余瑛[1]2003年在《人酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其特性分析》文中研究表明酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)是一种存在于中枢及外周神经系统组织中，对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞有营养和促分裂分化作用的重要生长因子。aFGF广泛参与多种生理和病理过程，在促进创伤愈合，营养和促进神经生长，诱导血管形成及再生等方面具有重要的医学价值。研究目的：利用基因工程技术生产活性蛋白不仅可以大幅提高目标蛋白的产量，还能按照人们的需要改变蛋白的特性，生产出具有优良特性和新功能的生物活性药用蛋白。尽管aFGF是一种生物学效应广泛的生长因子，但在实际应用于某种疾病治疗时，人们更希望它具有较好的细胞特异性。目前商品化的haFGF(human acidic fibroblast growth factor)几乎都是利用大肠杆菌表达的重组haFGF，缺乏明显的细胞特异性。先后有人采用定点突变的方法对haFGF的结构进行改造，但在细胞特异性方面没有取得明显的效果。酵母表达系统具有蛋白质的翻译后修饰加工能力，能对表达的外源蛋白进行糖基化修饰，而大肠杆菌表达系统没有这一特点。对haFGF的mRNA序列分析发现haFGF中存在一些潜在的糖基化位点，这些位点分布在haFGF的叁个功能区。糖基化修饰影响蛋白质功能已经得到了大量证实，利用真核异源表达系统对haFGF进行糖基化修饰可望实现对haFGF特性的改变，尤其当修饰发生在重要的功能区时，可能使haFGF产生新的优良特性，增加新的功能，加宽其临床应用的范围。我们构建haFGF的酵母表达系统，目的就是利用酵母本身所具有的蛋白质修饰加工系统，表达发生了特性改变的重组haFGF，实现对haFGF功能的改进，增加其细胞特异性。研究方法：本研究采用RT-PCR方法，进行了haFGF基因克隆；通过添加限制性酶切位点将haFGF基因定向克隆到相应的表达载体上，构建了haFGF的E.coli、S. cerevisiae 和P. pastoris叁种表达系统；采用ELISA检测体系对E.coli/haFGF、S. cerevisiae/haFGF 和P. pastoris/ haFGF的发酵和表达条件进行了优化；采用肝素亲和层析和凝胶过滤层析方法分别对E.coli、S. cerevisiae 和P. pastori表达的rhaFGF进行了分离纯化；采用SDS-PAGE和Western blot对纯化的目标蛋白进行验证；对P. pastoris表达的haFGF进行了特性鉴定：包括生物活性、稳定性和对血管细胞生长的影响。研究结果：1．利用RT-PCR方法从患子宫肌瘤的妇女子宫内膜组织中成功克隆到了两种不同剪接方式的haFGF基因的编码区cDNA片段。测序结果表明其中一个cDNA片段由3个外显子构成，另一个cDNA片段由2个外显子组成。2．以BL21（DE3）为宿主菌、pET30a(+)为表达质粒，成功构建了E.coli /haFGF<WP=5>表达系统。利用肝素-sepharoseCL-6B亲和层析从诱导后的E.coli /haFGF细胞中分离纯化出rhaFGF（E）（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by E.coli），经肠激酶酶切处理切除6×His标签后，得到了电泳纯的分子量为17kD的rhaFGF(E)。3．以INVSc1为宿主菌，pYES2为表达质粒，成功构建了S. cerevisiae /haFGF表达系统。Dot blot证实经60h摇瓶诱导，rhaFGF(S)（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by S. cerevisiae）表达量达到最高。利用肝素-sepharose CL-6B亲和层析从细胞中纯化出rhaFGF(S)，其分子量为43kD。rhaFGF(S)分子量显着增加表明该蛋白进行了翻译后修饰，发生了结构改变。4．以KM71为宿主菌，pPIC9K为表达质粒，成功构建了P. Pastoris /haFGF表达系统。