陈石头[1]2004年在《榨菜高效再生体系的建立及其遗传转化影响因子的研究》文中研究表明本文以榨菜(Brassica juncea Czern. et Coss. var. tumida)‘浙桐1号’、‘浙桐3号’、‘浙桐4号’和‘种都榨菜’4个品种为材料，研究了影响榨菜离体植株再生的一些重要因素，并建立了高效的植株再生体系。同时，对农杆菌介导的榨菜遗传转化影响因子也作了一些研究，并初步建立了榨菜遗传转化体系。 以‘浙桐1号’子叶、带柄子叶、子叶柄及下胚轴等外植体为材料，不同激素及其浓度对其分化影响的研究结果表明，在我们筛选的优化培养基中，‘浙桐1号’的4种外植体均能达到较高的分化频率。其中带柄子叶在MS+BAP 2 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1)+AgNO_3 4 mg·L~(-1)+蔗糖3％+琼脂0.8％的最佳培养基中分化频率最高，达到了100％；在优化培养基中分化频率最低的下胚轴也达到了60.7％。此外，研究结果还表明，不同类型外植体在添加BAP+2,4-D的培养基中，其再生能力相差很大；而在添加BAP+NAA的培养基中虽也存在差异，但各种外植体的分化频率都很高。在筛选培养基的同时，我们还观察到不同苗龄的外植体其再生频率呈显着性差异，但不同外植体的最佳接种苗龄不同，4 d的子叶分化能力最强，而其它外植体的最佳苗龄均为5～6 d。 通过培养基的各种成分对榨菜再生体系影响的研究，发现AgNO_3能显着地促进外植体的分化，4～6 mg·L~(-1)的浓度为最佳；而升高琼脂浓度，则表现为抑制外植体分化，但能减轻玻璃化现象。 在建立了高效再生体系的基础上，以下胚轴为外植体，预培养3～4 d，菌液浓度为OD_(600)=0.5，侵染10～15 min，共培养4 d，壮观霉素浓度为5 mg·L~(-1)时，抗性芽分化频率高达4.0％。不同类型外植体，其转化频率差异很大，以子叶和带柄子叶为外植体时，并未得到任何抗性芽；以子叶柄为外植体时，也只能得到一些抗性愈伤组织。 以质粒载体上的CaMV35S启动子两端序列设计特异引物，对在分化培养基上筛 摘要选20天后的抗性芽进行检测结果表明，外源基因已整合到榨菜基因组上。抗性芽阳性率达80%以上。
孔娟[2]2002年在《芥菜类蔬菜高频再生体系的建立及硝酸银的作用》文中进行了进一步梳理离体培养是作物遗传改良的一种重要手段。芥菜类作物(尤其是中国芥菜)再生率偏低，在遗传转化、突变体筛选等方面尚未形成一个高效稳定的再生体系，从而制约了离体条件下遗传改良的进程。本研究的目的在于建立不同芥菜变种的高频再生体系，为在离体条件下对芥菜进行遗传改良奠定基础。 本试验以中国芥菜的抱子芥(B.juncea Coss. var. gemmifera Lee et Lin，“种都一号”儿菜)、笋子芥(B. juncea Coss. var. crassicaulis Chen et Yang，“种都”棒菜)、分蘖芥(B. juncea Coss. var. multiceps Tsen et Lee，“嘉兴雪里蕻”)和茎瘤芥(B.juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee，“浙桐一号”榨菜不育系及其保持系)等5个品种的子叶及下胚轴外植体为材料，进行离体培养研究，主要结果如下： 植物生长调节剂和基因型显着影响到子叶芽再生率。儿菜、雪里蕻、棒菜和榨菜4个变种的子叶在不添加BA和NAA的MS培养基上不能产生再生芽；在添加由1.0—5.0mg／LBA和0.0—1.0mg／LNAA所配合的25个处理组合的MS培养基中培养，其芽再生率分别介于6.90—35.2％、0.00—37.59％、13.80—37.76％和0.00—30.0％之间，平均芽再生率分别为23.04％、21.31％、24.58％和21.26％。虽然不同变种的芥菜子叶芽再生率不同，但其最佳的培养基均为MS＋BA 3.0mg／L＋NAA0.5mg／L。 外植体种类对芽再生亦有显着影响。