其分别作用于COC1/DDP细胞24h、48h、72h之后用MTT比色法检测每孔OD值,同时计算TP对COC1/DDP细胞的抑制率4、光镜和电镜观察TP对COC1/DDP细胞形态及超微结构的影响：通过倒置光学显微镜及透射电子显微镜观察空白对照组和中浓度TP组(10ng/ml)分别作用COC1/DDP细胞24h后COC1/DDP细胞的形态和超微结构的改变。5、流式细胞术检测TP对COC1/DDP细胞凋亡率和细胞周期的影响：取对数生长期COC1/DDP细胞细胞,用流式细胞仪检测空白对照组、低浓度TP组(3ng/ml).中浓度TP组(10ng/ml)和高浓度TP组(50ng/ml)各作用24h后细胞凋亡率和细胞周期的变化。6、DNA电泳分析TP对COC1/DDP细胞DNA的影响：研究分空白对照组和中浓度TP (10 ng/ml)组,作用COC1/DDP细胞24h后,分别提取两组细胞中DNA,通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析两组细胞DNA变化情况。7、免疫组化Elivision TMplus法检测Caspase-7蛋白在TP作用后COC1/DDP细胞的表达情况：设空白对照组和中浓度TP组(lOng/ml),分别作用COC1/DDP细胞24h后,离心固定两组细胞,并按常规方法制备石蜡块,用免疫组化Elivision TMplus法检测两组细胞中Caspase-7蛋白表达差异。结果：1、COC1/DDP细胞生长曲线的确定通过观察COC1/DDP细胞的生长曲线,可以得知培养3-4天为细胞的对数生长期,以此确定取培养3-4天的细胞为研究用靶细胞。2、不同浓度DDP对COC1/DDP细胞增殖的影响：DDP对COC1/DDP细胞的抑制作用呈时间-剂量依赖性。其药物作用24h后的IC50为5.567μg/ml,作用48h后的IC50为2.866μg/ml,作用72h后的IC50为1.161μg/ml。COC1/DDP细胞完全培养基中0.5μg/ml的DDP对COC1/DDP细胞的影响忽略不计。3、TP对COC1/DDP细胞增殖的影响：TP对COC1/DDP细胞的抑制作用呈时间-剂量关系,不同浓度TP与2.5μg/ml DDP联合作用于COC1/DDP呈现协同抑制作用(P<0.05)。4、TP对COC1/DDP细胞形态结构的影响：4.1光学显微镜下观察：空白对照组的细胞增殖良好,细胞透光度强,细胞形态呈圆形或不规则。TP组细胞密度较空白组减少,剩余细胞胞体变小,细胞变扁平,细胞形态多样化,胞浆内颗粒增多,培养液背景中可见细胞碎片。HE染色可见COC1/DDP细胞异型性,核浆比增高,巨核或多核等改变。4.2电镜观察细胞超微结构的改变：空白对照组细胞呈椭圆形,细胞核为卵圆形,染色质丰富,细胞形态正常。TP组可见细胞显凋亡改变,表现为：细胞膜表面微绒毛消失,细胞膜皱缩,胞浆浓缩并出现大小不等的空泡,细胞核染色质固缩、呈新月状凝聚在核膜周边,有凋亡小体形成。5、TP作用于COC1/DDP细胞后细胞周期和细胞凋亡率的改变：不同浓度TP作用于COC1/DDP细胞24h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况,低、中、高浓度TP组均可见细胞凋亡图像,凋亡率分别为：(2.69±0.23)%、(5.30±0.18)%、(16.67±0.22)%,S期细胞分别为：(48.86±0.61)%、(45.96±0.42)%、(38.72±1.11)%,G1期细胞分别为：(35.48±0.44)%、(45.38±0.35)%、(55.34±0.67)%,G2期细胞分别为：(15.67±0.71)%、(8.66±0.28)%、(5.94±0.90)%。结果提示,TP可促进COC1/DDP细胞凋亡,使细胞停滞在G1期,随着TP浓度增加,细胞凋亡率增加,呈量效依赖关系(P<0.05)。6、TP对COC1/DDP细胞DNA的影响：TP作用于COC1/DDP细胞24h后,通过琼脂糖凝胶DNA电泳分析可见细胞凋亡特征性改变的DNA图谱“梯状”条带,而空白对照组细胞未见上述表现。