乔永[1]2007年在《湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究》文中提出为了给绵羊肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)沉积规律及相关基因表达规律的研究提供基础资料，本文以0～6月龄的雄性湖羊羔羊为试验对象，探讨了湖羊羔羊不同部位肌肉(背最长肌、腰大肌、后腿股二头肌和前腿肱二头肌)肌内脂肪沉积的发育性变化以及脂肪沉积和代谢相关基因表达的发育性变化特点。本研究用索氏抽提法测定肌内脂肪含量；以GAPDH基因为内标，用real time PCR法对影响肌内脂肪含量的部分相关基因的表达进行了相对定量分析；并对基因表达与肌内脂肪含量的相关性进行了分析。研究结果如下：1．湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积的发育性变化(1)湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪含量在0-6月龄间均呈上升趋势，5月龄时极显着高于前面各月龄(P＜0.01)；在背最长肌中，2月龄时IMF显着高于初生时(P＜0.05)；腰大肌IMF在3月龄时显着高于初生时(P＜0.05)；后腿股二头肌IMF在前4个月龄时差异均不显着；在0～6月龄间，背最长肌IMF量均高于腰大肌和股二头肌；表明肌内脂肪沉积在绵羊不同部位肌肉沉积的速度有较明显差异，湖羊肌内脂肪的沉积有较明显的组织特异性。(2)4～5月龄是湖羊羔羊肌肉脂肪沉积最快的时期，5月龄时的肌内脂肪含量在不同肌肉部位都极显着高于前面各月龄(P＜0.01)，表明4～5月龄时是湖羊羔羊肌内脂肪迅速沉积的一个重要时期。2．湖羊羔羊肌肉OB基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)在湖羊羔羊背最长肌中，OB基因mRNA表达水平3月龄时极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；在腰大肌中，初生时表达水平最高，显着高于2～3月龄(P＜0.05)，3月龄时下降到最低，到4月龄后回升；在前腿肌肉中，初生羔羊的OB基因表达量最高，显着高于3、5和6月龄(P＜0.05)，然后随月龄增加而波动下降，6月龄时降到最低；后腿肌肉中，初生时OB基因表达量较低，随月龄的增加而上升，3月龄时升到最高，极显着高于初生时(P＜0.01)，显着高于其余各月龄(P＜0.05)，然后4月龄时回落，并保持这种低水平表达；(2)初生时腰大肌和前腿肌肉OB基因表达水平极显着高于背最长肌和后腿肌肉(P＜0.01)，3月龄时背最长肌极显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.01)，后腿肌肉显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.05)；表明OB基因mRNA表达水平发育性变化在湖羊羔羊肌肉中表现出较明显的组织特异性；(3)背最长肌中OB基因的表达与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.405，P=0.119)，股二头肌OB基因的表达量与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.303，P=0.194)，表明OB基因在肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积起着一定的负作用。3．湖羊羔羊肌肉OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)OBR基因mRNA在湖羊羔羊不同部位肌肉中的发育变化模式基本相同，即在刚出生时表达量均较低，然后随月龄增加而上升，到3月龄时各部位均升到最高，然后又下降，保持一个相对较低的水平；腰大肌中，2月龄时OBR mRNA的表达水平极显着高于0～1月龄和4～6月龄(P＜0.01)；背最长肌中OBR表达水平在3月显着高于2和6月龄(P＜0.05)；OBR基因在肱二头肌中的表达水平在3月龄时极显着大于其余各月龄(P＜0.01)；在股二头肌中，3月龄时OBR基因表达水平极显着大于0～1和5～6月龄(P＜0.01)，显着高于4月龄(P＜0.05)，6月龄水平显着低于2月龄(P＜0.05)；(2)2月龄时股二头肌OBR基因mRNA表达量极显着高于背最长肌(P＜0.01)，3月龄时肱二头肌和股二头肌均高于腰大肌和背最长肌(P＜0.05)，4月龄时股二头肌极显着高于腰大肌(P＜0.01)，表明OBR基因在湖羊羔羊肌肉中的表达呈现出组织特异性和时序性发育变化模式；(3)股二头肌中OBR基因的表达量与IMF在本研究中的各月龄均呈明显的负相关(r=-0.433，P=0.012)；在背最长肌(r=-0.128，P=0.209)和腰大肌中(r=-0.254，P=0.168)也发现成负相关，表明OBR基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积也起一定的负作用。4．湖羊羔羊下丘脑OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊下丘脑OBR基因在0～6月龄间保持稳定表达水平；(2)湖羊下丘脑OBR基因表达水平与各部位肌肉肌内脂肪含量无明显相关性。5．湖羊羔羊肌肉FAS基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊背最长肌中FAS基因mRNA表达在初生时较低，然后波动上升，到5月龄时升到最高(P＜0.01)；在腰大肌中，FAS基因mRNA水平变化呈现出先高后低的趋势，2月龄时最高，极显着高于4～6月龄(P＜0.01)，4月龄时最低，极显着低于0～2月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中，FAS基因mRNA水平随月龄的增加先上升后下降，到3月龄时升到最高，极显着高于其余各月龄(P＜0.01)，然后下降保持相对较低水平的表达；后腿肌肉中FAS基因表达量初生时较低，波动上升，到3月龄时最高，然后4月龄时下降到最低，极显着低于3和6月龄(P＜0.01)，5～6月龄缓慢回升；(2)除4月龄时，腰大肌FAS基因mRNA水平均极显着高于其余各部位肌肉(P＜0.01)；2月龄和5～6月龄时背最长肌FAS表达也极显着高于其余各部位(P＜0.01)；3月龄时前腿肌肉FAS mRNA水平极显着高于其它部位肌肉(P＜0.01)。表明FAS基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性；(3)背最长肌FAS基因表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.606，P=0.005)，腰大肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.360 P=0.187)，股二头肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.471，P=0.076)，表明FAS基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着正向调控的作用。6．湖羊羔羊肌肉HSL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)HSL基因在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化表现为：背最长肌中初生时最低，然后随月龄的增加上升，3月龄时出现峰值，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，然后又下降，6月龄时升到最高，极显着高于以前各月龄(P＜0.01)；腰大肌中表现为“下降-上升-下降-上升”的模式，3月龄时最高，极显着高于1和4月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中先下降，后上升，再下降保持稳定，2月龄时最低，极显着低于刚出生时(P＜0.01)；后腿肌肉表现为先上升，后下降，又上升的模式，3月龄时最高，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，4月龄时最低，极显着低于3月龄(P＜0.01)；(2)在0～6月龄，腰大肌中HSL基因mRNA表达量均极显着高于其它部位(P＜0.01)，0月龄时背最长肌极显着低于其它部位．