在以“浙桐一号”榨菜不育系及其保持系为材料的试验中发现，子叶外植体的芽再生率高于下胚轴外植体。不育系子叶与下胚轴的平均芽再生率分别为30.00％和2.34％；而保持系的平均芽再生率分别为30.0％和3.54％。另一方面，以“种都一号”儿菜的不同子叶部位作为外植体所进行的研究结果表明，不带子叶柄的完整叶片其芽再生率(16.70％)显着低于带子叶柄的完整子叶(33.8％)，但平均再生芽数，前者(4.2)却高于后者(2.5)；子叶柄不能进行芽的分化；不带子叶柄的子叶尖端和子叶一侧，其芽再生率(分别为12.5％、8.30％)及再生芽数(分别为2.3、1.7)也明显低于带子叶柄的完整子叶。另外，看护培养可以使再生芽的发生提早5—6天，并能显着提高芽再生率。 在MS培养基中添加ASNO_3能显着地促进子叶芽的再生。研究结果显示，5.0—30.0mg／L AgNO_3均能显着提高“种都一号”儿菜子叶芽再生率，并以15.0mg/LAgNO3效果最佳，显着优于其它浓度处理；10．0—20刀3g几 AgNO3均能显着提高平均再生芽数，其中，15刀ig／L AgNO3效果最为明显，显着高于其它任何一种浓度处理。研究发现，在 MS培养基中添加 AgNO。可以降低乙烯释放量，再生芽发生前后乙烯释放量与芽再生率和平均再生芽数之间存在显着的负相关。 愈伤组织的诱导与再分化的研究显示：“种都一号”儿菜下胚轴与子叶愈伤组织诱导较容易，但根尖很难愈伤化。筛选得到愈伤组织诱导的最适培养基为 MS＋05 mg／L BA十1刀mg／L NAA。愈伤组织再分化能力因外植体种类而异，子叶愈伤组织优于下胚轴，而根尖愈伤组织不能分化获得再生芽。
胡小祥[3]2003年在《大豆、榨菜的组织培养及遗传转化研究》文中进行了进一步梳理本论文研究了大豆的离体再生和根癌农杆菌介导的遗传转化及榨菜的离体培养。 大豆子叶、下胚轴培养在不同激素的B5培养基中，只能诱导出愈伤组织，难分化芽。但子叶节却能诱导出丛生芽，在2mg／L BA+0.2mg／L IBA的B5培养基上再生频率达41.9％。 以榨菜子叶、真叶为外植体进行离体培养，用BA、CPPU、TDZ和KT等细胞分裂素和生长素NAA、IBA组合诱导子叶、真叶再生不定芽试验。结果表明，供试细胞分裂素中，诱导活性大小为TDZ＞CPPU＞BA＞KT，BA、CPPU、TDZ和KT诱导子叶不定芽再生的最佳浓度分别为4、0.4、1、1.5 mg／L。1 mg／LTDZ和1 mg／L NAA配合对子叶再生具有极强的诱导作用，再生率最高，达到67.9％，平均每外植体不定芽数达35个。在培养基中添加AgNO_3对于叶离体再生有明显促进作用，以8mg／L AgNO_3的效果最好，再生频率达56.7％，比对照提高了23.4％。对子叶、真叶、下胚轴、根系四种外植体在附加1 mg／LTDZ+0.5mg／L NAA的MS培养基上的再生能力进行了比较，发现子叶再生频率最高，真叶次之，下胚轴只分化愈伤组织，少数分化出绿色芽点，根系最差，既不能分化愈伤，也不能分化芽。 通过从重组质粒pBI121上切下S基因(连同35 S启动子)片段，将该片段定向克隆到pCAMBIA1305.1质粒的多克隆位点HindⅢ、BamHⅠ之间，构建了一种植物表达载体。经双酶切鉴定证实S基因克隆到载体pCAMBIA1305.1上。用叁亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌EHA105，获得了含pCAMBIA1305.1重组质粒的EHA105根癌农杆菌菌株。 通过根癌农杆菌介导对传染性支气管炎病毒纤突蛋白S基因在大豆中的遗传转化进行了研究。以子叶节为外植体，在抗性筛选培养基上大多白化死亡，有少数生长出芽，转化频率最高为6.7％