haFGF基因在该系统中通过整合到宿主的染色体上的方式进行外源基因的表达，表达方式为分泌型。从G418浓度为0.75g/L的转化平板上筛选到表达量相对较高的重组子。pH6.0, 0.5%甲醇诱导48h是最佳摇瓶发酵条件，在该条件下表达的rhaFGF(P)（Recombined human acidic fibroblast growth factor expressed by P. pastoris）经肝素-sepharoseCL-6B亲和层析和G100凝胶过滤纯化，得到两种分子量分别为17kD、35kD的蛋白，经Western blot证实，二者都是目标蛋白rhaFGF(P)： rhaFGF(P1)，17kD； rhaFGF(P2)，35kD。rhaFGF(P2)分子量增加，说明蛋白发生了翻译后修饰，有结构改变。5．rhaFGF(P)的生物活性、稳定性和促进血管内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)增殖的特性。rhaFGF(P1)促进NIH3T3细胞增殖的活性比标准品haFGF高24%，rhaFGF(P2)的生物活性比标准品haFGF低51%；rhaFGF(P1)、rhaFGF(P2)与标准品haFGF一样在水溶液中的储藏稳定性较差。4℃处理rhaFGF后，其增殖能力很快下降，rhaFGF(P1)9天后完全失活、rhaFGF(P2) 7天后完全失活。60℃处理，rhaFGF(P1) 7.5min后完全失活, rhaFGF(P2) 6min后完全失活；与标准品E.coli表达的rhaFGF相比，低浓度下rhaFGF(P1)能更加有效地促进EC生长，抑制SMC增殖。高浓度rhaFGF(P1)强烈促进SMC增殖，rhaFGF(P1)浓度为35.3nmol/L时促进SMC增殖能力最大，可达到对照的3.5-4倍；rhaFGF（P1）浓度为3.53-11.76nmol/L时EC增殖达到最大，为对照的1.5倍。因此，在促进活体血管内皮愈合和防止内膜增生的作用上，低浓度rhaFGF（P1）很可能比E.coli表达的rhaFGF更有优势，这对于预防血管成形术后再狭窄
马艳[2]2007年在《杀菌通透性增强蛋白BPI_（23）和人酸性成纤维细胞生长因子haFGF融合基因的酵母表达及其活性研究》文中进行了进一步梳理杀菌/通透性增强蛋白(bacteriacidal/permeability-increasing protein,BPI)是一种分子量为55 KD的阳离子蛋白(简称BPI55),具有抑制和杀伤G -菌,结合、中和内毒素,促进补体活化,增强调理吞噬,抑制炎症介质生成等功能。重组人BPI N端前199个氨基酸(分子量为23KD的蛋白片段,简称BPI23)保留了完整人天然BPI(nBPI55)的全部生物活性。BPI23分子量较小易于光滑型LPS结合,对光滑型大肠杆菌的活性约是完整BPI的30倍。人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic Fibroblast Growth Factor ,haFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一,能够诱导多种细胞分化、增殖,具有营养和保护神经元、促进损伤修复、诱导缺血区血管形成、促进伤口愈合等功能。创伤愈合是个漫长的过程,在临床治疗过程中仍存在不少障碍,容易受到细菌等感染,引起菌血症或脓毒血症,产生全身炎症反应综合症(SIRS),继之形成多脏器功能障碍综合症(MODS)。将BPI功能性N端BPI23基因和haFGF基因通过非极性疏水柔性肽段(Gly4Ser)3的Linker拼接成BPI23-haFGF融合基因,然后克隆到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPICZαA进行表达,并对该基因的表达产物进行生物活性研究,为能开发出一种既能缩短创伤愈合时间、提高愈合质量又能避免细菌感染的双功能新型多肽类药物打下基础。