7、免疫组化检测TP作用COC1/DDP细胞24h后Caspase-7蛋白表达：可见细胞浆染至棕黄色,Caspase-7蛋白呈强阳性表达。而空白对照组部分细胞浆染呈淡黄色,Caspase-7蛋白弱阳性表达。结论：1、DDP对体外培养的COC1/DDP细胞有明显的抑制作用,且与时间及药物浓度呈依赖性。完全培养基中含浓度为0.5μg/m1DDP对COC1/DDP细胞无抑制作用。2、TP对COC1/DDP有抑制作用,呈时间-剂量依赖关系。3、不同浓度TP联合2.5μg/ml的低剂量DDP对COC1/DDP细胞有协同抑制作用。4、TP可促进COC1/DDP细胞凋亡,增加细胞凋亡率,其凋亡率的增加与TP浓度呈现剂量依赖关系。TP诱导COC1/DDP细胞凋亡的可能机制是使细胞停滞在G1期,影响细胞DNA合成和有丝分裂。从分子水平观察TP通过促进细胞中DNA断裂来起效。5、在COC1/DDP细胞中,Caspase-7蛋白呈低表达,TP作用COC1/DDP细胞后,Caspase-7蛋白呈高表达,TP促进COC1/DDP细胞凋亡机制也可能与Caspase-7蛋白活性上调有关,而COC1/DDP细胞株耐药机制可能与Caspase-7蛋白活性下调有关。
张翔[9]2011年在《甲羟孕酮对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药逆转作用的研究》文中研究表明目的应用甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate,MPA)体外逆转人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐顺铂(cisplatin,DDP)效应,并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法体外培养人卵巢癌浆液性囊腺癌细胞株SKOV3,及其耐顺铂细胞株SKOV3/DDP,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的顺铂对SKOV3、SKOV3/DDP的细胞毒作用,并计算耐药倍数。MTT法检测不同浓度的MPA对SKOV3/DDP的细胞毒性,确定MPA对此细胞株的非细胞毒性剂量,同法测定非细胞毒性剂量MPA联合DDP作用后SKOV3/DDP对顺铂耐药性的变化。采用流式细胞技术(FCM)检测细胞周期及凋亡情况。结果1 SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药倍数为3.86倍2不同浓度梯度的MPA对SKOV3/DDP细胞有不同程度的抑制增殖作用,并呈剂量-效应关系。当MPA终浓度小于15.10μg/ml时,其对细胞生长无明显抑制作用。3 15μg/ml的MPA联合顺铂作用于SKOV3/DDP细胞,顺铂的IC50下降至57.72±0.48μg/ml,13.39±0.21μg/ml,7.93±0.18μg/ml逆转倍数分别为1.22,1.90,2.44。3 DDP与MPA联合作用于SKOV3/DDP细胞,使其细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞比例下降。4 DDP与逆转剂量的MPA联合作用于细胞后,增加了耐药细胞的凋亡率。结论1 MPA具有抗SKOV3/DDP活性的作用,并呈浓度依赖性。2 MPA能够逆转SKOV3/DDP的耐药性,增强其对顺铂的敏感性。3 MPA使SKOV3/DDP细胞周期主要阻滞于G0/G1期,增加细胞的凋亡率。