(P＜0.01)，4月龄时股二头肌极显着低于其余部位(P＜0.01)，6月龄时背最长肌极显着高于前腿和后腿肌肉(P＜0.01)；表明HSL基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性，其中在腰大肌中的表达量显着高于其余各肌肉部位；(3)对湖羊羔羊不同部位肌肉中HSL基因的表达量和IMF的相关性分析表明：各部位肌肉中两者均呈正相关关系，其中背最长肌在0～6月龄呈极显着相关(r=0.630，P=0.0003)，腰大肌和股二头肌中4～6月龄两者的相关系数分别为0.589(P=0.020)和0.280(P=0.121)，表明HSL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪沉积的调控可能不是在mRNA水平，可能在蛋白水平上。7．湖羊羔羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)LPL基因在湖羊羔羊不同肌肉部位表现出较明显的差异：在背最长肌中LPL基因的表达随月龄的增加而上升，到5月龄时升到最高，显着高于1～4月龄(P＜0.05)，极显着高于0月龄(P＜0.01)；在腰大肌中LPL水平初生时较高，到1月龄时上升，到3月龄间稳定，4月龄时下降到最低，5～6月龄回升到1～3月龄时的水平，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中，0～2月龄保持稳定，3月龄时升到最高，4月时下降，5月龄时上升，到6月又下降，其中3和5月龄时的表达量极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；后腿肌肉中，LPL基因初生时较高，然后下降，到3月龄时升到最高，4月龄时下降，5～6月龄又回升，各月龄间差异不显着；(2)在刚出生时，股二头肌中LPL mRNA水平极显着高于其余部位肌肉(P＜0.01)，1～2月龄时腰大肌和股二头基因表达量均高于另外两个研究部位(P＜0.05)，3月龄时股二头肌极显着高于背最长肌(P＜0.01)，4月龄时背最长肌和股二头肌均显着高于另外两个部位(P＜0.05)，6月龄时肱二头肌极显着低于其余叁个部位(P＜0.01)；(3)湖羊羔羊背最长肌中LPL基因的表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.503，P=0.005)，在股二头肌肌肉中，LPL基因mRNA水平与IMF呈正相关(r=0.294，P=0.102)，表明LPL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积有一定的积极作用。8．湖羊肌肉UCP3基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊不同部位肌肉中UCP3基因表达的发育性变化表现为：在背最长肌中，初生时较高，到1月龄时升到最高，然后随月龄增加下降，6月龄时降到最低，各月龄间差异不显着；腰大肌中表现为先上升后下降的模式，3月龄时出现峰值，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中初生时较高，1月龄有所下降，2月龄升到最高值，3月龄下降到最低，4月龄回升后又逐渐下降，各月龄间差异不显着；后腿肌肉在各月龄间保持较稳定的水平，没有较大差异；(2)在3月龄时腰大肌中UCP3基因表达水平显着高于其余叁个肌肉部位；表明UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的发育性变化有差异，但差异不明显。(3)湖羊羔羊背最长肌中UCP3基因的表达量与背最长肌IMF在0～6月龄呈负相关(r=-0.211，P=0.262)；在股二头肌肌肉中，UCP3基因mRNA水平与股二头肌中IMF在2～6月龄间呈负相关(r=-0.209，P=0.328)；在腰大肌中，UCP3基因的表达量与IMF在3～6月龄成负相关(r=-0.286，P=0.266)，表明UCP3基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着负向调控的作用。
郑玲[2]2007年在《“逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究》文中研究指明“治未病”是中医基础理论的重要组成部分,是《内经》以预防为主的学术观点的具体体现,对后世影响深远。“逆针灸”作为中医“治未病”的重要方法之一,即在机体无病、疾病发生之前或疾病发展轻浅之时,预先应用针灸的方法,以激发经络之气,扶助正气,调动机体内在调衡阴阳的能力,从而达到防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害或保健延年的目的。逆针灸防病保健的作用已被大量研究证实,但其确切的作用机制尚在探询中。随着现代应激理论研究的深入,机体具有内源性保护机制已被广泛证实,利用人为手段使机体适度应激,预防或减轻随后疾病正引起医学界的高度重视。其特点在于:并非向机体补充大量的外源性物质,而是采取一些理化的预处理手段激发机体应激,启动机体内源性保护机制,加强机体对随后疾病损伤的抵抗与耐受力,是一种充分重视机体自身潜力激发与调动的整体调节方法。这正是“逆针灸”防病保健的特色所在,因而极具研究与开发潜力。更年期是妇女衰老进程中的关键启动期,此期由于肾元渐衰,天癸将竭,导致机体内环境急剧变化,多系统出现动荡与紊乱,机体处于一种生理性应激状态,在调整过程中不能适应而造成的由生理性应激转变成的病理性应激,致使70%～90%的更年期妇女出现繁杂多变的更年期综合征。更年期综合征的发生机理尚未完全明了,而应激反应中诱导生成的热休克蛋白与更年期时机体诸多环节如神经内分泌、免疫、抗氧化、雌激素受体、胰岛素受体功能等密切相关,因此探讨热休克蛋白在更年期机体中的作用,对于防治更年期综合征具有重要意义。本课题结合中医“治未病”的学术思想和现代应激医学理论,以自然更年期大鼠为模型,采用免疫组化、原位杂交、放射免疫、免疫比浊等方法,观察逆针灸关元穴对随后不同月龄自然更年期大鼠热休克蛋白、应激激素、神经递质、抗氧化相关因子及免疫因子等的影响,试图从HSP70及HSP70mRNA的角度探询逆针灸关元穴防治更年期综合征的相关应激机制。主要实验结果及结论如下:1.大鼠进入更年期后下丘脑不同核团HSP70及mRNA的表达随着月龄的增长表现不同的分布趋势,即视上核呈波动性升高,而室旁核和弓状核升高的幅度随着月龄的增长有下降的趋势。提示下丘脑不同核团在介导更年期中枢应激反应中发挥着不同的作用。下丘脑CRH含量的波动性降低和血浆ACTH、皮层5-HT含量的波动性升高,提示更年期大鼠HPA轴处于异常活跃状态,应激激素可能通过受体结合途径激活中枢吲哚类神经递质的大量合成。同时下丘脑抑制性应激激素β-EP含量却呈增龄性波动下降,皮层NE含量呈波动性升高,提示机体抑制性激素降低增强应激兴奋性的同时,也削弱了对儿茶酚胺神经元的紧张性抑制作用。预先针灸关元穴可不同程度的下调视上核HSP70及mRNA的表达,上调弓状核HSP70及mRNA的表达。提示逆针灸能够降低应激兴奋性因素,提高抑制性因素,有利于减缓应激中枢异常活跃状态。而对于应激反应中心核团的室旁核作用复杂,表现为各月龄HSP70mRNA的表达增强,说明逆针灸能够提高下丘脑室旁核应激调节中枢的警觉状态,转录大量HSP70mRNA以增强细胞应激保护能力。而12、14月龄HSP70表达的下调,可能与逆针灸提前诱导的HSP70在组织细胞中发挥保护效应减轻组织损伤、减缓应激反应程度有关;16月龄HSP70表达的升高,可能由于细胞内有害物质蓄积增多,逆针灸作用后使得机体翻译合成更多的HSP70以加强机体防御适应反应的能力,从而表现出双向性的调节作用。逆针灸下调CRH的作用主要表现在12、14月龄,对于血浆ACTH的调节表现为12月龄升高,14月龄降低,以缓和14月龄骤然升高的ACTH水平。而对于β-EP的上调和NE、5-HT的下调作用则主要体现在12月龄。提示逆针灸对中枢应激激素及神经递质的调节以早期效应为主。而逆针灸是否通过调节下丘脑重要核团HSP70及mRNA的表达及功能活动影响相应核团应激激素的合成和释放从而调节中枢神经递质的水平及其他神经内分泌功能,改善更年期精神及植物神经紊乱状态,有待于进一步研究。2.更年期机体应激反应使得CRH大量释放,能够造成对GnRH、垂体促性腺激素及卵巢雌激素合成的抑制作用,同时也可诱导细胞内热休克蛋白的生成。