（新疆维吾尔自治区中医药研究院 新疆 乌鲁木齐 830000）
【摘要】 抑制肿瘤血管形成已被公认为一种崭新的抗癌战略,以肿瘤血管生成为靶点,开发血管生成抑制剂，是一个十分活跃的研究领域。利用鸡胚绒毛尿囊膜研究疾病机理、血管生成通路，有着广阔的前景。但因实验模型的局限性，需要在实验过程中不断完善。本文对鸡胚绒毛尿囊膜应用于血管生成模型的研究现状进行了综述。
【关键词】 鸡胚绒毛尿囊膜；血管生成；模型
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）23-0007-04
Chicken embryo villus allantois membrane applied in angiogenesis research status quo of the model
Li Jingjie. Institute of Chinese Medicine in Xinjiang, Xinjiang, Urumqi 830000, China
【Abstract】Inhibiting tumor angiogenesis has been recognized as a kind of new anticancer strategy, born in tumor blood essels become targets, the development of angiogenesis inhibitors, is a very active research field. Chicken embryos villi allantois membrane was used to study the disease mechanism, angiogenesis pathway, has a broad prospect. But because of the limitation of the experimental model, need to constantly improve in the process of experiment. In this paper, the chicken embryo villus allantois membrane angiogenesis model is applied to the research status are reviewed.
【Key words】The chicken embryo villus allantois membrane; Angiogenesis; Model
1.定义及原理
血管新生的检测是研究血管新生机制，寻求调节血管新生治疗药物的重要工具。近年来，国内外已经建立了许多体内外筛选模型，细胞模型包括大分子基质细胞培养模型、cytodex3血管新生模型；组织模型则为各种动物的主动脉或静脉血管新生模型；整体模型包括家兔角膜血管新生模型、鸡胚尿囊膜血管新生模型、聚合物植入模型、斑马鱼或水蛭血管新生模型等［1］。
鸡胚作为经典的发育学模型，已经普遍应用于发育学、病毒学、寄生虫学(如原虫)，以及一些肿瘤和非肿瘤性疾病(如子宫内膜异位症)的研究中，因为它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养病毒的方法。鸡胚培养法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等［2］。而在所有应用鸡胚材料的实验中， 鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)是常用的实验材料，鸡胚发育过程中大量尿囊膜血管的形成，为研究血管发生和形成提供了很好的模型［3］，被应用于研究与血管生成相关的疾病的发生机制，筛选和评价药物的血管生成活性及作用靶点。
鸡胚有四层胚膜(卵黄囊膜、羊膜、浆膜、尿囊膜)和两套血管网(卵黄囊血管网、尿囊膜浆膜血管网)。鸡胚尿囊出现在孵育的第3～5d，在孵育4～10d，尿囊腔迅速增大至胚外体腔并包围羊膜，以后尿囊外壁与绒毛膜紧贴形成尿囊绒毛膜。鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）组织学结构有三层：外胚层，位于壳膜下方，由绒毛膜上皮组成；中胚层，富含毛细血管的结缔组织，不成熟的血管散在分布于中胚层；内胚层，位于尿囊由尿囊膜内皮形成。第6～7天的CAM及其血管覆盖了整个卵黄囊表面，且随着胚龄的增加而增大，毛细血管极其丰富。直到第8d形成毛细血管丛，覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛细血管快速增殖持续到第1ld。此后内皮细胞有丝分裂指数迅速下降，到第18d，血管系统形成；CAM主要功能是提供进行气体交换的表面，同时鸡胚尿囊膜功能的行使也依赖于致密的血管网的支撑［4］。