傅士龙[10]2014年在《人上皮性卵巢癌相关成纤维细胞促癌作用的研究》文中研究指明上皮性卵巢癌是女性生殖系统叁大恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫内膜癌,居第二位,而病死率一直高居各类妇科恶性肿瘤的首位。大约75%的卵巢癌患者在诊断时已是手术无法救治的晚期;因此,探索上皮性卵巢癌发生、发展的细胞外机制,以期达到预防和治疗卵巢癌的目的,成为迫切需要解决的重要课题。卵巢癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs),作为卵巢癌间质微环境中最主要的细胞成份之一,对肿瘤的生长、浸润、转移发挥重要的调节作用,对肿瘤微环境内的其他非肿瘤细胞,如细胞外基质、其他间质细胞也产生重要影响,在维持肿瘤微环境的动态平衡中发挥着重要作用。CAFs是一种有着多种来源的细胞群体,具有广泛的异质性,是各肿瘤研究的热点,人上皮性卵巢癌相关CAFs也需进行深入的研究。第一部分上皮性卵巢癌相关成纤维细胞与卵巢癌临床病理特征的相关性研究[目的]探讨上皮性卵巢癌中癌相关成纤维细胞与临床病理特征间的相关性。[方法]平滑肌肌动蛋白(α-SMA)为CAFs特异性标志物,α-SMA表达的数量与强度可代表CAFs的存在数量,因此采用免疫组化通用型二步法检测45例非癌卵巢组织中α-SMA表达和145例上皮性卵巢癌组织中α-SMA和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,并分析两者的相关性及其临床意义。[结果]①正常卵巢组织除卵巢间质血管外,α-SMA不表达;在良性肿瘤间质中少部分阳性表达,且表达较弱;而在交界性肿瘤中,α-SMA表达强度介于良性肿瘤和恶性肿瘤之间。而在145例上皮性卵巢癌中,α-SMA均阳性表达,代表阳性的CAFs细胞在癌组织中的分布有3种方式;且Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌间质α-SMA阳性表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P = 0.016);有淋巴结转移的卵巢癌明显高于无淋巴结转移卵巢癌(P=0.049)。②正常卵巢组织中MMP-9不表达;而上皮性癌中癌细胞MMP-9阳性率为95.2%(138/145)。MMP-9在Ⅲ～Ⅳ期组明显高于Ⅰ～Ⅱ期组(P=0.028),有淋巴结转移组强阳性率高于无转移组(P=0.033)。③α-SMA在上皮性卵巢癌间质强阳性表达与癌细胞MMP-9的表达呈正相关(p = 027)。[结论]α-SMA和MMP-9两者的共同强阳性表达主要集中于Ⅲ～Ⅳ期癌患者和有淋巴结转移的患者中,CAFs的存在与数量增多提示疾病预后不良。第二部分癌相关成纤维细胞与正常卵巢成纤维细胞分离、培养及鉴定一、癌相关成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得人上皮性卵巢癌组织中肿瘤相关成纤维细胞。[方法]采用酶消化法获得原代细胞,再通过酶消化+反复贴壁法,传代获得第4代纯化细胞,并绘制细胞生长曲线,通过形态学观察和细胞免疫化学染色,对所得细胞进行鉴定。[结果]获得典型卵巢癌相关成纤维细胞。形态学上,细胞呈长梭形,胞核不明显,细胞大小不一致。其生长潜伏期较肿瘤细胞长,生长相对缓慢。免疫细胞化学上,肿瘤相关成纤维细胞中,成纤维细胞特性蛋白-1、波形蛋白、结蛋白及α-平滑肌动蛋白均表达阳性,而血管内皮细胞、间充质细胞标志均表达阴性。细胞角蛋白在较早传代的细胞中少量表达,通过纯化后基本消失。[结论]本方法可获得典型上皮性卵巢癌相关成纤维细胞,为进一步研究该细胞自身生物学特性及其与卵巢癌间的相互作用提供了必要的细胞学基础。二、正常卵巢成纤维细胞的分离、培养及鉴定[目的]通过分离、纯化、培养及鉴定,获得典型人卵巢成纤维细胞。[方法]采用酶消化+反复贴壁法,获得纯化成纤维细胞,通过形态学观察和免疫细胞化学染色,对所得细胞进行特征性标志及生物学特性的检测,进一步阐述细胞特征,并绘制细胞生长曲线。[结果]形态学上,正常卵巢成纤维细胞形态多样,大部分为梭状型、条索形,还有叁角型、多角型和不规则型等,并具有伪足样外形;其生长潜伏期较长,12-14天可传代;免疫细胞化学上,波形蛋白(Vimentin)表达强阳性,结蛋白(Desmin)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)表达弱阳性;在较早期传代的细胞中,CK-7及CK-P呈少量阳性,随着细胞的纯化,其阳性表达渐行减少直至完全消失;肌动蛋白α(α-SMA)部分细胞表达阳性。