研究方法与结果①借助Primer Premier 5.0设计2条特异引物,以用Gene SOEing(Gene splicing by overlap extension)技术拼接的带信号肽的BPI23-haFGF融合基因为模板,PCR扩增获得到约1.1 kb DNA片断,克隆至pUCm–T载体序列测定,序列包括编码无信号肽BPI N端前199个氨基酸基因、编码(Gly4Ser)3的Linker基因和不含终止子的haFGF基因,大小为1107 bp。BLAST结果表明:融合基因前段与Genebank上的BPI mRNA序列(登录号:4502446)同源性为99%,融合基因后段与Genebank上的haFGF mRNA序列(登录号:15055546)完全一致。②扩增pUCm -BPI23-haFGF质粒,用Kpn I / Not I切下BPI23-haFGF基因片断,并定点克隆至经相同双酶切的真核表达载体pPICZαA中,构建pPICZαA-BPI23-haFGF分泌表达载体,测序分析,获得编码正确的重组表达载体pPICZαA-BPI23-haFGF。生物信息学软件分析预测编码融合蛋白序列,396个氨基酸,分子量43.5 KD,pI为9.24,具有BPI23和haFGF两个保守结构域,且BPI23保守区序列99%同源,haFGF保守区序列100 %同源。③将SacⅠ线性化的pPICZαA-BPI23-haFGF电转化至毕赤酵母宿主菌X-33中,Zeocin抗性筛选、PCR鉴定后获得稳定工菌株X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF;0.5%甲醇诱导工程菌表达,浓缩上清经15%分离胶SDS-PAGE分析和6×His标签一抗Western Blot鉴定,在约43.5 KD有特异性条带,与目的融合蛋白预测大小相符,表达量为10～20μg /ml。④优化诱导表达条件,探索不同诱导时间、不同温度、不同甲醇浓度和不同pH进行对表达量的影响,结果发现:28℃、pH5.0、甲醇终浓度为1.0%、PMSF终浓度为0.5 mM、诱导4d为最佳表达条件,表达量可达约25μg /ml。经HisTrap? HP亲和层析纯化后,融合蛋白纯度高达90%,回收率约为50%。⑤生物功能评价:1.体外实验:琼脂孔扩散法表明,融合蛋白具有一定的抑制和杀伤革兰氏阴性菌的能力;MTT掺入法检测结果融合蛋白对NIH3T3细胞有促增殖活性,当融合蛋白浓度为0.40mg/ml时,促NIH3T3细胞增殖作用最明显,当浓度高于或低于0.40mg/ml时促增殖效果降低。2.体内实验:造小鼠皮肤浅二度烫伤模型,隔日涂药,以aFGF标准品为阳性对照,以0.9%生理盐水为阴性对照,分别在烫伤后7d、14d、21d取小鼠受损皮肤作病理切片。结果显示,烫伤后第14d样品组创面已基本愈合,溃疡处毛细血管和成纤维细胞远比阴性对照组密集,与aFGF标准品作用相当;样品组比阴性对照组提前2d～3d愈合。结论本实验成功构建了分泌型酵母重组表达载体pPICZαA-BPI23-haFGF,筛选出稳定的工程菌X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF,并成功表达了目的蛋白BPI23-haFGF,体外实验验证融合蛋白具有杀菌和促细胞增殖的双重功能,体内实验表明融合蛋白能促进毛细血管生成和成纤维细胞分裂,改善创面愈合,为BPI23-haFGF在临床上的应用奠定了基础。
安娜[3]2013年在《植物源重组人碱性/酸性成纤维细胞生长因子表达研究》文中认为分子医药农业(Molecular pharming)是通过利用转基因植物或动物作为生物反应器的技术手段,来获得具有药用价值的医药蛋白的方法；分子医药农业的核心技术就是生物反应器,即通过转基因植物或动物来实现规模化生产、成本较低、具有医用价值的重组蛋白或多肽。本研究利用实验室已经建立的水稻胚乳细胞表达平台成功表达了重组人碱性/酸性成纤维细胞生长因子,并研究其生物活性和纯化工艺,主要结果如下：1、利用水稻密码子的偏好性优化bFGF基因,将其插入到包含水稻谷蛋白Gt13a启动子和信号肽的载体序列中编号为pOsPMP277;构建好的载体pOsPMP277和质粒pOsPMP05通过农杆菌双侵染共转化到台北309水稻基因组中。