蒋波[4]2010年在《芥菜离体培养芽再生过程中的生理生化变化研究》文中研究说明本试验以芥菜(Brassica juncea Coss.)的叁个品种：四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜为实验材料,建立了叁个品种的子叶离体培养体系。对叁个品种子叶离体培养芽再生过程中的生理生化指标变化(可溶性蛋白、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、可溶性糖、淀粉、核酸)和可溶性蛋白组分以及过氧化物酶同工酶进行了比较研究,实验结果如下：1.四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜的子叶在培养基MS+NAA0.1mg/L+6-B A3. Omg/L上均得到最高分化率,分化率分别为：83%、76%、51%。2.选择培养基MS+NAA0.1mg/L+6-BA3.0mg/L+2,4-D0. 1mg/L为金研一号愈伤组织的诱导培养基,子叶愈伤组织诱导率为93%。愈伤组织的最适增殖培养基为MS+NAA0.3mg/L+6-BA3.0mg/L+2,4-D0.1 mg/L.愈伤组织最适分化培养基为MS+NAAO.1 mg/L+6-BA3.0mg/L,愈伤分化率为13%。3.在四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜子叶离体培养芽再生过程中,叁个品种在抗氧化酶(POD. SOD、CAT)活性以及可溶性糖含量、淀粉含量和RNA含量上的变化规律基本一致,只是在分化过程中品种间表现略有差异,其中四川榨菜先分化出芽,先于另外两个品种出现变化的峰值,同时由于四川榨菜和金研一号香菜分化率高,代谢活跃,各个生理生化指标变化趋势也比圆大头菜剧烈。而可溶性蛋白含量和DNA含量的变化上,金研一号香菜因直接形成芽丛,因此在含量上出现了与其他两个品种不同的变化趋势。如在培养8天时,金研一号香菜的可溶性蛋白含量和DNA含量有小幅上升,其他两个品种则呈下降趋势。4.叁个品种在分化过程中,在不同的培养阶段,都各自有不同的特异蛋白条带和POD同工酶谱的出现和消失。四川榨菜愈伤组织分化时有55KDa、30KDa、31KDa、18KDa蛋白组分表达,57KDa、38KDa、28KDa、12KDa蛋白组分消失；金研一号香菜子叶分化时有55KDa、14KDa蛋白组分表达,而57KDa、34KDa、26KDa、12KDa蛋白组分则被关闭；圆大头菜子叶培养16d愈伤组织分化时,55KDa蛋白组分表达,但12KDa蛋白组分被关闭。叁个芥菜品种分化时都有12KDa蛋白条带的消失,12KDa蛋白条带的消失可以作为分化的标志之一叁个芥菜品种的子叶含有相同的POD同工酶谱带。四川榨菜子叶分化时,B带消失,而C、D、E带活性进一步增强；金研一号香菜子叶分化时A带出现,含有A、B、C、D、E五条带；圆大头菜子叶分化时,A、C带出现,也含有A、B、C、D、E五条带。5.主成分分析结果表明,POD、CAT、SOD、可溶性糖、可溶性蛋白含量和DNA含量6个指标可以反映芥菜子叶离体培养芽再生过程。
丁淑丽[5]2006年在《植物SAMDC基因分子进化分析以及ySAMDC基因转化番茄研究》文中研究表明多胺广泛存在于所有生物中,并且在植物的生长发育过程中起重要的作用。S-腺苷甲硫胺酸脱羧酶(SAMDC)是多胺合成途径中的一个关键调节酶基因。SAMDC催化腺苷甲硫氨酸(SAM、AdoMet)形成脱羧的SAM,它为多胺生物合成提供氨丙基供体。多胺与乙烯具有共同的合成前体物质SAM。乙烯和多胺是具有重要生理作用的两类生长调节物质,并和成熟衰老过程相关。因此研究SAMDC的分子特征及调节作用有很大的现实意义。 本研究选用模式植物番茄作为遗传转化受体,引入多胺生物合成途径中的关键调节基因ySAMDC基因,以期为进一步分析SAMDC基因在调节多胺的合成中的作用、多胺水平和多胺在诱导基因的表达中的功能以及探讨能否通过对SAMDC的调控进行作物改良奠定基础。同时利用同源基因克隆方法分离了十字花科SAMDC基因,试图从分子水平阐明植物SAMDC基因进化关系,为进一步探索SAMDC的生物学功能提供研究基础。