自20世纪70年代Folkman首先提出抗血管生成(anti-angiogenesis)理论至今，人们对血管形成的机制等方面的研究已取得较大进展。有关研究表明，恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于血管新生，但是肿瘤组织缺乏控制血管新生的调节机制，因而，控制正常组织血管新生的机制不能控制肿瘤的血管新生。当肿瘤体积增至2～3 mm3时，肿瘤已不能单纯依靠弥散获取氧气及营养物质，如果无新生毛细血管长入，则肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化，因此，控制血管新生已成为治疗肿瘤的一个靶点。以鸡胚绒毛尿囊膜研究血管新生药物的体内模型成为热点问题[5]。
鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)是研究促血管生成与抗血管生成的理想体内模型。生理情况下，血管形成主要发生在胚胎发育和女性月经周期内膜修复过程。另外，在很多病理情况下，血管生成都起着重要作用。如损伤修复、炎症、恶性肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、银屑病、创伤愈合等也常伴随发生血管新生，特别是肿瘤生长和转移与血管新生密切相关，实体瘤必须依赖血管生成才能生长、侵袭和转移［6］。因为CAM是天然免疫缺陷宿主，而且可耐受一定的温度变化，有利于检测某些对温度敏感的肿瘤细胞的生物学行为。所以，CAM模型常作为移植性肿瘤的实验模型之一，也可作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能，以及抗肿瘤药物作用机制探讨等方面研究的体内实验模型。一般选用孵化第5～9天的活鸡胚进行肿瘤实验研究。鸡胚绒毛尿囊膜技术是一种定性、定量研究体内血管新生的技术，它因实验材料易得、操作简便、实验周期短、不需要特殊设备、结果易于观察等优点而得到广泛应用［7］，成为目前研究药物血管生成作用的最常用体内模型。
2.应用方法
2.1 鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立
鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型建立的过程中因肿瘤不同，移植方式、时间等的不同存在一些差异，大致有以下几个方面：
2.1.1造膜过程中载体的应用
张磊涛等将新鲜成釉细胞瘤组织接种于鸡胚绒毛尿囊膜上，分别观察接种后不同时期的瘤组织大体生长情况及病理切片，造膜中是将消毒后的甲基纤维素膜放置在鸡胚尿囊膜上，将1mm×1mm×1mm大小的成釉细胞瘤组织块放于甲基纤维素膜上，成功建立成釉细胞瘤的鸡胚绒毛尿囊膜侵袭模型［8］。
李萍等成功地建立了鼻咽癌移植瘤模型，选用开窗法将鼻咽癌细胞接种在鸡胚绒毛尿囊膜上，以硅胶圈为接种癌细胞的载体［9］。
以上是有关使用载体的报道，报道相对较少，而采用较多的方法是将细胞直接加在鸡胚绒毛尿囊膜上，目前已研究的鸡胚尿囊膜移植瘤模型中，直接滴加瘤细胞，其中以鼠黑色素瘤B16F10细胞株形成肿瘤的能力最强，其它的研究表明黑色素瘤细胞株、人前列腺癌细胞株形成肿瘤的能力较强，胆管癌细胞次之，人卵巢癌细胞较差[10]。
2.1.2滴加细胞的最佳时间及细胞数量
成瘤阳性率与接种细胞数在一定范围内成正相关，当接种数量超过一定范围时，成瘤率反而降低；同样，鸡胚胚龄在7 日龄～11日龄时，成瘤率与胚龄呈正相关，但超过11龄时，成瘤率下降。具体适宜的接种细胞数及接种鸡胚日龄因肿瘤细胞不同而不同：如人卵巢癌接种细胞数低于107不能成瘤，适宜接种的细胞数每只鸡胚为1×108～1×109[11]。当应用鸡胚尿囊膜技术接种时，有研究报告黑色素瘤细胞株、前列腺癌细胞株接种细胞数在105～106之间就可有较好的肿瘤组织形成能力；人胆管癌细胞须在4×106时移植瘤才形成好，生长快，低于1×106时难以形成新的肿瘤[10]；制备宫颈癌鸡胚模型，接种细胞个数为2.0×106或4.0×106，可以获得理想的成瘤阳性率，鼻咽癌细胞在CAM上适宜成瘤接种细胞数是0.5～1×106。许多动物实验证明只有当肿瘤细胞数大于1×106时才可以形成新的肿瘤，达到5×106时肿瘤形成好，生长快。只要细胞浓度足够(因瘤细胞种类而异，一般加入绒毛尿囊膜上的瘤细胞浓度以5×106/胚为好)，移植瘤成功率仍较高，还可避免某些影响因素的干扰[10]。