通过Western blot检测,筛选到8个转基因纯合系,蛋白定量分析发现转基因系277-179的表达水平达到185.66mg/kg,其中OsrbFGF(Oryza sativa recombinant basic fibroblast growth factor)的可溶部分大约占9.55%。2、对OsrbFGF的N-末端测序结果表明：在OsrbFGF N-末端存在氨基酸(丙氨酸)的缺失,可能由于水稻内源性肽酶的剪切而丢失；分子量和等电点检测结果显示：OsrbFGF有两个分子量(16kDa和17kDa)和两个等电点(9.55和8.93)与天然bFGF(分子量约为17kDa,等电点为9.6)相比存在一定差异。3、对转基因T1代种子进行遗传学分析发现,277-122和277-179为双位点插入,277-223和277-238为单个位点插入；Southern blot杂交结果表明外源基因在水稻基因组中的拷贝数结果：277-122为3个拷贝,277-179为2个拷贝,277-223和277-238为1个拷贝。4、进一步细胞学分析显示OsrbFGF蛋白的表达造成了水稻胚乳细胞中蛋白体形态的改变；免疫电镜结果显示OsrbFGF蛋白分布在蛋白体Ⅰ、蛋白体Ⅱ和细胞质中,表明OsrbFGF可能以缺损模式(default trafficking)在胚乳细胞内转运。5、我们对OsrbFGF纯化工艺进行摸索,最终建立了1步肝素亲和层析方法纯化OsrbFGF:纯化后的OsrbFGF经SDS-PAGE考染结果显示只有单条带；纯化OsrbFGF纯度>95%；经过5kDa膜脱盐或者100kDa膜去除可能存在的内毒素,最终内毒素含量<1EU/μg；纯化得率为4.49%,即一公斤米粉可以获得8.33mg OsrbFGF。6、利用OsrbFGF进行的NIH/3T3细胞培养实验的结果表明：(I) OsrbFGF刺激NIH/3T3细胞增殖效应呈现剂量依赖性,OsrbFGF活性值约为1.04×106IU/mg;(II) OsrbFGF能有效刺激细胞增殖,其活性与美国Gibco公司大肠杆菌来源的重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic Fibroblast Growth Factor, rbFGF)等同。7、OsrbFGF的药效学评价结果表明：在伤口(割伤和烧伤)愈合早期,OsrbFGF可以通过促进细胞增殖和诱导CD68表达有效促进大鼠伤口的愈合；在伤口愈合后期,OsrbFGF通过降低CD68的表达水平来降低炎症反应,有利于后期伤口创面的组织重塑,防止伤疤的产生。8、利用相同方法表达重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)。通过密码子优化合成的aFGF基因插入到包含Gtl3a启动子和信号肽的载体中,在To代苗期通过PCR检测获得了53株独立转基因系；Western blot杂交验证其中12株转基因系成功表达OsraFGF蛋白。9、对转基因株系107-33-2-3的T1代种子的遗传学分析,表达与不表达OsraFGF(Oryza sativa recombinant acidic fibroblast growth factor)种子的分离比例符合15：1,说明该转基因为双位点插入；Southern blot结果显示,外源的aFGF基因在水稻基因组中为3个拷贝。10、初步的细胞学研究表明：OsrFGF蛋白的表达没有对胚乳细胞中的蛋白体形态造成明显影响。11、对OsraFGF提取及纯化工艺进行了初步的探索。
冯秀萍[4]2009年在《重组人胸腺素β16的表达、纯化和胸腺素β16的应用研究》文中认为Tβ16作为胸腺素β家族成员之一,可通过抗感染和免疫调节作用、刺激成纤维细胞的增殖、促进上皮细胞角化、刺激内皮细胞移动以及促进血管形成等作用来促进创伤修复。本课题应用基因工程重组技术,设计构建含SUMO-Tβ16融合基因的重组质粒SUMO-Tβ16/pET3c,将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经克隆筛选获得了两株DNA测序完全正确的重组工程菌SUMO-Tβ16/pET3c/BL21。该工程菌连续传代100代,经各项指标检测,遗传稳定性很好。