因此,我们建立了番茄离体培养植株再生体系,构建了ySAMDC基因植物表达载体,并将目的基因导入根癌农杆菌LBA4404菌株中,进行了番茄的遗传转化研究,获得了80株番茄Hyg~R植株。主要研究结果如下: (1)通过不同的激素配比的筛选,提出了一个番茄离体培养再生频率较高的培养基配方(MS培养基+3%蔗糖+0.8%琼脂+1mg/L BAP+0.15 mg/L IAA),子叶和下胚轴外植体的再生频率分别达90.7%和94.2%。 (2)经过对番茄外植体Hyg筛选浓度的确定、抑菌剂Cef的敏感性试验、Hyg对生根的影响,建立了一个番茄遗传转化体系。具体操作为:将番茄子叶外植体在预培养基上培养2d后,用含目的基因的pBI35S-SAM和pBIE8-SAM农杆菌LBA4404菌液侵染5～10min,在灭菌滤纸上吸干菌液,置于共培养基上培养2d,随后将外植体转入含Hyg7mg/L的选择分化培养基上诱导不定芽,2-3周转瓶一次,当抗性不定芽长至2-3cm时,在愈伤组织处切下幼苗,置于生根培养基上诱导不定根,15d左右后不定根长成,开瓶炼苗,然后移栽至营养土中,正常管理。 (3)按已建立的番茄遗传转化体系,获得了80余株潮霉素抗性苗,对40株Hyg~R转基因番茄植株进行了PCR检测、RT-PCR检测、和GUS组织化学染色。结果有32株含1100bp ySAMDC基因扩增产物。 (4)根据GenBank中已报道的SAMDC基因编码的氨基酸保守区域设计特异引物,运用PCR技术分别从十字花科6属14个物种中新克隆分离了SAMDC基因的同源序列。根据核苷酸序列构建了NJ与ME分子系统树。进化树直观地表明在亲缘进化关系上芸薹属与萝卜属较近,其他依次为山芥属、蔊菜属、拟南芥属,与荠菜属最远。本研究结果有助于从分子水平阐明十字花科植物间的亲缘进化关系,可为植物种质资源利用提供理论依据。
范爱丽[6]2009年在《大白菜细胞质雄性不育基因orf224和orf138表达载体构建及遗传转化》文中提出线粒体基因组中的开放阅读框orf224和orf138分别是造成PolCMS、OguCMS雄性不育的主要原因,利用这些开放阅读框的特异性表达有可能控制植物育性表达、创制新的雄性不育材料。本研究分别构建了含有组成型启动子ED35S和白菜花药特异启动子(BcA9)的两类不同来源的大白菜PolCMS orf224细胞质雄性不育基因和OguCMS orf138细胞质雄性不育基因的植物表达载体。进一步优化了大白菜离体再生体系,并以携带pWR-CMS7311-orf224表达载体质粒的农杆菌进行了大白菜遗传转化体系研究,获得了转基因植株,为大白菜不育系种质资源创新及细胞质雄性不育机理研究奠定了基础。本试验的主要研究结果如下:1利用PCR技术从萝卜细胞质雄性不育材料B1-5#线粒体基因组中扩增出特异片断orf138,对其进行克隆、测序及序列分析。序列分析表明:获得orf138基因的全序列,开放阅读框完整,该基因与NCBI上报道的orf138序列同源性为99%。2用XbaⅠ和SacⅠ双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确。在构建pWR-CMS7311-orf224基础上,再用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pWR-CMS7311-orf224质粒和pMD18-T-BcA9质粒,将pWR-CMS731-orf224表达载体与BcA9启动子定向连接,把ED35S组成型启动子置换成BcA9白菜花药启动子,得到pWR-BcA9-orf224植物表达载体,酶切和PCR验证pWR-BcA9-orf224载体构建正确。采用快速冻融法,将orf224两个表达载体质粒分别导入农杆菌EHA105。3用BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pMD18-T-orf138和表达载体pWR306后,将orf138基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因orf138的植物表达载体pWR-orf138,通过酶切和PCR验证pWR-orf138载体构建正确。