本实验观察到随着大鼠月龄的增长子宫HSP70及mRNA的表达呈先增后降的变化,早期热休克蛋白的增加可能与CRH的增加及局部雌激素水平下降对HSP抑制作用的降低有关,但随着组织器官的衰退,其蛋白合成能力下降,因而表现出晚期热休克蛋白及基因表达下调。同时随着机体进入更年期子宫SOD、NOS活性明显降低,而经逆针灸作用能增强各月龄组HSP70及mRNA的表达;且提高SOD、NOS的活性,主要表现在12、16月龄。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠子宫产生保护作用机制可能通过减缓应激中枢的异常活跃状态,提高不同月龄外周子宫组织细胞HSP70及mRNA的表达,以促进组织SOD、NOS活性的增强,对抗应激激素及卵巢功能衰退引起的子宫靶器官的结构及功能的改变,提高机体抗氧化能力,增强NO/NOS的局部调节作用,减轻随后更年期衰老过程中自由基对组织器官的损害及组织器官功能紊乱,对于维持子宫正常的结构和功能,延缓子宫退行性变具有重要作用。3.更年期时机体的应激状态不仅引起机体神经内分泌系统的应答,同时也对免疫系统功能活动产生重要影响。本实验观察到更年期早期血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量的下降,可能与机体应激导致血液和组织中神经递质及肽类激素含量升高,对免疫细胞产生的抑制性调节作用有关。而同时这些神经递质和肽类激素也能够诱导免疫细胞HSP的表达,因而表现出更年期大鼠早期脾脏HSP70mRNA表达的增高。随着月龄的增长,脾脏HSP70及mRNA的表达、血清IL-2的含量呈增龄性下降,而血清TNF-α的含量显著升高,提示机体在更年期衰老进程中由于自身保护能力和免疫功能的降低,可能导致有害物质在体内的蓄积,刺激TNF-α大量合成。而预先运用逆针灸的方法后,不同月龄更年期大鼠脾脏HSP70及mRNA的表达明显增强,血清IL-2含量显着升高,以14、16月龄尤为明显,且能提高更年期早期血清TNF-α的含量,降低更年期晚期TNF-α的过度表达。提示逆针灸关元穴对随后更年期大鼠免疫系统功能调整作用的机制可能与其调节应激中枢的功能状态,增强脾脏组织细胞HSP70及其基因表达,进而调节IL-2、TNF-α的合成、分泌及其生物学效应等相关,从而提高机体对外源性抗原的免疫应答能力,降低自身免疫炎性反应和组织器官损伤,减轻更年期应激状态下机体免疫系统功能的抑制或紊乱状态,对于延缓免疫系统退变和功能紊乱造成的机体衰老加速具有重要意义,并表现出良性、双向性的调整作用。综上所述:逆针灸关元穴可能通过调节中枢(下丘脑)及外周(子宫、脾脏)组织细胞热休克蛋白及基因的表达,调动了机体内在的抗病与应变能力;从而减缓中枢应激过度活跃状态,一定程度上降低脑内神经递质的异常分泌,提高子宫SOD、NOS的活性,调节血清免疫因子IL-2、TNF-α的含量,对于维持机体内环境稳定,调整更年期植物神经及免疫功能紊乱,改善子宫退行性变化具有一定作用。
曹水娟[3]2007年在《羟基红花黄色素A促大鼠局灶性脑缺血后血管新生作用的分子基础初探》文中研究指明目的：促脑卒中后的血管新生治疗是近年来抗脑缺血药物研究的热点之一。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是传统活血化瘀中药红花的主要活性成分之一。我们前期研究结果提示HSYA可能通过促进血管新生而发挥脑保护作用，本研究旨在对其促脑缺血后血管新生的早期分子基础做初步探讨。方法：1．建立线栓法致大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，设缺血后6h、12h、24h叁个时间点，每个时间点分为假手术组(n=8)、模型组(n=8)、阳性对照药组(MK801 0.5mg／kg，n=8)和HSYA治疗组(60mg／kg，n=8)。缺血后即刻舌下静脉给药，HSYA组以一个半衰期(30min)为间隔连续给药5次(每次12mg／kg)，总给药剂量60mg／kg。于脑缺血后6h、12h和24h叁个时间点分别观察HSYA对脑缺血大鼠神经行为障碍和MCAO大鼠脑梗死体积的影响。2．以MCAO大鼠为模型，设缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h五个时间点，每个时间点分为假手术组、模型组和HSYA治疗组(n=3)，给药方法同上。选用包括与血管新生密切相关的生长因子、生长因子受体、黏附分子、转录因子等113个基因的血管生成功能分类基因芯片，检测HSYA在各个时间点对大鼠缺血侧皮层半暗带中血管新生相关基因转录水平的影响。使用综合型GEArray表达分析配套软件进行完整的芯片数据分析。3．在分析基因芯片结果的基础上，应用RT-PCR法观察HSYA对线栓法致急性脑缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGF、Flt、bFGF、aFGF五个血管新生密切相关基因的mRNA表达的影响，以GAPDH为内参，结果采用图像分析软件进行半定量分析。同时采用实时定量PCR法分析HSYA对大鼠急性脑缺血后3h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响。以GAPDH为内参，获得HIF-1α、VEGF mRNA的相对含量做组间比较。4．采用Western Blotting法分别观察HSYA对线栓法致急性脑缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血侧皮层半暗带中HIF-1α、VEGF、Flt、bFGF、aFGF蛋白表达的影响，以GAPDH为内参，结果采用图像分析软件进行半定量分析。结果：1．与假手术组相比，缺血后6h、12h和24h，模型组大鼠神经行为障碍明显，脑梗死体积显着增加，阳性对照药MK801静脉给药明显改善脑缺血动物神经症状，减小脑梗死体积(P＜0.05)；HSYA给药组各个时间点动物神经行为症状均得到明显改善，脑梗死体积显着减小(P＜0.05)。2．基因芯片结果提示，与假手术组比较，缺血24小时内MCAO模型组有75个基因表达发生显着变化，其中19个显着上调，56个显着下调；大部分血管新生激活基因(如缺氧诱导因子、酸性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等)在缺血后有不同程度的表达下调；IL-1β、MCP-1等炎症和趋化因子基因持续上调；抗炎细胞因子IL-10在缺血后3h和24h显着下调。而HSYA给药组，有85个发生显着变化，其中58个显着上调，27个显着下调。上调最为明显的是血管新生诱导因子基因(如HIF-1α、VEGF、aFGF、Ang2等)和炎症相关因子基因(女HIL-6、IL1β、IL-10等)；下调的有凝血酶敏感素等基因。3．RT-PCR和实时定量PCR结果综合显示，与假手术组比较，缺血后3小时模型组脑皮层半暗带的VEGF、HIF-1α、Flt、bFGF基因表达有显着下调(P＜0.05)，而HSYA可使aFGF、bFGF、Flt、HIF-1αmRNA表达明显上调(P＜0.05)；缺血后24h，在模型组中HIF-1α、Flt mRNA表达上调的基础上，HSYA可使bFGF、VFGF mRNA表达显着增加(P＜0.05)。4．蛋白免疫印迹研究显示，MCAO后24h内，HSYA可先后使缺血侧脑皮层半暗带HIF-1α、Flt、aFGF、bFGF蛋白的表达显着上调，与模型组比较有显着差异(P＜0.05)，其上调作用具有不同的时相性。HSYA可上调VEGF的蛋白表达，但与模型组比较未见显着差异。结论：基因芯片结果提示内源性的促血管新生相关基因的表达在脑缺血后24h内经历了一个先下降后上调的动态过程，同时提示HSYA促血管新生早期的分子作用机制是一个多因子多通路参与的网络化过程，其中对血管新生相关基因(如HIF-1α、VEGF、aFGF、Ang2、Ephrin-A1等)的上调作用可能是其分子基础之一。在基因芯片的基础上，通过分子生物学技术初步证实aFGF、bFGF、Flt、HIF-1α、VEGF等因子在转录和蛋白水平的上调可能是HSYA促血管新生的主要分子基础。HSYA对于其它血管新生基因的调控作用还有待进一步实验的探讨。以上结果既为前期观察到的血管新生现象提供了分子水平的解释，又为下一步更深入的探讨HSYA促血管新生的作用机制提供了靶标。