重组SUMO-Tβ16融合工程菌,经0.8mmol/L的IPTG诱导,30℃培养6h后,SDS-PAGE电泳显示为可溶性表达。通过DEAE阴离子交换层析→疏水层析→SUMO蛋白酶(Ulp1)剪切→凝胶过滤层析→获得纯度大于95%、比活性为5.3×105IU/mg的Tβ16。体内外生物学活性实验证明:Tβ16具有促进成纤维细胞增殖;促进兔角膜细胞增殖;促进鸡胚绒毛膜尿囊膜的血管增殖;Tβ16凝胶能够促进家兔皮肤烫伤和碱烧伤的愈合。总之,本课题研究结果表明Tβ16可以通过抗感染、促进成纤维细胞增殖和促进血管的再生等作用对创伤进行修复,初步确定Tβ16有效剂量为5~10μg/克,研究结果为Tβ16药物的开发提供实验依据。
邓祥元[5]2009年在《转基因海带配子体的制备与高效增殖》文中提出海带具有很高的营养价值和经济社会价值。自20世纪90年代以来,本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上,根据海带自身特点,建立了海带遗传转化体系(海带孢子体表达系统),它的基本原理是利用基因枪法转化海带配子体,经孤雌或受精途径再生幼孢子体后,用氯霉素筛选幼孢子体获得转基因海带,然后进行海上安全栽培和转基因产品的检测与提取。目前该表达系统已成功实现报告基因(β-半乳糖苷酶基因,lacZ)和功能基因(乙肝表面抗原基因,HBsAg)的稳定表达。由于海带孢子体表达系统需经孢子体再生和海上栽培等阶段,周期较长,而且转基因安全性问题也在一定程度上制约其研究与应用。因此,我们在海带孢子体表达系统的基础上又建立和优化了海带配子体表达系统,并成功实现了报告基因(绿色荧光蛋白基因,GFP)的瞬间表达和功能基因(瑞替普酶基因,rt-PA)的稳定表达。虽然海带配子体表达系统能避免转基因安全性问题,周期较短,但在表达量和生物量积累方面,与孢子体表达系统相比还有较大差距。本文首先在海带配子体表达系统中成功实现了人酸性成纤维细胞生长因子基因(hafgf)和鲎素基因(tac)的稳定表达,制备了转基因海带配子体,然后将光生物反应器培养技术应用于转基因海带配子体的高效增殖,以期解决阻碍海带配子体表达系统发展的量的问题,并为转基因海带配子体的大规模培养提供试验依据和技术支持。本文的研究结果为:1、人酸性成纤维细胞生长因子基因和鲎素基因可以稳定整合到海带配子体基因组中,实现转基因产物的表达。2、根据转基因海带配子体的生长特点,研制开发了一套培养体积为300 ml的鼓泡式光生物反应器,它具有操作简便、成本低廉、适合海带配子体生长等特点。随后将培养体系扩大到2.5 L,并研究了光对转基因海带配子体生长的影响,试验结果显示,转基因海带配子体在光强为30μE m~(-2) s~(-1)时即可达到光饱和生长,最优光周期为14:10 LD,而且蓝光可促进转基因海带配子体的生长。3、在前期研究工作的基础上,为改善反应器内的传质条件,我们又设计研制了2.5 L气升式光生物反应器用于转基因海带配子体的高效增殖。研究发现,气升式光生物反应器较鼓泡式光生物反应器能明显地改善反应器内的传质状态,实现转基因海带配子体更高密度的培养(生物量可达到1,990 mg L~(-1)),是一套高密度悬浮培养转基因海带配子体的有效装置和设备。
田海山[6]2007年在《酸性成纤维细胞生长因子发酵工艺的优化》文中研究表明成纤维细胞生长因子(FGF)是一类来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的具有广泛生物活性的细胞生长因子。到目前为止,发现FGF超家族共有23个成员。酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast Grouth Faltor,aFGF)属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员,是一种具有多种生物效应的多肽调节因子,它对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞有营养促分裂和促分化的作用。在临床上,重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)具有促进创伤的愈合和修复、促进神经生长和营养、促进血管形成和再生、促进内脏损伤的修复等功能。