在构建pWR-orf138基础上,再利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pWR-orf138质粒和pMD18-T-BcA9质粒,将pWR-orf138表达载体与BcA9启动子定向连接,ED35S组成型启动子被置换成BcA9白菜花药启动子,得到pWR-BcA9-orf138植物表达载体,通过酶切和PCR验证pWR-BcA9-orf138载体构建正确。采用快速冻融法,将orf138两个表达载体质粒分别导入农杆菌EHA105。4建立了的大白菜子叶段离体再生体系:最优苗态为两片子叶绿色将展平、第一片真叶未露出、小苗直立生长时(播种5-6 d)。最佳切割和接种方式是保留单片子叶,在生长点处(即子叶柄基部和下胚轴交接处),先横切,然后纵切,去除顶芽,切除子叶顶端的1/3,竖直插入培养基。优化的培养程序为外植体先在MS+7.0 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA的培养基上启动培养2-3 d;再转入MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA的芽诱导培养基培养,再生频率最高。在供试的6种基因型材料中,橙色大白菜06J28子叶段再生频率最高,为90.4%,每块外植体再生芽数最高达1.14个。5建立了大白菜遗传转化体系:技术要点是先进行大白菜子叶段切割,子叶段在芽启动培养基(MS+7.0 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA)上预培养2-3 d;投入到活化的农杆菌菌液中浸染5 min,然后在芽诱导培养基(MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA)上共培2-3 d,再转入筛选培养基(MS+5.5 mg.L~(-1)6-BA+0.5 mg.L~(-1)NAA+10 mg.L~(-1)AS+5 mg.L~(-1)Hyg+ 500 mg.L~(-1)Cef)中筛选抗性芽。每两周更换一次培养基,最后获得9株06J28大白菜抗性植株。6用携带pWR-CMS7311-orf224质粒的EHA105农杆菌转化06J28大白菜,在获得9株抗性苗中,其中5个植株PCR检测扩增出约690 bp条带,这5个PCR阳性转化植株中有4株GUS染色呈现蓝色。进一步RT-PCR检测有2株在690 bp左右处有明显的条带,初步判断此基因已转入大白菜基因组中,并已经转录。Southern Blotting正在进行中。
余小林[7]2002年在《白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建》文中进行了进一步梳理芸薹属(Brassica)作物是我国栽培面积最大，总产量最高的一类蔬菜与油料作物。同时它也是杂种优势利用最为普遍的一类作物，其雄性不育的选育及其应用基础的研究深受人们重视。近一个世纪以来对植物雄性不育的研究，国内外学者做了大量的理论和实验的探讨，在方法和指导思想上都有了明显的进步，不仅取得了一些重要的研究进展，还带动了杂种优势在生产中的广泛应用，产生了巨大的经济效益利社会效益。但是，雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开的谜，目前对其的认识是零散和不完全的，还有许多问题需要深入研究。随着现代生物学，尤其是分子生物学理论与技术的发展，不仅为最终解决植物雄性不育机制提供了条件，而且随着这个问题的解决过程，也将大大推动芸薹属和其他农作物杂种优势的有效应用。 在国家自然科学基金委的资助下，我们在前一阶段利用mRNA差异显示技术从白菜(B．campestris ssp．chinensis(L．)Makino Var．