而雌、孕激素受体ER、PR以及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-3、MMP-9)、卵巢粘液性细胞标志CK-20、血管内皮细胞标志CD31、间充质细胞标志CD90、肿瘤标志物(CA125、CA199、CEA)、成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)、血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α)均阴性。[结论]成功获得人卵巢成纤维细胞,为研究卵巢癌及其相关成纤维细胞提供了必要的细胞学工具。第叁部分癌相关成纤维细胞对卵巢癌细胞生物学行为影响[目的]进一步验证CAFs对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭特性的影响,为研究肿瘤-微环境的相互作用提供必要的细胞学基础。[方法](1)采用细胞共培养体系,通过MTT实验、细胞迁移实验、细胞浸润实验以及流式细胞仪方法检测CAFs对卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3的增殖、迁移、浸润和凋亡的影响。[结果](1)CAFs对卵巢癌细胞具有明显增殖作用;(2)CAFs影响卵巢癌细胞的凋亡;(3)CAFs共培养后促进卵巢癌细胞系的迁移;(4)CAFs共培养后增强卵巢癌细胞系的侵袭能力。[结论]CAFs可明显增强卵巢癌细胞的恶性生物学行为,为进一步研究肿瘤-微环境的相互作用提供了必要的理论基础。第四部分癌相关成纤维细胞与卵巢癌细胞共培养上清因子的检测[目的]为深入了解上皮性卵巢癌细胞与CAFs间发生相互作用后所产生的效应因子,进一步研究间质对肿瘤细胞生物学行为的影响提供必要的研究基础。[方法]采用蛋白芯片 RayBioTM Human Cytokine Antibody Array Ⅱ series Ⅰ(含有507个细胞因子)检测9份细胞培养上清中细胞因子的含量,其中CAFs培养上清3份,OVCAR-3培养上清3份,CAFs+OVCAR-3共培养上清3份;将所测定的因子含量与OVCAR-3所分泌的基础状态因子含量作比较,定义比率升高大于等于2.0或下降小于等于2.0(≥2.0或≤-2.0)者为差异有显着性。[结果]共获得差异表达因子57种,44种表达上调,13种表达下调。其中与细胞增殖相关因子17种,与肿瘤基质形成相关因子11种,与肿瘤趋化及前炎症因子相关因子19种,与肿瘤血管生成和抑制相关因子10种。[结论]肿瘤相关成纤维细胞通过与肿瘤细胞相互作用,可产生一系列细胞因子,或促进肿瘤的进展,或调节肿瘤-微环境的动态平衡,为进一步研究CAFs对卵巢癌的促进作用提供了研究资源。第五部分癌相关成纤维细胞对小鼠移植瘤促进作用的初步研究一、可视化小鼠移植瘤模型的建立[目的]建立可重复观察并且可客观定量的卵巢癌动物模型,为卵巢癌其他领域研究提供基础模型工具。[方法]采用含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染人卵巢癌细胞株,获得稳定表达GFP的卵巢癌细胞株GFP-Ovcar3接种裸鼠皮下或腹腔,利用小动物活体成像仪系统动态观察裸鼠移植瘤的生长情况,并对移植大小、轮廓进行定量测定。[结果](1)获得稳定表达绿色荧光蛋白的GFP-Ovcar3细胞;(2)通过接种裸鼠皮下或腹腔,成功获得带有绿色荧光蛋白的小鼠皮下和腹腔移植瘤模型。[结论]建立可视化小鼠模型,可更加直观、明确地获得肿瘤的大小和轮廓,为卵巢癌其他领域研究提供了基础模型工具。二、癌相关成纤维细胞对小鼠皮下移植瘤的促进作用[目的]通过体内实验,进一步证实CAFs在体外实验中所观察到的现象和结论。