刘頔[4]2016年在《ERK信号通路在高糖诱导的髓鞘化损伤中的作用及槲皮素、桂皮醛、水蛭素和单体组合对其影响的研究》文中研究说明[研究目的]从细胞及分子水平,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用。[研究方法]1.采用改良消化复合植块法培养雪旺细胞(Schwann cells, SCs), S-100免疫荧光染色法鉴定细胞纯度,并比较改良消化复合植块法与经典植块法、普通消化复合植块法获取SCs数量和纯度。2.分别采用CCK-8法和Hoechst染色法检测50 mmol/L (mM)、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM高糖培养24h、48h、72h、96h对SCs增殖和凋亡的影响。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养24h、 48h、72h、96h对SCs P0、p-ERK、ERK蛋白表达和P0、Krox-20、MAG mRNA表达的影响。3.槲皮素(Q,高中低浓度)、水蛭素(H)、桂皮醛(C)、槲皮素+水蛭素组合(QH)、槲皮素+桂皮醛组合(QC)、水蛭素+桂皮醛组合(HC)、槲皮素+水蛭素+桂皮醛组合(QHC)和10μM ERK通路抑制剂U0126分别干预50 mM高糖培养的SCs72h, CCK-8法检测增殖率,免疫荧光染色法检测periaxin表达,Western Blot检测P0、p-ERK、ERK、p-c-Jun、c-Jun、NICD的蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测P0、Krox-20、MAG、Notch1、Jagged1 mRNA表达,ELISA法检测CNTF的分泌水平。4.采用混合酶分步消化法培养背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron, DRGn), MAP-2免疫荧光染色鉴定DRGn纯度。将纯化后的SCs接种在DRGn上,建立共培养体系。采用MBP免疫荧光染色检测髓鞘形成。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养DRGn/SCs共培养体系3d、5d、7d对MBP、MAG、p-ERK、ERK蛋白表达和MBP、MAG mRNA表达的影响。5.Q(高中低浓度)、H、C、QH、QC、HC、QHC和U0126分别干预50 mM高糖培养的DRGn/SCs共培养体系7d, MBP免疫荧光染色检测髓鞘节段的数目和长度,MAG与p-ERK免疫荧光双染检测共培养体系中SCs p-ERK的表达,Western Blot检测p-ERK、ERK、MBP和MAG蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测MBP和MAG mRNA表达。[研究结果]一、改良消化复合植块法可提高获取SCs的数量和纯度改良消化复合植块法获取的细胞数量和纯度均较普通消化复合植块法和经典植块法显着提高(P<0.01)。二、不同高糖培养条件对SCs的损伤作用72h时,与CON组比较,50mM-150mM HG组细胞增殖率均明显降低,细胞凋亡率均显着增加(p<0.01),SCs的增殖率与葡萄糖浓度呈负相关(P<0.01),凋亡率与葡萄糖浓度呈正相关(P<0.01)。72h时,与CON组比较,50mM HG PO蛋白表达及P0、Krox-20和MAG mRNA均显着降低(P<0.01), ERK蛋白磷酸化水平显着升高(P<0.01)。叁、槲皮素可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与CON组相比,HG组细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显着降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着升高(P<0.01); SCs增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与CON组相比,HG组P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均显着降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组SCs的P0蛋白和P0、Krox-20、 MAG mRNA表达均显着升高(P<0.01)；P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01或P<0.05)。3.槲皮素可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与CON组相比,HG组SCs的ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均显着升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均与槲皮素的剂量呈负相关(P<0.01)。四、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与HG组相比,各干预组的细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均升高,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着降低(P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,Q3和C3组CNTF分泌水平均显着降低(P<0.01),C3组periaxin阳性细胞比例显着降低(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显着降低(p<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平显着降低(P<0.01)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组P0蛋白和P0、Krox-20、MAG mRNA表达均升高,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均降低,差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,C3组显着降低(P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显着降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组显着降低(p<0.01)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均降低,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QC、QH、HC组及Q3、H3、C3组均升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01),与QC组相比,Q3组和C3组c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged mRNA均明显升高,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05)。五、DRGn/SCs体外共培养可建立周围神经髓鞘化模型MAP-2免疫荧光染色鉴定,DRGn细胞纯度达97.39±0.09%,MBP免疫荧光染色显示DRGn/SCs共培养体系可在体外形成髓鞘节段。六、高糖不同时间点对DRGn/SCs共培养体系的影响7d时,与CON组相比,50mM HG组MBP和MAG蛋白及mRNA表达显着下降,ERK磷酸化水平显着增强(p<0.01)。七、槲皮素可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与CON组相比,HG组的髓鞘节段数目和长度显着减少(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着增加(P<0.01)；髓鞘节段数目和长度与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和]mRNA表达的下调与CON组相比,HG组MBP和MAG蛋白及nRNA表达均显着降低(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着升高(P<0.01); MBP和MAG蛋白及mRNA表达与槲皮素的剂量均呈正相关(P<0.01)。3.