communis Tsen et Lee)核雄性不育两用系中分离得到了一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450基因CYP86MF。该基因具有一个完整的长1578bp的开放阅读框，经GenBank BLAST查询表明，CYP86MF与位于拟南芥第一条染色体上的编码细胞色素P450基因CYP86C4核苷酸序列有85.3％的同源性，氨基酸同源率为84.9％；Northern验证表明CYP86MF基因在白菜两用系不育株中的表达受到了明显地抑制，并且该基因在花蕾中特异表达，而在叶片和茎中不表达。为进一步了解本实验室获得的CYP86MF基因的生物学功能，在建立了白菜和菜心的高效再生体系，以及构建了植物表达载体的基础上，我们采用反义技术将可育株高表达的CYP86MF基因中约460bp的片段导入正常可育白菜和菜心(B．campestris ssp．chinensis(L.) Makino var．parachinensis(Bailey)Tsen et Lee)中，得到了130多株转化植株，其中开花结果的有37株，除2株为嵌合的不育株以及3株的花器官畸形(花朵变大、花瓣变窄以及嵌套花)以外，其余的转基因植株花器官外观形态正常，但单株自交不能正常结实，蕾期授粉亦然。由此我们进行了转基因植株的花粉萌发试验，结果显示，转基因植株的花粉不能正常萌发，而非转化对照株的花粉萌发率可达25％～30％。由此，我们分析了转基因不育植株与正常可育植株及其两用系材料之间CYP86MF基因的表达特征，对转基因植株及其对照株之间的小孢子的形态和细胞发育过程进行了观察，比较了它们之间有关生理生化指标的差异，从而为探讨CYP86MF基因在芸薹属植物小孢子发育过程中的作用机制提供了一些信息。主要研究结果如下： (1)通过不同浓度的激素配比以及采用不同外植体的筛选，提出了一个白菜离体培养再生频率较高的培养基配方(1/2倍浓度NH_4~+的MS培养基的盐类及维生素+2％蔗糖+0.8％琼脂+2mg/L BAP+0.45mg/LNAA+7.5mg/L A9NO_3+80mL/L椰子汁)，大幅度提高了植株的再生频率，达到84.8％以上。成苗周期大大缩短。子叶-子叶柄外植体接种后，最早的仅需6d即可分化出不定芽，从接种到再生苗的移栽最快的约需40d，平均一批约需50d，再生植株移栽的成活率达到 r ￥ 2 g Wtq＆tet HWks＃t＋HhiX4NCYPS。。FMf）J能＆证RitA。个fgNJ创4 f95％以上，达到了高频快速的要求。该培养基对白菜类蔬菜的不同品种有着较广的适应性。此外，8还发现白菜类蔬菜的再生特性具有较强的基因型背景，其中青梗类白菜的不定芽再生能力优丁肉梗I （2）建立了改良的菜心离体培养再生体系，其分化及生长培养基的配方为：1／2倍浓度NH。“的 MS培养基的盐类及维生素＋2％蔗糖＋0石％琼脂＋2 mg／L BAP＋0厂5－I刀 mg／L NAA＋v·s mg／L a＋NO。＋80 mL几椰于汁。 （3）沟建了反义CYP86Ag’基因的 CaMV35S组成型表达载体pBI35S－AMF和 Ag绒毡层组织特异型表达载体pB［Ag－AMF。检测鉴定后，分别将它们导入农杆菌LBA4404和 EHA105 l株中。 （4）经过对自菜和菜心Kan筛选浓度的确定、预培养和共培养时］司的筛选，以及不同状杆卤S菌株的比较，建立了Southern印迹杂交阳性频率高达2．48％的白菜高效坦传转化体系。具体操作为：8将于叶柄－于叶外植体在预培养基上预培养 3 d后，用 LBA4404／（pBI35S－AMF和 pBIAg－AMF）感染 10－15 min，在灭菌滤纸上吸干菌液，置于共培养培养基上培养 2 d，随后将外植体转入含 10 mghKan的选择分化培养基上诱导不定芽，3周转瓶一次，当抗性幼苗K至2～3 cm时，在愈伤组织处切下幼苗，置于生根培养基上诱导不定根，20 d左