aFGF作为创伤愈合的组织修复因子可用于皮肤损伤、烧烫伤、溃疡(例如角膜溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、溃疡性结肠炎等)、褥疮、整形美容后伤口等各种创伤创面的治疗;作为神经生长和营养因子可用于中枢及外周神经损伤、缺血性脑病、脑外伤及中风后遗症、脑发育不全、癫痫、小脑萎缩、痴呆、偏瘫、脊髓外伤术后治疗等;作为血管形成和再生因子用于慢性心肌缺血(冠心病)、急慢性心肌梗塞等疾病,具有重要的、广泛的医疗价值。为了满足对aFGF这种价格昂贵的细胞因子日益增长的市场需求,本实验将努力探索发酵生产工艺,切实摸索出在产量、表达量及产率方面达到最优化的有效方法,满足工程化生产需要。
吕菲[7]2009年在《碱性成纤维细胞生长因子发酵工艺的优化》文中指出碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Grouth Faltor, bFGF)属于成纤维细胞生长因子家族中的一员,普遍存在于人和动物的各种组织和细胞中,具有广泛的生物学活性。bFGF主要作用于中胚层和神经外胚层细胞,具有促多种细胞分裂、诱导内皮细胞趋化、营养神经元、调节细胞代谢和促新生血管形成等多种功能。近30年来的研究证明,bFGF在创伤愈合和软骨组织修复、对无法进行外科手术的心血管疾病治疗、维持神经元健康、治疗神经组织损伤、神经退化性疾病、由脑血管病和脑外伤引发的缺血性中枢神经损伤等临床领域具有广阔的前景。但是bFGF在人和动物组织中的含量极低,从动物组织中提取的bFGF无法满足其生物学特性研究和临床应用的需要。为了满足对bFGF这种价格昂贵的细胞因子日益增长的市场需求,本实验将努力探索发酵生产工艺,切实摸索出在产量、表达量及产率方面达到最优化的有效方法,满足工程化生产需要。
吴梧桐, 王友同, 吴文俊[8]2006年在《2005年中国生物技术药物研究进展》文中指出通过检索2005年我国SFDA发布批准上市、临床研究和受理的生物技术药物,以及在国内生物学、医药学和大学学报等主要学术刊物发表的论着,对基因工程与蛋白质工程药物、基因药物、治疗性抗体、生物技术药物剂型及体内转运研究、药理药效学研究和生产工艺诸方面的现状及进展进行了总结和简要介绍。
王睿[9]2017年在《生肌双黄散的质量控制及对感染性创面的临床应用》文中研究指明目的:初步建立生肌双黄散的质量标准,控制药品质量;考察生肌双黄散外用于临床感染性创面的起效时间及创面愈合过程中各动态指标的经时改变,以评判其临床应用的疗效和价值。方法:(1)质量标准研究:采用薄层色谱法对生肌双黄散中黄连、虎杖、冰片进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对黄连主要成分盐酸小檗碱进行含量测定;采用留样观察法对生肌双黄散在加速环境下进行连续四个月和长期环境下进行连续六个月的稳定性考察,考察项目包括制剂性状、水分测定、主要组分鉴别及指标成分含量测定。(2)临床观察:设计采用单盲、随机对照的方法,选取2015.06-2016.06在某市级叁甲医院烧伤整形外科因糖尿病溃疡、压力性溃疡及烧(创)伤溃疡需接受门诊或住院治疗的感染性创面患者,按分层随机的方法分为生肌双黄散组、生长因子组和凡士林纱布组,叁组经常规清创后分别给予生肌双黄散、贝复新凝胶及外敷凡士林纱布治疗,每日一次连续治疗八周,每周对创面愈合率、创面渗出情况、肉芽生长情况及局部疼痛程度进行观察,并对叁组创面各项指标的经时改变进行统计学分析。数据结果采用SPSS21.0、SAS9.2统计软件对数据进行处理。结果:(1)建立了黄连、虎杖、冰片的薄层色谱鉴别方法,结果清晰,专属性强;高效液相色谱法测得盐酸小檗碱线性范围为5.21μg/ml-72.9μg/ml,含量为1.56 mg/g,专属性、重现性、精密度、稳定性及加样回收率试验符合含量测定方法学要求;通过稳定性考察,生肌双黄散各项指标无明显变化,稳定性良好。(2)治疗八周后,创面愈合率各组间差异均有统计学意义,生肌双黄散组高于生长因子组(P=0.000),生长因子组又高于凡士林纱布组(P=0.000);创面渗出情况生肌双黄散组与生长因子组相似(P=0.094),均好于凡士林纱布组(P均=0.000);肉芽生长情况生肌双黄散组与生长因子组相比差异无统计学意义(P=1.000),均优于凡士林纱布组(P均=0.000);局部疼痛程度生肌双黄散组好于生长因子组(P=0.030),生长因子组又好于凡士林纱布组(P=0.000)。结论:(1)建立的质量标准能够对生肌双黄散进行准确的定性、定量分析,结果稳定、可靠,重复性好,可用于制剂的质量控制。(2)生肌双黄散用于感染性创面安全有效。