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与CON组相比,HG组的ERK蛋白磷酸化水平和p-ERK表达显着升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显着降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平p-ERK表达与槲皮素的剂量负相关(P<0.01)。八、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与HG组相比,各药物干预组髓鞘节段数目和长度均增多,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QK、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着减少(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3和H3组均明显减少(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3组和C3组明显减少(P<0.05或P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显着减少(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组均明显减少(P<0.05)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均升高,差异显着(p<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着降低(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与HC组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均显着降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05),与H3组相比,C3组MBP和MAG mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均降低,差异显着(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显着升高(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和C3组p-ERK表达明显增加(p<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01),与QC组相比,C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均显着升高(P<0.01),与HC组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平显着升高(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达显着升高(P<0.01)。[结论]1.高糖通过诱导SCs ERK通路激活,同时活化其下游靶点SCs成髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路,抑制SCs的增殖和分化,降低CNTF的分泌水平,减少髓鞘相关蛋白P0的蛋白表达以及髓鞘调控基因P0、Krox-20和MAG mRNA表达,从而导致SCs成髓鞘损伤。2..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和叁种单体复方组能够通过抑制高糖诱导的ERK通路的激活,同时阻断其下游靶点c-Jun和Notch通路的活化,促进SCs的增殖和分化,增加CNTF的分泌水平,上调P0的蛋白表达以及P0、Krox-20和MAG mRNA表达水平,从而有效缓解高糖诱导的SCs成髓鞘的损伤。单体之间比较,槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。叁种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。3.高糖通过诱导共培养体系中SCs的ERK通路的激活,下调髓鞘相关蛋白MBP和MAG蛋白和mRNA表达,减少共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而引起DRGn/SCs共培养体系髓鞘化的损伤。4..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和叁种单体复方组均能通过抑制高糖条件下共培养体系中SCs的ERK通路的激活,提高MBP和MAG的蛋白和mRNA表达,增加共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而有效缓解高糖对共培养体系髓鞘化的损伤。槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。叁种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。[创新点]本课题分别采用高糖诱导SCs成髓鞘损伤模型和高糖诱导DRGn/SCs共培养体系髓鞘化损伤模型,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用,为DPN髓鞘损伤机制的阐明和筋脉通防治DPN提供理论基础和实验依据,经检索国内外文
张莹[5]2016年在《自然放牧与放牧补饲育肥对呼伦贝尔羔羊与呼杜杂一代羔羊脂肪与蛋白质代谢的影响》文中进行了进一步梳理本论文研究了呼伦贝尔羔羊(HL)与呼杜杂一代羔羊(HZ)在自然放牧(NG)与放牧补饲(GS)两种不同育肥方式下脂肪酸(FA)和氨基酸(AA)组成存在的差异,并从脂类和蛋白质代谢相关的血液和组织生化指标、相关基因和蛋白质表达及其与日粮组成的关系角度,探讨其存在差异的主要原因,寻找可能影响羊肉FA和AA组成的关键因素,为通过日粮对羊肉的品质和风味进行调控进而提高羊肉质量提供理论依据。采用2x2完全随机试验设计,选择体重、体型与体况接近的健康4月龄断奶HL和HZ公羔各60只,随机分成4组,每组30只。其中,因素一分为NG和GS两种育肥方式,因素二为2个品种,分别为HL和HZ。育肥试验分为育肥前期(1-30d)和育肥后期(31-60d)两个阶段。NG组在天然草场进行自然放牧(8-10月份)。GS组在自然放牧的基础上每天补饲精料补充料,补饲期分为前、后2期,共2个月。论文分6个试验,试验1比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊日粮FA与AA组成的差异。试验2和试验3比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊羊肉FA和AA含量与组成的差异,探讨了育肥方式和品种对肉羊肉品质的影响。试验4比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢有关的血液生化指标及组织酶活的变化规律,探讨了育肥方式和品种对肉羊脂肪和蛋白质代谢的影响。试验5和试验6研究了不同育肥方式对HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢相关基因和蛋白质表达的影响,进一步从基因转录、蛋白翻译、Wnt信号通路和mTOR信号通路探讨了其可能的影响机理。在本试验条件下初步得出以下结果：从日粮FA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮SFA含量及其进食量较高,其中主要是C16：0和C18：0,其次是C17:0;MUFA含量及其进食量较高,主要是C18：1c9,其次是C15:1;ω-6PUFA含量及其进食量较高,主要是C18：2c6,其次是C18:2t6;NG组日粮co-3PUFA含量及其进食量较高,主要是C18：3n3,其次是C20：5n3。从日粮AA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮EAA含量及其进食量较高,其中主要是Leu,其次是Phe和Lys；NEAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Asp；BCAA含量及其进食量较高,主要是Leu,其次是Ile和Val;FAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Leu和Arg；DAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Met和Asp；LAA含量及其进食量较高,主要是Met,其次是Lys。