人骨肉瘤接种适宜采用9日龄鸡胚，成釉细胞瘤等其它肿瘤鸡胚移植瘤模型适宜接种的鸡胚日龄为7～10d，但宫颈癌的适宜接种鸡胚日龄达到11d，可能表明成瘤率与肿瘤细胞自身特性密切相关[12]。转移能力高的肿瘤细胞株，血管生成能力明显高于转移能力低者。所以，细胞转移率不同、恶性程度不同，其诱导鸡胚CAM血管生成的能力存有差异，这种差异系引发明显的以及高峰的血管生成所需的接种细胞数量不同所致[10]。所以在建立不同肿瘤细胞株的鸡胚尿囊膜移植瘤模型时，先摸索出模型建立的条件(接种的细胞数、按种后肿瘤组织的生长情况和血管生成的变化规律)，然后确立鸡胚移植瘤及血管生成模型建立的最佳条件是很有必要的。目前成釉细胞瘤[8]、鼻咽癌细胞[9]、宫颈癌细胞[12]、肝癌细胞[13]、骨肉瘤细胞[14]、胃癌细胞[15]、胆管癌细胞[16]、人胰腺癌细胞等的鸡胚移植瘤模型均有报道。
2.1.3暴露鸡胚绒毛尿囊膜的方法
造膜过程中大致有三种方法选择：
假气室法，取孵育第7～10天的鸡胚，用尖针在鸡胚气室表面扎一小洞，可使鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡胚的内壳膜分开，照蛋灯下寻找胚头，在胚头右下方0.5～1.0处划定开窗位置，消毒蛋壳表面2／3区域，在蛋壳表面划刻出凹痕，轻揭凹陷处蛋皮，轻轻撕掉内壳膜，此时该处下陷，形成假气室[17]，该处的CAM为造膜位置，但该法需要事先通过照卵灯确定胚头的大致位置才能决定开窗位置，由于蛋壳厚薄、颜色等原因很难准确确定合适的开窗位置，使得样品的加入位置不太统一，影响对试验效果的观察，而且由于尿囊膜紧贴在壳膜上，磨切蛋壳时很容易使尿囊膜破裂，使得蛋胚的存活率降低[18]。
平皿法是将孵育3d的鸡胚无菌条件下祛除蛋壳移入平皿中继续孵育的方法，该方法克服了开窗法难以确定合适的加样部位的缺陷，它可以使平皿中孵育的绒毛尿囊膜水平生长，整个血管网清晰可见，能使样品植入部位一致[18]，并可在同一部位多次给药，观察结果简便，克服了开窗法难以确定合适的加样部位的缺陷，观察结果简便可靠，但平皿法需要将鸡蛋中的鸡胚打入平皿中，在打蛋的过程中，对绒毛尿囊膜的丝毫损伤都会影响绒毛尿囊膜的孵育。这极大的降低了蛋胚的存活率。另外，将鸡胚移入平皿后机械刺激、温度变化、脱离蛋壳的环境等因素使鸡胚死亡率增高，因而打入平皿后的鸡胚一般只能存活2～4d，这大大的降低了对样品绒毛尿囊膜血管新生作用时间的观察以及蛋胚的利用率[18]。
无气室孵育法[19]汲取了开窗法和平皿法的优点，采用从蛋胚的气室端开口去除气室后孵育的方法。是目前运用较多的方法。方法是在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用镊子在蛋胚气室端戳一小口，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，开口约为1.5 cm×1.5cm。然后用无菌针头挑破气室膜，注入数滴生理盐水， 以便气室膜与CAM膜分开，然后用镊子轻轻去除上层的气室膜， 暴露下层的CAM膜。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆优点是从气室端开口不会破坏绒毛尿囊膜，并且开口后，可以借此清楚的观察到绒毛尿囊膜上血管的生长状况，确定最佳的加样部位，在继续孵育过程中还可以观察绒毛尿囊膜上血管的生长状况，决定合适的样品作用时间，孵育结束后用甲醛固定，绒毛尿囊膜血管网以及加样部位不易发生位移，便于结果的直观显示。无气室孵育法在整个试验过程中，鸡胚都在蛋壳中孵育，汲取了开窗法的优点，避免了平皿法对鸡胚的损伤，同时在该方法进行过程中较少有机会损伤到绒毛尿囊膜，因此该方法的蛋胚存活率较高。
2.2 药物的血管生成模型
2.2.1 CAM抑制血管生成的研究
目前已有研究举例如下：潘子明[20]、耿怀成等[21]、高勇等[22]均证实人参皂苷Rg3抑瘤作用机制与抑制肿瘤的新生血管形成有关。王世军等[23]研究了川芎嗪、葛根素、银杏黄酮及三七皂苷对鸡胚尿囊膜血管生长的影响，结果发现川芎嗪、银杏黄酮能够减少鸡胚尿囊膜血管数目和血管面积。李晓丽等[24]采用血清药理学方法制备加味保安方含药血清，结果证实加味保安方含药血清可抑制鸡胚尿囊膜血管新生。杨晓冉等[25]采用平皿法，证实B-七叶皂苷钠能显著抑制鸡胚血管的新生。王玮琴等[26]观察青蒿琥酯对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响，结果表明青蒿琥酯有较强的抗肿瘤细胞浸润作用，以及抑制新生血管增殖的作用，并且呈剂量依赖性。张前等[27]从红花中提取分离羟基红花黄色素A，通过实验得出羟基红花黄色素A能显著抑制CAM新生血管生成。