[方法]通过将前述获得的能稳定表达绿色荧光蛋白的不同浓度GFP-Ovcar3细胞,与CAFs细胞混合接种裸鼠皮下,建立可视化小鼠皮下移植瘤模型,观察成瘤率、测量肿瘤生长情况及远处转移情况。[结果](1)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,成瘤率明显高于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可促进卵巢移植瘤的发生,尤其当接种瘤细胞浓度较低时,促进作用显着;(2)混合接种肿瘤细胞和CAFs细胞的裸鼠,肿瘤生长明显快于单纯接种肿瘤细胞的裸鼠,CAFs可明显促进移植瘤的生长。[结论]通过体内、体外研究证实,CAFs对卵巢癌的发生和生长具有明显促进作用,为探索针对CAFs的卵巢癌新的治疗途径提供了理论依据。叁、人源性卵巢环境小鼠模型的建立[目的]将“人源性”因素加入小鼠模型,为精确模拟肿瘤发生、发展的临床病理过程提供临床前研究工具。[方法]尝试将正常人卵巢组织移植于SCID小鼠皮下,待明确移植物存活并伴有新生血管形成后,通过免疫组化分析卵巢移植物属性;将带有绿色荧光蛋白的肿瘤细胞,接种于卵巢移植物内,形成新的皮下移植瘤,观察新的移植瘤生长及转移情况。[结果](1)卵巢移植物在小鼠皮下生长良好,未见明显感染或组织排斥反应,移植物可见典型血管形成;(2)组织学检查表明:植入SCID小鼠后存活的人卵巢组织形态与植入前的原始人卵巢组织形态相似;(3)免疫组化分析表明:移植物标本为ER阳性和PR部分阳性,抗人CK-7阳性,抗人CD34阳性,表明移植物组织来源于人卵巢,有新生血管形成,仍为雌激素和孕激素依赖型;α-SMA的表达,类似于原始人卵巢组织;(4)接种于卵巢移植物的皮下肿瘤生长良好,并可见1只小鼠腹腔内转移瘤病灶。[结论]植入“人源性”卵巢组织形成新的皮下移植瘤,可模拟人卵巢癌细胞生长的人源性卵巢微环境,有利于肿瘤的生长和转移,较既往的小鼠模型更准确地模拟了卵巢癌发生、发展的临床病理过程。第六部分癌相关成纤维细胞通过PI3K/AKT/XIAP信号通路影响顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡[目的]本研究拟通过CAFs和卵巢癌细胞共培养的方法,阐明CAFs通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路,影响卵巢癌化疗效果。[方法]采用流式细胞术观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞的凋亡改变;应用RT-PCR、Western-blot观察共培养组及非共培养组DDP诱导卵巢癌细胞内PI3K、AKT、XIAP传导通路中mRNA水平及蛋白水平的变化,以及通路抑制剂LY294002对CAFs引起的化疗耐药的逆转作用。[结果](1)通过流式细胞仪检测,DDP对卵巢癌细胞作用的最佳时间和浓度分别为48h,5.0μ g/ml;(2)卵巢癌细胞与CAFs共培养后,DDP诱导的癌细胞凋亡显着减少(p<0.05);(3)Real-timePCR检测卵巢癌细胞内PI3K mRNA的表达共培养组明显高于未共培养组,XIAP mRNA的表达较未共培养组也显着升高(p<0.05),AKT mRNA表达有所升高,但无统计学意义;(4)PI3K/XIAP蛋白表达共培养组明显高于非共培养组,差异有统计学意义(p<0.05),总AKT蛋白共培养组和非共培养组无明显变化,但磷酸化AKT(P-AKT)蛋白表达有显着差异,差异有统计学意义(p<0.01)。加入通路抑制剂LY294002后,共培养组XIAP蛋白表达明显降低。[结论]CAFs与卵巢癌细胞共培养后,CAFs分泌的某种生长因子可使PI3K/AKT/XIAP信号转导通路上调,影响了 DDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡。
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