与NG组相比,GS组多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,其中主要是C18：0,其次是C14：0和C24:0;MUFA含量较高,主要是C18：1c9,其次是C17:1;ω-6PUFA含量较高,主要是C18：2n-6c,其次是C18:3n-6;NG组肌肉和脂肪组织中co-3PUFA含量较高,主要是C18：3n-3,其次是C20:5n-3。HZ羔羊多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,主要是C16：0和C18：0,其次是C24:0;MUFA含量较高,主要是C18:ln-9c。与GS组相比,NG组血浆和肌肉组织中EAA、NEAA和BCAA含量升高；与HL相比,HZ血浆和肌肉组织中EAA、NEAA、TAA、FAA、LAA和DAA含量均有升高的趋势。与GS组相比,NG组血清中与脂肪和蛋白质分解相关的T3/T4、GH、Leptin和TNFa含量显着升高,血清中TP、TG和LDL-C含量显着降低,血清和组织中与FA分解相关的HSL酶活及与蛋白质代谢相关的BCAT2和BCKD酶活显着升高；血清中与脂肪和蛋白质合成相关的INS含量显着降低,血清和组织中与FA合成相关的FAS和ACC酶活显着降低。与HL相比,HZ血清中T3/T4、PG、NEFA含量和HSL酶活显着降低,但IGF-1、TG、HDL-C含量和ACC酶活显着升高。GS组肌肉、脂肪和肝脏组织中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于NG组,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组；HZ中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于HL羔羊,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组。与GS组相比,NG组Wnt信号通路中PPARγ mRNA表达量显着升高,但β-catenin mRNA表达量呈现相反的规律。与HZ相比,HL中PPARy和C/EBPα mRNA表达量显着降低,但β-catenin mRNA表达量显着升高。Wnt信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。与GS组相比,NG组与蛋白质合成正相关的mTORC1, S6K1和eIF-4G mRNA表达量显着降低,与蛋白质合成负相关的4EB-P1mKNA表达量显着升高；与HL相比,HZ组织中mTORCl、S6K1和eIF-4G mRNA表达量显着升高,而4E-BP1mRNA表达量显着降低。mTOR信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。综合上述研究结果得出,从脂肪酸营养角度分析,NG组肌肉和脂肪组织的肉品质优于GS组,HL肌肉和脂肪组织的肉品质优于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的FA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮PUFA含量降低,提高了组织中与FA从头合成相关的FAS, ACC和PPARy mRNA表达量,进而提高了从头合成酶ACC、FAS及SCD的活性及血清中INS和IGF-1含量,导致体组织中SFA和MUFA含量的增加；日粮中C18：2n6和C18：3n-3含量是导致体组织相应FA差异的主要原因,进而引起肉品质发生改变。从蛋白质营养角度分析,NG组肌肉的蛋白质营养价值低于GS组,HL肌肉的蛋白质营养价值低于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的AA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮中Leu含量较高,提高了血清中INS和IGF-1含量,激活了mTOR信号通路,提高了mTORCl、S6K1、4EB-P1 mRNA及其磷酸化蛋白的表达量,进而促进了蛋白质合成；降低了BCAT1和BCKD酶活,提高了肌肉中BCAA的含量,进而导致肌肉的营养价值发生变化。
郭秋均[6]2017年在《西黄丸抑制胃癌细胞增殖及其血管生成拟态形成的机制探讨》文中提出背景:我国是胃癌高发国家,胃癌发病率和致死率均位居我国肿瘤发病和死亡率前列,血管生成拟态是近年来新发现的血管生成形式,与胃癌的不良预后密切相关,而乏氧微环境是促进肿瘤血管生成拟态形成的主要因素之一,且与瘀毒互结证关系密切。抗癌名方西黄丸具有活血解毒功效并对多种肿瘤具有抑制作用,我们推测,具有解毒活血功效的西黄丸抑制肿瘤的可能机制是通过调控乏氧微环境进而抑制肿瘤血管生成拟态来实现的。目的:明确西黄丸调控乏氧微环境进而抑制肿瘤血管生成拟态形成的相关机制,探索西黄丸抗肿瘤的内在靶标,丰富活血解毒法治疗肿瘤的内涵。方法:(1)实验分组:空白组、西黄丸组、HIF-1α抑制剂(2-ME)组、结合组;(2)体外采用人胃癌MGC-803细胞系,CCK-8法检测西黄丸对肿瘤细胞增殖的抑制作用,AV-PI法检测西黄丸对肿瘤细胞凋亡的影响,RNA酶法检测西黄丸对肿瘤细胞周期的影响,体内实验采用Balb/c裸鼠建立MGC-803移植瘤模型,观察和测量西黄丸对裸鼠移植瘤肿瘤体积和质量的影响;(3)使用低氧工作站建立乏氧细胞培养模型、通过叁维培养建立体外肿瘤细胞拟态血管模型,体外实验通过显微镜下管道计数、体内实验通过PAS-CD31免疫化学-免疫组化双染色法计算各组管道形成数目。(4)体内实验采用 RT-qPCR、Western-blot,体外实验采用 RT-qPCR、Western-blot、IHC法检测血管生成拟态相关蛋白VE-Cadherin、EphA2、MMP-2蛋白及mRNA表达、p-EphA2蛋白表达、HIF-1α、Twist1蛋白及mRNA表达情况。(5)HTA2.0芯片筛选西黄丸抗肿瘤和调控乏氧通路相关基因,并进行RT-qPCR验证。结果:(1)西黄丸可以抑制MGC-803细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性,IC50:24h为50.424μg/ml,48h为35.129μg/ml,72h为28.191μg/ml,并抑制裸鼠移植瘤肿瘤的生长。同时,西黄丸可以促进MGC-803细胞凋亡,并将其细胞周期阻滞在G0/G1期。(2)建立体外和体内MGC-803细胞拟态管道形成模型,西黄丸可以显着抑制体外乏氧条件下和体内MGC-803拟态管道的形成,与2-ME的抑制作用相近,结合组对拟态管道形成的抑制作用最强。(3)西黄丸、2-ME、结合组可以降低体内和体外VE-Cadherin、MMP-2的mRNA表达,可以降低体内和体外VE-Cadherin、MMP-2的蛋白表达及p-EphA2的表达,结合组可以更显着的降低如上蛋白的mRNA和蛋白的表达。结合组可以降低EphA2的mRNA的表达,但不能显着影响其蛋白的表达;西黄丸、2-ME、结合组对EphA2蛋白和mRNA的表达没有显着影响。西黄丸、2-ME、结合组可以降低体外HIF-1α的mRNA和蛋白表达,降低Twist1的mRNA表达;在体内降低HIF-1α和Twist1的mRNA及蛋白表达。(4)HTA2.0基因芯片筛选西黄丸可能的作用通路靶点,发现西黄丸可以显着下调628个基因表达,上调88个基因表达。显着下调9个lncRNA表达,上调11个lncRNA表达,并对54条信号通路具有显着影响。结合前述研究结果选取乏氧信号通路和细胞周期信号通路进行验证,发现西黄丸可以降低HIF-1α上有蛋白mTOR表达,促进翻译后修饰蛋白PHD2、VHL蛋白基因表达,降低细胞周期相关蛋白(SMC3、CDC25c、CDC6、MCM3)基因的表达水平。结论:西黄丸可以通过(1)抑制乏氧相关mTOR-HIF-1α-Twistl信号通路,(2)促进乏氧相关蛋白PHD2、VHL表达,(3)抑制血管生成拟态相关蛋白VE-Cadherin、MMP-2表达及EphA2蛋白磷酸化,(4)抑制SMC3、CDC25c、CDC6、MCM3等细胞周期相关基因表达从而抑制人胃癌MGC-803细胞增殖及血管生成拟态形成的。