何晓蓉, 朱学栋, 刘华强, 杨霞, 闫玉芳[8]2015年在《芥菜类蔬菜的组织培养技术应用研究进展》文中指出组织培养技术对于芥菜类蔬菜育种材料的保存与繁殖、遗传转化、种质资源创制有着十分重要的意义。主要对芥菜类蔬菜器官离体培养的现状进行综述,包括:外植体类型(子叶、带柄子叶及下胚轴),外植体生理状态(苗龄等),外植体极性(近根端、近芽端)与接种方式(正插、平放等);培养基类型及生长调节剂组合浓度等。分析认为,影响芥菜类蔬菜作物离体再生的各种因素是相互作用的,通过选择适宜的外植体类型和最佳生理时期,改良培养基及优化生长调节剂配比,优化培养条件及使用培养基添加物,综合所有的因素进行优化,才能获得高效的芥菜类蔬菜离体培养再生体系。
高乃波[9]2009年在《反向重复TuMV HC-Pro基因转化植物的研究》文中认为本研究将反向重复的芜菁花叶病毒(TuMV)HC-Pro基因定向插入到植物表达载体pCambia1301上35S启动子下游,并以农杆菌介导的叶盘法转化烟草、拟南芥和雪菜,获得转基因植物。并对转基因烟草的抗病性进行研究。根据已经发表的TuMV HC-Pro基因序列,设计特异性引物。通过PCR扩增获得部分正反向的HC-Pro基因片段。正向的HC-Pro基因与pGEM-T载体相连,经Xba I, Kpn I双酶切,所得基因片段插到同样酶切开的载体pCambia1301上;反向的HC-Pro基因连入pMD18-T载体,再用Xba I, Pst I双酶切切下,连接到已经插入正向的HC-Pro基因的pCambia1301载体上。鉴定筛选得到含TuMV HC-Pro基因的反向重复植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro。叁亲交配法将植物表达载体pCambia1301-TuMV HC-Pro转入根癌农杆菌EHA105菌株,得到的阳性转化子用于植物转化。用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转入烟草,潮霉素抗性筛选获得转基因植株,PCR检测阳性率为93.33 %。对部分烟草植株进行Southern印迹杂交和RT-PCR,结果表明TuMV HC-Pro已整合到烟草基因组。接种60株转基因烟草植株,症状观察和ELISA检测表明,转基因烟草对TuMV表现出四种不同的抗病性类型:(1)免疫型,整个植物在生长过程中无病症,ELISA反应阴性,接种后前五周生长缓慢,节间变短,第六周开始正常生长。(2)抗病型,植物接种后第叁周开始发病,第五周病症最严重,第七周开始新生的叶子不发病;节间极度变短。(3)延迟发病型,比非转基因植株延迟一周发病,病症类似。(4)感病型,与非转基因植株一样接种后第叁周开始发病,两者病症相似。60株转基因植株中免疫型共2株,占3.33%;抗病型共3株,占5%;延迟发病型,共13株,占21.67%;感病型共42株,占70%。用滴花法和抽真空法将反向重复TuMV HC-Pro基因转入拟南芥,两种方法的平均转化率分别为1.15 %和0.48 %。潮霉素抗性筛选,共获得30株转基因植株。基因组PCR以及RT-PCR检测表明TuMV HC-Pro已整合到拟南芥基因组,并获得表达。以雪里蕻(Brassica juncea Coss. var. multiceps Tsen et Lee)子叶、带柄子叶、子叶柄和下胚轴为外植体,在添加不同植物生长调节剂的MS培养基上进行分化培养。结果表明:在4种外植体中,带柄子叶不定芽分化能力最强。子叶和带柄子叶不定芽分化的最适培养基分别为MS + 2 mg/L 6-BA + 0. 4 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3和MS + 2 mg/L 6-BA +0. 2 mg/L NAA + 5 mg/L AgNO3。带柄子叶和子叶不定芽分化的最佳苗龄都为5 d。AgNO3能显着地促进带柄子叶不定芽的分化,以5 mg/L的浓度为最佳。不同基因型对带柄子叶不定芽分化影响不大,但对子叶影响较明显。不定根诱导的最佳培养基为MS+0.2 mg/L NAA。