（徐州市儿童医院 徐州 221006）
【摘 要】目的：研究苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞株中CXCR4 mRNA的表达及影响，明确苦参碱的抗肿瘤作用是否通过抑制CXCR4 mRNA的表达而发挥作用。方法：应用不同浓度苦参碱分别作用RD细胞株48h；采用MTT比色法检测不同浓度苦参碱对RD细胞的增殖抑制率；流式细胞仪(FCM)检测RD细胞的凋亡率； RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。结果：不同浓度苦参碱干预组及对照组RD细胞的抑制率、凋亡率以及CXCR4 mRNA 表达差异均有统计学意义（P<0.05）；随苦参碱浓度增加，细胞的抑制率和凋亡率呈上升趋势，而CXCR4 mRNA 表达呈下降趋势，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：苦参碱可以抑制RD细胞CXCR4 mRNA的表达，苦参碱的抗肿瘤作用是通过抑制CXCR4mRNA的表达而发挥作用。
【关键词】苦参碱；横纹肌肉瘤；表达
【中图分类号】R738.7 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）6-0412-02
本实验主要观察苦参碱对体外人横纹肌肉瘤RD细胞株增殖和凋亡的影响，研究苦参碱对CXCR4基因的影响，初步了解CXCR4基因是否参与苦参碱的抗肿瘤作用，为进一步研究苦参碱用于横纹肌肉瘤的治疗研究提供新的治疗靶点。
1 材料和方法
1.1材料 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库；Mat（纯度≥98％）购自陕西中鑫生物科技有限公司；RPMI 1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT、DMSO和Trizol等试剂购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；CXCR4一抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol、RT-PCR 两步法试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、溴化乙锭（EB）、TBE和DNA Marker等试剂购自北京天根生化科技有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1细胞培养 RD细胞接种于10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2分组（1）对照组：仅有等量细胞及培养基，无药物即A组（2）药物干预组：苦参碱浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0（单位g/L）即为B、C、D、E组（3）空白组：仅有等量培养基及溶剂，无细胞（此分组仅见于MTT实验中）。
1.2.3MTT检测细胞增殖抑制率 将细胞接种于96孔板，每孔150ul，贴壁后各处理组加入50ul苦参碱继续培养48h；后各孔加入20ulMTT工作液，继续置于培养箱培养4h；吸去上清液，每孔加入150ulDMSO，振荡10min后在1h内于酶标仪检测492nm波长时各孔吸光度(A值) ,并计算细胞抑制率（IR):IR（％）=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
1.2.4FCM 检测RD细胞凋亡率 将细胞接种于六孔板，每孔2ml，贴壁，处理48h后收获细胞，PBS洗两遍并离心(1000rpm、5min)，加入500μl Binding Buffer悬浮细胞，再加5μl Annexin-V-FITC混匀后，加入5μl PI，室温，避光，染色15min后，1h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.5 RT-PCR检测RD细胞CXCR4 mRNA的表达 取对数生长期细胞提取总RNA进行逆转录，然后进行PCR扩增：CXCR4引物上游序列：5’-CTGCCCTCCTGCTGACTATTCC-3’，下游序列：5’-ATGATGTGCTGAAACTGGAACAC-3’（扩增目的基因长度为127bp）；β-actin引物上游序列: 5’-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3’，下游序列5’-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3’（扩增目的基因长度为130bp）；扩增条件：94℃预变性 3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec,72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用电脑成像统计电泳后泳带密度，以目的基因与β-actin扩增产物的灰度值的比值表示基因表达水平。
1.2.6统计学处理 以上实验均重复3次，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。各组间均数的比较采用单因素方差分析,各组间两两比较采用S-N-K检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1苦参碱对RD细胞的增殖抑制作用 MTT法测得A组IR为(14.36±0.26)％,B、C、D、E各组IR分别为(29.96±0.61)％,(43.79±0.68)％, (53.66±0.23)％,(67.79±0.82)％。随着药物浓度增加,组间比较差异均具有统计学意义(F=57.25,P 均<0.05)。
2.2苦参碱对RD细胞的诱导凋亡作用 苦参碱作用RD细胞48h后，细胞早期凋亡的检测结果见图1。对照组及各浓度组（0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g/L）的细胞凋亡率分别为(6.59±0.43)％,(19.03±4.12)％,(27.14±0.97)％,(38.00±2.38)％,(49.88±3.48)％，即不同浓度苦参碱细胞凋亡率随药物水平的增加而升高，与对照组比较差异有统计学意义（F=75,05,P<0.05)，各组组间比较差异具有统计学意义 (P均<0.05)。
3 讨论
CXCR4在许多肿瘤细胞中均有表达，与肿瘤细胞的生长、凋亡、转移及浸润密切相关 。CXCR4在胃癌、乳腺癌、和急性白血病的发病和增殖和浸润特性存在密切关系[1]。
本实验结果显示苦参碱在体外对RD具有明显抑制作用，提苦参碱能诱导RD细胞凋亡, 而且诱导细胞凋亡作用与药物浓度呈正相关。
研究发现[2]苦参碱可抑制肾母细胞瘤细胞CXCR4 mRNA表达。本研究采用检测结果显示CXCR4 mRNA在各组RD细胞中均有表达。与对照组比较，各浓度苦参碱处理组CXCR4 在基因水平的表达均明显降低，且具有剂量依赖性。提示苦参碱可能通过下调CXCR4 mRNA的表达，来抑制RD 细胞增殖并诱导凋亡。
目前苦参碱抗肿瘤的确切作用机制尚需更进一步的实验与临床研究，为将来临床上苦参碱联合化疗药物取得更好疗效而奠定基础。
参考文献：
[1]刘丽娟,关国锋,王小娟,等.AMD3100 抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力及其机制研究[J].现代肿瘤医学2015，23（01）：0019–0022
[2]毛玲，薛天阳，许伟，等．苦参碱对人肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞趋化因子受体4 表达的影响[J]．临床儿科杂志，2014,32(5):467-470
论文作者:金明卫,玄承敏,安,琪
论文发表刊物:《河南中医》2015年6月供稿
论文发表时间:2015/10/14
标签：细胞论文; 苦参碱论文; 凋亡论文; 横纹肌论文; 浓度论文; 抑制论文; 统计学论文; 《河南中医》2015年6月供稿论文;