侯晓艳[7]2017年在《MicroRNA-27a在糖尿病肾病肾小管间质纤维化中的作用及机制研究》文中研究表明近年许多研究揭示了 microRNA(miRNA,微小RNA)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)进展中的重要作用。已经证实miR-27a在DN表达上调,但其调节肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)的具体机制尚不清楚。本研究拟通过细胞实验、动物实验及DN患者研究探讨miR-27a/PPARγ轴在其中的作用及可能的分子机制,为肾纤维化的防治措施提供新的依据和途径。第一章高糖条件下NRK-52E细胞miR-27a表达的变化及对纤维化的影响[目的]观察高糖条件下NRK-52E细胞miR-27a表达的变化及对纤维化的影响。[方法]将NRK-52E分Mannitol、NG、HG叁组,分别用含甘露醇30mmol/L和含糖5mmol/L、30mmol/L的DMEM/F12完全培养基培养。qRT-PCR法检测各组在不同时间点(12、36和72h)及含糖组在不同糖浓度(5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L)时miR-27a、PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、ColⅠ 的mRNA,Western blot检测其蛋白表达,荧光素酶报告基因检测PPARγ-3'UTR的荧光素酶活性。[结果]HG组miR-27a及TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ 表达上调,PPARy表达下调,且为miR-27a的直接靶基因。[结论]高糖增加miR-27a表达,后者通过抑制PPARy而诱导NRK-52E纤维化。第二章上调或下调表达miR-27a对高糖条件下NRK-52E纤维化的影响[目的]探讨上调或下调表达miR-27a对高糖条件下NRK-52E细胞纤维化的影响。[方法]以HG组NRK-52E为研究对象,应用脂质体转染技术将外源性miR-27a抑制剂(miR-27ai)、miR-27a 类似物(miR-27am)、PPARy siRNA 及相应对照物瞬时转染NEK-52E,PPARγ激动剂罗格列酮(Rosi.)及对照物预处理细胞,将其分九组:(1)miR-27ai和相应对照组(miR-iNC);(2)miR-27am和相应对照组(miR-NC);(3)PPARysiRNA 和相应对照组(NTsiRNA);(4)Rosi.和相应对照组(DMSO);(5)PPARy siRNA+miR-27ai 组。qRT-PCR、Western blot 和间接细胞免疫荧光检测 PPARγ、TGF-β1、Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ的mRNA和蛋白表达。[结果]高糖条件下,miR-27am 下调 PPARy 表达,上调 TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、ColⅠ表达,miR-27ai则作用相反。PPARγsiRNA和miR-27ai共转染,可增加PPARy表达。[结论]PPARγ作为miR-27a的直接靶基因,通过抑制TGF-β1/Smad3通路而减轻NRK-52E纤维化。第叁章STZ糖尿病大鼠模型miR-27a表达的变化及对TIF的影响[目的]观察STZ糖尿病大鼠模型血浆和肾组织中miR-27a表达的变化及对TIF的影响。[方法]STZ糖尿病大鼠腹腔注射miR-27ai或miR-27am后分6组:(1)正常对照组(NC);(2)糖尿病造模组(DM);(3)DM_miR-27ai和相应对照组(DM_miR-iNC):(4)DM_miR-27am 和相应对照组(DM_miR-NC)。持续干预至12周后处死。qRT-PCR检测大鼠血浆及肾脏miR-27a,Western blot及免疫组化检测肾组织 PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ 的表达;Masson叁色染色观察肾组织病理改变。大鼠Scr、BUN、尿NAG、UAER,UACR、Ccr等肾损害相关指标均被分析。[结果]STZ大鼠血浆及肾组织miR-27a表达上调,抑制miR-27a能上调PPARy,减轻TIF及降低肾损害相关指标。激活miR-27a则结果相反。[结论]miR-27a/PPARγ轴通过激活TGF-β1/Smad3信号启动STZ糖尿病大鼠TIF进程。第四章DN患者血浆miR-27a表达的变化及对TIF的影响[目的]观察DN患者血浆miR-27a表达的变化及对TIF的影响。[方法]选取行肾活检的DN患者52例。免疫组化分析其肾组织PPARγ、TGF-β1、p-Smad3、CTGF、FN、Col Ⅰ的表达,Masson叁色染色观察TIF的病理改变。收集DN患者及健康志愿者血标本各30例,qRT-PCR法检测其血浆miR-27a,并分析其与24h尿蛋白定量、尿NAG、Scr及eGFR等肾损害相关指标的相关性。[结果]DN患者血浆miR-27a表达上调,且与Scr、24h尿蛋白定量及尿NAG呈正相关,与eGFR呈负相关。伴随TIF的加重,PPARγ表达下调。[结论]DN患者血浆miR-27a升高反应肾功能恶化及TIF加重,其机制可能是通过PPARγ诱导的TGF-β1/Smad3通路的激活。
燕凤[8]2008年在《绵羊CAPN1、CAST基因mRNA的发育性表达规律及其对肉品质的影响》文中指出钙蛋白酶系统是一种存在于细胞质内需要钙离子激活的内源性蛋白水解酶类,与肉的嫩度和风味等食用品质密切相关。本实验通过研究绵羊肌肉中钙激活中性蛋白酶(μ-calpain,CAPN1)基因及钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因mRNA的发育性规律及其对宰后72h不同绵羊品种肉品质(剪切力﹑失水率﹑肉色﹑大理石纹和pH)的影响,旨在为深入研究钙蛋白酶系统对绵羊肉品质的改善提供遗传理论依据。本试验选取80、120、160、和200日龄的雄性滩羊33只﹑蒙古羊31只和小尾寒羊34只,屠宰后取背最长肌测定宰后72h的剪切力﹑失水率﹑大理石纹和pH值,同时每个品种随机抽取3只绵羊的背最长肌,用于半定量PT-PCR法检测CAPN1基因和CAST基因mRNA表达水平的发育性变化,分析其随绵羊日龄变化的规律及其与绵羊肉质性状的关系。结果表明:1) CAPN1基因的mRNA表达水平和CAST基因与CAPN1基因mRNA表达水平的比值都随着日龄的增加而增大,而CAST基因mRNA表达水平随着日龄的增加而减小。CAPN1基因和CAST基因mRNA表达水平在不同日龄间差异显着( p<0.05)。CAPN1基因和CAST基因mRNA表达水平在不同品种间的表达量不同,但品种间的差异不显着( p>0.05)。2)绵羊背最长肌的剪切力随着日龄的增加而增大,大理石纹和失水率却随着日龄的增加而减小。绵羊背最长肌的肉色亮度L值呈“上升-上升-下降”的趋势,pH在滩羊和小尾寒羊中呈“上升-下降-上升”的趋势,而蒙古羊的pH随日龄的增大而减小。绵羊间背最长肌的肉质性状指标:失水率﹑肉色﹑大理石纹和pH在相同日龄不同品种间和相同品种不同日龄间均差异显着( p<0.05)。而剪切力在日龄间差异不显着(p>0.05),在品种间差异显着( p<0.05)。3)在整体上,绵羊背最长肌的剪切力与失水率呈强负相关(r =-0.535, p = 0.001),剪切力与pH负相关(r =-0.214, p= 0.035),而剪切力与肉色L值是正的强相关(r =0.272, p= 0.007)。失水率和肉色L值是负的强相关(r=-0.291, p= 0.004),而失水率和大理石纹是正的强相关(r =0.359, p= 0.000),失水率与pH也是弱的正相关(r =0.201, p= 0.047)。4)CAPN1基因mRNA表达和剪切力是负相关( r = -0.355, p=0.034)。但CAST基因mRNA表达和剪切力是正相关(r =0.372, p= 0.026);CAPN1基因mRNA表达和失水率不相关(p>0.05),而CAST基因mRNA表达和失水率呈强负相关(r =-0.427, p= 0.009);CAPN1基因mRNA表达和大理石纹是正相关(r =0.351, p = 0.036),而CAST基因mRNA表达和和大理石纹呈强负相关(r =-0.548, p = 0.001)。CAST基因和CAPN1基因mRNA表达的比值与剪切力呈强正相关(r =0.372, p = 0.026)。