用农杆菌介导的叶盘法,将反向重复TuMV HC-Pro基因转化雪里蕻,初步构建雪里蕻的遗传转化体系。本论文研究了外植体类型、农杆菌侵染浓度和时间,预培养、共培养和预筛选时间,以及筛选和抑菌抗生素的浓度等对雪里蕻转化效率的影响。结果表明:5 d苗龄的带柄子叶,15 min农杆菌侵染时间,OD600值0.6的侵染浓度,3 d的共培养和预筛选时间,15 mg/L Hyg筛选浓度,400 mg/L Car的抑菌浓度,添加活性碳以及150μg/L AS等条件可提高雪里蕻转化频率。PCR检测,只有1株抗性植株能扩增出500bp大小的条带,与预期转入的HC-Pro基因大小相吻合。
吴玲玲[10]2013年在《胞质雄性不育新基因T1243在大白菜中的遗传转化》文中指出目前在大白菜杂交育种实践中,雄性不育材料非常少,本研究旨在将从茎瘤芥(B.juncea var. tumida Tsen et Lee)胞质雄性不育系中克隆获得的T1243基因整合到大白菜基因组中。首先构建含有茎瘤芥的细胞质雄性不育新基因T1243的植物表达载体XF003-T1243；建立大白菜的离体再生体系；并对大白菜的遗传转化体系进行优化,成功获得转基因植株。丰富大白菜不育系的育种材料,为细胞质雄性不育机理研究奠定了基础。本试验的主要研究结果如下：1、大白菜再生体系的建立：以山西地区广泛栽培的5个大白菜品种为材料,带柄子叶为外植体,通过正交设计试验研究了品种、NAA、6-BA、AgNO3等因素对大白菜离体再生的影响。结果显示：品种津育75在培养基MS+2mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+7mg/L AgNO3的条件下再生率最高,达76.92%。2、植物表达载体XF003-T1243的构建：分别酶切从茎瘤芥中扩增获得的T1243和表达载体XF003,然后进行连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因T1243的植物表达载体XF003-T1243,通过PCR和酶切鉴定XF003-T1243载体构建正确,并导入农杆菌LBA4404。3、大白菜的遗传转化体系的优化：以大白菜带柄子叶为外植体,通过农杆菌介导法,优化大白菜的遗传转化体系,得出结论：津育75的最佳筛选培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+7.0mg/L AgNO3+7.5mg/L Kan+200mg/L Amp,外植体在黑暗条件下预培养2d,然后用OD6000.1菌液侵染2min,共培养2d时转化率最高,为35.48%。对抗性植株进行分子检测,结果表明T1243基因已整合到大白菜基因组中,并可以正常表达。
参考文献：
[1]. 榨菜高效再生体系的建立及其遗传转化影响因子的研究[D]. 陈石头. 浙江大学. 2004
[2]. 芥菜类蔬菜高频再生体系的建立及硝酸银的作用[D]. 孔娟. 浙江大学. 2002
[3]. 大豆、榨菜的组织培养及遗传转化研究[D]. 胡小祥. 浙江大学. 2003
[4]. 芥菜离体培养芽再生过程中的生理生化变化研究[D]. 蒋波. 西南大学. 2010
[5]. 植物SAMDC基因分子进化分析以及ySAMDC基因转化番茄研究[D]. 丁淑丽. 浙江大学. 2006
[6]. 大白菜细胞质雄性不育基因orf224和orf138表达载体构建及遗传转化[D]. 范爱丽. 西北农林科技大学. 2009
[7]. 白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建[D]. 余小林. 浙江大学. 2002
[8]. 芥菜类蔬菜的组织培养技术应用研究进展[J]. 何晓蓉, 朱学栋, 刘华强, 杨霞, 闫玉芳. 南方农业. 2015
[9]. 反向重复TuMV HC-Pro基因转化植物的研究[D]. 高乃波. 杭州师范大学. 2009
[10]. 胞质雄性不育新基因T1243在大白菜中的遗传转化[D]. 吴玲玲. 山西大学. 2013