王秀峰[10]2015年在《利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体》文中指出单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)是利用DNA重组技术和蛋白质工程技术合成的一种小分子基因工程抗体,最近在肿瘤的诊断和治疗上得到广泛应用。本研究利用改造的植物病毒载体在烟草(Nicotiana benthamiana)和豌豆(Pisum sativum L.)中瞬时表达抗人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,a FGF)的单链抗体,旨在建立一种安全、高效,易于规模化生产的单链抗体瞬时表达体系。本研究首先利用基于烟草花叶病毒(TMV)的p35S-30B表达载体,建立烟草瞬时表达体系并表达抗a FGF单链抗体,验证sc Fv在植物中表达的可行性;接着利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的p CAPE1和p CAPE2-GFP载体建立豌豆瞬时表达体系,通过叶片注射法在豌豆中瞬时表达sc Fv,寻找更适于sc Fv表达的受体植物;最后建立一种基于豌豆芽苗菜无土栽培的规模化植物瞬时表达系统,并对该系统表达的sc Fv进行纯化及生物学活性分析。本研究的主要结论:(1)利用p35S-30B-GFP载体建立了基于叶片注射法的烟草瞬时表达体系,绿色荧光蛋白(GFP)在病毒侵染后8-10天达到峰值;利用含p35S-30B-sc Fv重组质粒的农杆菌EHA105侵染烟草,瞬时表达的sc Fv具有较强的抗原结合能力。(2)利用p CAPE1和p CAPE2-GFP载体通过叶片注射法建立了豌豆瞬时表达体系,病毒侵染后的10-12天GFP达到最大量累积;成功构建了p CAPE2-sc Fv和p CAPE2-GFP-sc Fv瞬时表达载体,利用叶片注射法侵染豌豆后,分别在RNA和蛋白水平上检测到sc Fv基因的表达,ELISA检测证明sc Fv和GFP-sc Fv与抗原具有较好的结合能力。(3)利用豌豆芽苗菜真空侵染技术,成功建立了一种规模化的外源蛋白瞬时表达体系,GFP表达量高达324 mg/kg.FW,占植株可溶性蛋白含量的1.2%。(4)以豌豆芽苗菜作为生物反应器瞬时表达了抗a FGF单链抗体,通过Ni-柱亲和层析获得了大小约30 k Da的sc Fv蛋白,稀释后的sc Fv蛋白纯品与a FGF抗原具有较强的结合能力。本研究应用植物病毒载体首次在烟草和豌豆中瞬时表达了抗a FGF单链抗体,应用豌豆芽苗菜真空侵染技术成功建立了一种安全、高效的外源蛋白表达新体系,为单链抗体药物的规模化生产奠定实验基础。
参考文献：
[1]. 人酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其特性分析[D]. 余瑛. 重庆大学. 2003
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[5]. 转基因海带配子体的制备与高效增殖[D]. 邓祥元. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2009
[6]. 酸性成纤维细胞生长因子发酵工艺的优化[D]. 田海山. 吉林大学. 2007
[7]. 碱性成纤维细胞生长因子发酵工艺的优化[D]. 吕菲. 吉林大学. 2009
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