CAST基因和CAPN1基因mRNA表达的比值与失水率呈强负相关(r=-0.495, p=0.002),与大理石纹也呈强负相关(r=?0.475, p= 0.003)。CAPN1基因mRNA表达水平与肉色亮度值是负相关(r =?0.389, p= 0.019),而CAST基因mRNA表达水平及两基因比值与肉色亮度值都不相关( p>0.05)。CAPN1基因﹑CAST基因mRNA表达水平及两基因比值与pH均不相关( p>0.05)。综上可知,绵羊CAPN1基因mRNA水平都随日龄的增加而下降,绵羊CAST基因mRNA水平随日龄的增加而增加。蒙古羊的CAPN1基因mRNA表达水平在叁个品种中最高,而蒙古羊的CAST基因mRNA表达水平在叁个品种中最低。滩羊﹑蒙古羊和小尾寒羊背最长肌的肉质性状发育性变化规律基本相同。蒙古羊的肉嫩度﹑多汁性﹑肉色亮度及风味在叁个品种中最优,而滩羊的肉嫩度及风味最差。小尾寒羊的肉色亮度在叁个品种中最低。大理石纹﹑失水率和pH对肉嫩度都是正效应,并且失水率对肉嫩度的影响最大,而肉色对肉嫩度是较低的负效应。因此,CAPN1基因对绵羊的肉嫩度﹑肉色和大理石纹可能起正调控作用。CAST基因mRNA表达水平和CAST基因与CAPN1基因mRNA表达的比值对绵羊的肉嫩度﹑多汁性及大理石纹起负调控作用。CAST基因与CAPN1基因mRNA表达的比值对绵羊肉嫩度的调控作用最明显。
朱昱哲[9]2013年在《高含量DHA/EPA甘油叁酯调节脂质代谢和改善胰岛素抵抗作用的研究》文中认为鱼油富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，具有调节血脂、改善糖代谢、提高免疫力、补脑健脑等功能。目前，市场上的DHA/EPA产品主要有甘油酯型和乙酯型两种。乙酯型鱼油EPA和DHA含量较高，但消化吸收困难，还可能存在安全隐患。甘油酯型是鱼油的天然存在形式，但DHA/EPA相对含量较低(多在30%以下)。高含量DHA/EPA甘油叁酯型鱼油(DHA/EPA-TG)已成为国际功能食品市场的主流产品，但我国该类产品的生产技术落后。本实验室采用酶法催化转化技术制备了高含量DHA/EPA甘油叁酯型鱼油，其中DHA和EPA总含量为55%，甘油叁酯含量为70%。本论文以该高含量DHA/EPA甘油叁酯型鱼油为研究对象，利用模型动物探究了其对脂质代谢的调节作用，并探讨其分子机制。通过饲喂添加1%乳清酸的饲料建立脂肪肝大鼠模型，研究了其对脂肪肝大鼠脂质代谢的调节作用。结果表明，高含量DHA/EPA甘油叁酯能显着降低脂肪肝大鼠血脂和肝脂水平，增加粪便脂质排泄。以高含量DHA/EPA甘油叁酯干预20d后，脂肪肝大鼠血清TC含量显着降低；肝脏TC和TG含量显着下降，肝脏脂肪酸组成有效改善；粪便总脂质和TC含量明显增加。提示，高含量DHA/EPA甘油叁酯对脂肪肝大鼠的脂质代谢具有较好的调控作用。进一步从脂肪酸合成和β-氧化两方面研究了高含量DHA/EPA甘油叁酯改善脂质代谢的分子作用机制。RT-PCR检测结果显示，摄食高含量DHA/EPA甘油叁酯后，SREBP-1c及FSA、ME、G6PDH等脂质合成相关基因的mRNA的表达量显着下调；PPAR-α和CPT-1等脂质分解相关基因的mRNA的表达量显着上调。酶活力检测结果显示，高含量DHA/EPA甘油叁酯可显着抑制FAS和ME等脂肪酸从头合成过程中的关键限速酶活力；促进CPT-1和POE等脂肪酸分解过程的关键限速酶活力。以上结果表明，高含量DHA/EPA甘油叁酯通过抑制脂肪合成，促进脂肪氧化分解，有效调节脂肪肝大鼠的脂质代谢。采用饲喂高脂高糖饲料法建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究了高含量DHA/EPA甘油叁酯对胰岛素抵抗的改善作用。结果表明，高含量DHA/EPA甘油叁酯能显着降低模型小鼠的空腹血糖值，提高葡萄糖耐量水平，降低空腹血清胰岛素和胰岛素抵抗指数，增加肌糖原和肝糖原的合成，有良好的降低血糖和改善胰岛素抵抗的作用。高含量DHA/EPA甘油叁酯能明显减少糖尿病小鼠血清和肝脏脂质积累，显着改善肝脏的脂肪酸组成，提高DHA和EPA在肝脏总脂肪酸中的比例。采用RT-PCR法研究了高含量DHA/EPA甘油叁酯改善小鼠胰岛素抵抗的作用机制。结果表明，高含量DHA/EPA甘油叁酯能显着提高肝脏和肌肉组织中IR、IRS、PI3K、PKB mRNA的表达，明显抑制GSK-3βmRNA表达，显着上调肌肉和脂肪组织中GLUT-4mRNA的表达。提示高含量DHA/EPA甘油叁酯能明显上调胰岛素介导的PI3K/PKB信号转导通路，促进葡萄糖转运，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。综上所述，高含量DHA/EPA甘油叁酯能有效调节脂肪肝大鼠的脂质代谢，显着改善模型小鼠的胰岛素抵抗，且较普通甘油叁酯型鱼油和乙酯型鱼油呈现更好的生理活性。研究结果为打破国外高端鱼油产品的技术垄断和产品垄断，极大提高我国鱼油产品的国际竞争力提供了理论依据。
张姣姣, 王怡, 张会琼, 孙思, 孙燕[10]2013年在《FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的影响》文中进行了进一步梳理【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测cyclinD1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH(0—100 ng.mL-1)均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在FSH浓度为50 ng.mL-1时两种基因的表达量最大(P<0.05);FSH(50 ng.mL-1)也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在作用30 min时其表达量达到高峰(P<0.05)。不同浓度的Foskolin(0—20μmol.L-1)均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP(0—40μmol.L-1)、H-89(0—30μmol.L-1)和Verapamil(0—100μg.mL-1)以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果(P<0.05),但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126(0—10μmol.L-1)降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显着差异(P>0.05)。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclinE1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。
参考文献：
[1]. 湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究[D]. 乔永. 南京农业大学. 2007
[2]. “逆针灸”对更年期大鼠热休克蛋白及应激相关机制影响的研究[D]. 郑玲. 北京中医药大学. 2007
[3]. 羟基红花黄色素A促大鼠局灶性脑缺血后血管新生作用的分子基础初探[D]. 曹水娟. 中国协和医科大学. 2007
[4]. ERK信号通路在高糖诱导的髓鞘化损伤中的作用及槲皮素、桂皮醛、水蛭素和单体组合对其影响的研究[D]. 刘頔. 北京协和医学院. 2016
[5]. 自然放牧与放牧补饲育肥对呼伦贝尔羔羊与呼杜杂一代羔羊脂肪与蛋白质代谢的影响[D]. 张莹. 内蒙古农业大学. 2016
[6]. 西黄丸抑制胃癌细胞增殖及其血管生成拟态形成的机制探讨[D]. 郭秋均. 北京中医药大学. 2017
[7]. MicroRNA-27a在糖尿病肾病肾小管间质纤维化中的作用及机制研究[D]. 侯晓艳. 南方医科大学. 2017
[8]. 绵羊CAPN1、CAST基因mRNA的发育性表达规律及其对肉品质的影响[D]. 燕凤. 西北农林科技大学. 2008
[9]. 高含量DHA/EPA甘油叁酯调节脂质代谢和改善胰岛素抵抗作用的研究[D]. 朱昱哲. 中国海洋大学. 2013
[10]. FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的影响[J]. 张姣姣, 王怡, 张会琼, 孙思, 孙燕. 中国农业科学. 2013
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