杜钢军、林海红等[28]采用鸡胚绒毛尿囊膜模型证实了反应停能抑制血管新生，且随剂量增加抑制新生血管的阳性率升高。王南瑶，李苏宜，赵伟等[29]观察和比较华蟾素注射液、三氧化二砷注射液单药以及联合用药后对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的抑制作用，结果华蟾素组、三氧化二砷组和华蟾素联合三氧化二砷组对鸡胚尿囊膜血管新生均有抑制作用，以两药联合后抑制血管的作用最强。目前越来越多的中药提取物成分逐渐受到人们的关注并逐渐用于抗血管生成的研究。中药及其成分在新型血管生成抑制剂的研发方面具有潜在的价值，已发现雷公藤、土槿皮、昆布、蟾酥、云芝、紫杉醇、多西紫杉醇、参一胶囊、复方丹参注射液等中药和制剂具有抗血管生成活性[30]。皂苷作为植物界分布最为广泛的一类化合物， 人参皂苷、柴胡皂苷、七叶皂苷、乌苏酸、海参皂苷E、合欢皂苷J8、土贝母苷甲、铁破锣皂苷、铃兰苦苷、刺五加皂苷[31]等都有不同程度抗血管生成作用[32]。
2.2.2 CAM促进血管新生的研究
利用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)模型进行血管生成的研究，国内主要集中于抑制血管生成方面，而在促进血管新生方面的研究相对较少，通过鸡胚绒毛尿囊膜研究药物促进血管新生的药物多用于抗血栓、冠心病等的治疗，胡兵[33]等研究表明黄芪、当归、人参、红景天、淫羊藿、丹参、莪术、三七、赤芍、柴胡、葛根、瓜蒌、白果、党参等抗癌中药具有促新生血管生成作用；此外，降香、鹿茸、肉桂、川芎、红花等中药也可能具有促新生血管生成作用，用于缺血性心脑血管疾病、组织修复相关疾病的治疗。叶子等[34]探讨了麝香保心丸含药血清促鸡胚尿囊膜(CAM)血管生长的适当作用条件。蒋霞等[35]探讨了部分冠心病常用中药对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响，结果表明红景天和降香具有良好的促血管生成作用。
2.2.3药物载体的选择
在CAM法中，固态待测物可直接加入，液态物质需要适宜载体，使药物在局部缓释起效及定位。常用的药物载体有：(1)明胶海绵；(2)中速定性滤纸；(3)快速定性滤纸；(4)混合纤维素滤膜；(5)双蒸水配制浓度为1%M-450羧甲基纤维素溶液；(6)擦镜纸。通过实验显示，各载体对CAM血管都有不同程度的刺激，6种载体的血管数目以混合纤维素滤膜最低，依次为羧甲基纤维素、中速定性滤纸和快速定性滤纸、擦镜纸，以明胶海绵最高[36]。但混合纤维素滤膜在放入24h后，滤膜上出现数个出血点，刺激血管局部出血，而中速定性滤纸、快速定性滤纸周围可见明显的血管数目增加，且多是粗大血管呈以载体为中心的放射状分布，明胶海绵刺激产生的血管数目最多，多是粗大血管，基底部有暗红色血窦出现.甲基纤维素对CAM的异物刺激作用最小，而且透明，可观察载体盘下的血管形态。从以上结果可以看出，不同载体对CAM的影响不同易造成假性结果，应根据实验要求选择相应载体，如明胶海绵显著刺激血管增生，利于观察药物对血管的抑制作用；1%M-450羧甲基纤维素对CAM的刺激作用较小、质地透明更有利于观察促进血管生成作用，便于观察分析［37］。
3.展望
目前，抑制肿瘤血管形成已被公认为一种崭新的抗癌战略，以肿瘤血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个十分活跃的研究领域.抗血管形成的研究已推广到新生儿血管瘤病、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病性视网膜病变等疾病的治疗;而促进血管生成对心血管疾病、胃肠道消化性溃疡等疾病的治疗也有一定的意义[38]。利用鸡胚绒毛尿囊膜研究疾病机理、血管生成通路有着广阔的前景，但因实验模型的局限性，鸡胚非哺乳动物组织，与人体差异较大；并不能完全重现肿瘤及药物在人体内的作用过程，而且实验中存在很多影响实验结果的环节，如蛋壳碎屑、血凝块、药物载体等，容易出现非特异性炎症反应。而且CAM无法评价须代谢激活的药物。这些影响因素都需要在实验过程中不断完善，找到重复性强、可信度高的合理造模形式。
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论文作者:李晶洁
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第23期供稿
论文发表时间:2015/10/14
标签：血管论文; 绒毛论文; 模型论文; 新生论文; 肿瘤论文; 细胞论文; 作用论文; 《医药前沿》2015年第23期供稿论文;